Спосіб експресної оцінки ефективності щеплення

Реферат: Спосіб експресної оцінки ефективності щеплення передбачає дослідження стану імунореактивності в індуктивній фазі імуногенезу після вакцинації імунофлуоресцентним методом. UA 71014 U (54) СПОСІБ ЕКСПРЕСНОЇ ОЦІНКИ ЕФЕКТИВНОСТІ ЩЕПЛЕННЯ UA 71014 U UA 71014 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до імунології та вакцинології, зокрема є способом оцінки ефективності щеплення. Стандартним методом оцінки ефективності щеплення є визначення рівня сироваткових антитіл, специфічних по відношенню до вакцинного антигену. Достовірне зростання цього рівня, в більшості випадків, спостерігається через місяць після вакцинації; тривалість та напруженість імунітету можна оцінити через 6-12 місяців. Відповідно, факт недостатньої ефективності вакцинації, що засвідчується при відсутності захисного титру антитіл, встановлюється в досить віддалені терміни. Найближчим аналогом є спосіб експресної оцінки ефективності імунізації [1], в якому за рахунок використання методів лінійного регресійного аналізу динаміки імуногормональних взаємодій, забезпечується можливість розрахунку очікуваного рівня антитілогенезу за результатами дослідження сироваткових рівнів гормональних показників в індуктивній та/або на початку продуктивної фази імуногенезу. До суттєвих ознак цього способу, що збігаються з ознаками корисної моделі, яка заявляється, належать терміни проведення дослідження (індуктивна фаза імуногенезу), а також використання показників, що відображують певні тенденції в процесі формування специфічної імунної відповіді та, відповідно, мають певний рівень прогностичного значення. До причин, що заважають отриманню бажаного технічного результату, при використанні найближчого аналога належить низький рівень придатності цього способу в клінічних умовах (досліджуваний масив даних, на основі якого розроблено алгоритм розрахунку очікуваного рівня антитілогенезу, отримано на лабораторних тваринах та потребує певної адаптації). Крім того застосування способу передбачає визначення різних сироваткових показників в різні терміни і при цьому дозволяє отримати лише короткочасний прогноз (на 7-14 добу після проведення дослідження). В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб оцінки ефективності щеплення, в якому за рахунок використання ранніх прогностично значущих маркерів імуногенності забезпечується отримання інформації стосовно очікуваної тривалості та напруженості поствакцинального імунітету. Для вирішення поставленої задачі проведено комплексне імунологічне обстеження кількох групп пацієнтів, імунізованих різними вакцинними препаратами: "Інфлувак", стафілококова вакцина, АДП та корова вакцина. За характером індивідуальної реакції на щеплення, пацієнти кожної групи розподілено на 3 категорії: І - пацієнти, у яких вакцинація не була ефективною (титри антитіл через 6 місяців після імунізації були нижче захисних (50 % клітин інтенсивність флюоресценції 0,41-0,60 в.о), ** - середня (у >50 % клітин інтенсивність флюоресценції 0,21-0,40 в.о), * - низька (у >50 % клітин інтенсивність флюоресценції 0,05-0,20 в.о). Контроль: група (n=40) здорових невакцинованих осіб 25-43 років. 10 15 На 21 добу після вакцинації у пацієнтів цієї категорії у всіх дослідних групах інтенсивність флюоресценції >50 % клітин знаходилась у межах 0,05-0,20 в.о., в той час як у пацієнтів II категорії аналогічний рівень цього показника спостерігався лише в групі, що отримувала Інфлувак. За відсотком клітин, що експресують TLR2 у всіх групах та категоріях пацієнтів відзначено зростання на 14-21 добу спостереження, однак в І категорії це зростання не перевищувало 50 %, в той час як в межах II категорії показник, нижчий за 50 % (49,9±5,3) спостерігався тільки 2 UA 71014 U 5 10 15 20 25 на 21 добу в групі, що отримувала Інфлувак. Таким чином, максимальну прогностичну цінність має показник рівня експресії TLR2 на 14 добу після вакцинації. Показник інтенсивності флуоресценції в цей термін може бути використаний як додатковий критерій з певними обмеженнями - при оцінці ефективності вакцинації інфлуваком, та, імовірно, іншими протигрипозними вакцинами, його застосування недоцільно. Таким чином, до суттєвих ознак корисної моделі, що заявляють, належить проведення дослідження рівня експресії TLR2 популяцією моноцитів периферійної крові з фенотипом + + CD14 CD16 на 14 добу після вакцинації; застосування як дискримінативного критерію 50 % рівня TLR2 позитивних клітин; застосування в окремих варіантах здійснення корисної моделі показника, що відображує щільність експресії. Крім того, масив даних, за результатами аналізу яких встановлено граничні значення, використані при розробці способу, що заявляється, отримано з використанням імунофлуоресцентного методу. У зв'язку з цим, незважаючи на можливість визначення ступеня експресії досліджуваних поверхневих структур і іншими способами, застосування імунофлуоресцентного аналізу слід вважати суттєвою ознакою, необхідною при всіх варіантах здійснення корисної моделі. Спосіб здійснюється наступним чином: На 14 добу після вакцинації проводиться дослідження експресії TLR2 популяцією моноцитів + + периферійної крові з фенотипом CD14 CD16 методом проточної цитофлуориметрії з використанням мічених флуоресцентними барвниками моноклональних антитіл до досліджуваних поверхневих структур (стисло методику викладено в прикладі 2). + + За умови, якщо серед CD14 CD16 моноцитів відсоток TLR2-позитивних клітин не перевищує 50, робиться висновок про високу імовірність недостатньої ефективності вакцинації. як додатковий критерій можливо використання показника інтенсивності флюоресценції: низька + + ефективність вакцинації прогнозується у випадку, коли у >50 % TLR2 позитивних CD14 CD16 клітин інтенсивність флюоресценції не перевищує 0,40 в.о. Приклад 1. Розподіл індивідуальної реактивності в групі 20-22 річних молодих людей після імунізації стафілококовою вакциною Таблиця 2 Титри антистафілококових AT (МО/мл) протягом року після вакцинації Щеплені (групи) 1 2 3 N=50 До імунізації 6 чоловік 40 чоловік 4 людини 0,57±0,06 0,75±0,08 0,83±0,08 Терміни після імунізації 1 міс. 6 міс. 12 міс. 2,3±0,3 1,9±0,2 0,70±0,08 7,4±0,8 5,1±0,6 1,2±0,1 13,1±1,4 10,6±1,1 1,6±0,2 30 35 40 45 50 Приклад 2. + + Експресію TLR2 на популяції CD14 CD16 моноцитів периферійної крові визначали методом проточної цитофлуориметрії з використанням FITC-кон'югованих анти-СD14, Alexa Fluor 647мічені анти-CD16 антитіла (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) та РЕ-мічені анти-TLR2 антитіла (е-Biosciences, San Diego, CA, USA). До 100 мл цільної крові додавали по 10 мл анти-СD14, анти-CD16 та анти-TLR2 або ізотопконтрольні антитіла, інкубували 15 хвилин при кімнатній температурі в темряві, додавали 2 мл FACS лізуючого розчину (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) для лізису еритроцитів, витримували 15 хвилин, відмивали двічі у фосфатно-сольовому буфері, після чого клітини ресуспендували в 0,5 мл 1 % параформальдегіду та аналізували на проточному + + цитофлуориметрі FACSCalibur. Визначали відсоток TLR2-позитивних CD14 CD16 моноцитів та середню інтенсивність флуоресценції. ПЕРЕЛІК ПОСИЛАНЬ 1. Патент: 39026 (UA) МПК: А61В 10/00 (2006.01), G01N 33/50 (2006.01) Спосіб експресної оцінки ефективності імунізації/ Волянський Андрій Юрійович; Симиренко Людмила Львівна; Кучма Ірина Юріївна; Цейтлін Натан Абрамович; Крестецька Світлана Леонідівна; власник ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА АМН УКРАЇНИ" (UA).-3. № U200809004; дата подання 09.07.2008, опубліковано 26.01.2009, бюл. № 2/2009 2. Ravetch J.V. IGG FC receptors/ Jeffrey V. Ravetch, Silvia Bolland// Annual Review of Immunology. - Vol. 19. - P. 275-290. - DOI: 10.1146/annurev. immunol. 19.1.275 3 UA 71014 U 5 3. Ziegler-Heitbrock L. The CD 14+CD 16+blood monocytes: their role in infection and inflammation. / L. Ziegler-Heitbrock /Я Leukoc Biol.-2007. - V 81. - N 3. - P. 584-592. - doi: 10.1189/jlb.0806510 4. Iwahashi M. Expression of Toll-like receptor 2 on CD 16+blood monocytes and synovial tissue macrophages in rheumatoid arthritis./ M. Iwahashi, M. Yamamura, T. Aita, A. Okamoto, A. Ueno, N. Ogawa, S. Akashi, K. Miyake, P.J. Godowski, H.Makino //Arthritis Rheum.-2004. - V 50. - N 5. - P. 1457-1467. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 1. Спосіб експресної оцінки ефективності щеплення, що передбачає дослідження стану імунореактивності в індуктивній фазі імуногенезу, який відрізняється тим, що на 14 добу після вакцинації імунофлуоресцентним методом визначають показники експресії TLR2 популяцією + + моноцитів периферичної крові з фенотипом CD14 CD16 і, якщо відсоток TLR2-позитивних клітин не перевищує 50, робиться висновок про високу імовірність недостатньої ефективності вакцинації. 2. Спосіб за п. 1, в якому додатково використовують показник інтенсивності флюоресценції: низька ефективність вакцинації прогнозується у випадку, коли у >50 % TLR2 позитивних + + CD14 CD16 клітин інтенсивність флюоресценції не перевищує 0,40 в.о. 20 Комп’ютерна верстка Л. Купенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4