Новий штам грам-позитивної спороутворюючої аеробної ґрунтової бактерії bacillus subtilis

Реферат: UA 74992 U UA 74992 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до виділення з природного середовища нового штаму грампозитивної спороутворюючої аеробної ґрунтової бактерії Bacillus Subtilis, який за складом біологічно активних речовин здатен до створення на його базі нових оригінальних лікувальнопрофілактичних препаратів для потреб медицини та ветеринарії. Корисна модель належить до мікробіології і біотехнології. Новий штам бактерій Bacillus Subtilis є антагоністом відносно штамів хвороботворних мікроорганізмів, що можуть викликати захворювання у людей і тварин. В господарстві, що спеціалізується на відгодівлі тварин, Козелецького району, Чернігівської області, із сіна було виділено мікробні клітини. Було встановлено, що вони є грам-позитивні, спороутворюючі аеробні рухливі палички з розмірами на однодобовій агаровій культурі (24)×(0,5-0,8) мкм, що утворюють центрально розташовані еліпсоїдні ендоспори на 2-3 добу росту (1-2)×0,6 мкм, при цьому клітину не роздувають. Колонії на м'ясо-пептонному агарі (МПА) сухі, бархатисті, білого кольору, округлої форми з діаметром до 0,5-0,7 см. Розщеплюють глюкозу, маніт. Не зброджують сахарозу, мальтозу, лактозу. Мікробні клітини, які були виділені із бактеріальних колоній на МПА, віднесені до грампозитивної спороутворюючої аеробної ґрунтової бактерії Bacillus Subtilis, що підтверджено в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України. Свідоцтво про первісне депонування нового штаму мікроорганізму Bacillus Subtilis (реєстраційний № IBM B-7321) отримане 6 вересня 2010 року. Доведено, що штами Bacillus subtilis зовсім не шкідливі для людини та тварин. Відсутність патогенності у штамів Bacillus subtilis дало підставу для присвоєння їм Управлінням за контролем якості продовольчих і лікувальних засобів США статусу GRAS (generally regarded as safe) - безпечних організмів (К. Харвуд, 1992). Механізми лікувальної дії мікробних культур, що отримані із Bacillus subtilis, широко вивчалися нами в експериментах на тваринах та in vitro. Лікувальний ефект визначається комплексом факторів, до яких відносять: продукування культурами Bacillus subtilis бактеріоцинів, що пригнічують ріст патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів; утворення високоактивних ферментів: протеаз, рибонуклеаз, трансаміназ та інших; продукування субстанцій, що нейтралізують бактеріальні токсини (В. В. Смірнов та ін., 1982, 1985, 1988, 1992; А. Т. Слабоспицька та ін., 1990; К. Харвуд, 1992). Антагоністична дія вищеназваних бацил здійснюється за рахунок продукування різних по походженню біологічно активних речовин: поліпептидних антибіотиків, лізоциму, літичних і протеолітичних ферментів (В. В. Смірнов і ін., 1993; Г. К. Олейнікова і ін. 1995; І. Г. Ахапкіна і ін. 1995; І. Б.Сорокулова, 1996; Kugler M. et al., 1990, LoefflerW. etal., 1990). Понад усе добре вивченим антибіотиком із Bacillus subtilis є субтилін з м.в. 3,2 кД. Він складається із трьох поліпептидів - субтилінів А, В і С. Субтілін пригнічує ріст грампозитивних бактерій - стафілококів, стрептококів, туберкульозних паличок та низку інших бактерій, а також патогенних грибів, дріжджів, амеб (В. В. Смірнов і ін., 1993; Katzer W. etal., 1990). Більшість антибіотиків, що утворюються бактеріями роду Bacillus, активні проти всіх груп мікроорганізмів, це: субтилізин, бацилін, субтенолін, бациліпіни, глобіцин та ін. Антибіотики, що утворюються Bacillus і є пептидами, мають значно меншу масу, ніж білки - від 270 Д (бацилізин) до 4500 Д (ліхеніформін). В більшості випадків штами-продуценти утворюють одночасно декілька антибіотичних речовин, які відрізняються одне від одного невеликою кількістю амінокислотних залишків. Розмножуючись, бактерії роду Bacillus subtilis виробляють ферменти протеази, які активно лізують усі непритаманні організму ссавців білки, денатуровані білки і нуклеопротеїди. При цьому знищуються бактерійні токсини, елементи пухлинних утворювань та інші дефектні клітини. Терапевтичні ферменти - протеази, пептидні антибіотики - субтилін та інші біологічно активні протеїни (БАП), є важливими активними лікувальними компонентами, що отримують із Bacillus subtilis. Доведено, що бактерії роду Bacillus subtilis, продукують позаклітинні глікопротеїни - лектини, які специфічно зв'язують полісахариди. Вони виконують функцію розпізнавання патогенних мікроорганізмів, аглютинують вірулентні штами бактерій, зупиняють ріст патогенних грибів, і тим самим являються фактором неспецифічного захисту. Задачею корисної моделі є пошук нового штаму із бактерій роду Bacillus, який має окрім антагоністичної активності проти патогенних штамів бактерій і грибів, що викликають захворювання людини і тварин, максимальною противірусною активністю, а також такого, що позитивно впливає на процеси імунокорекції організму. 1 UA 74992 U 5 10 15 20 25 30 35 В світовій практиці використовують різні штами бацилярних бактерій для створення на їх базі нових імуномоделюючих лікувальних препаратів. Відомий штам бактерій Bacillus licheniformis № 31 (Інститут мікробіології і вірусології ім. акад. Д.З. Заболотного АН України), який використовують при лікуванні гнійно-септичних післяродових захворювань як компонент препарату Біоспорин. Однак, вказаний штам не має противірусну активність (Авт. св. СРСР № 1722502, МКІ А61К 39/2, 1989 p.) Відомий бактеріальний препарат на базі штаму Bacillus Subtilis C-3102 утримує крім бактеріальної культури в сухому вигляді, також, і харчові добавки - наповнювачі для фармацевтичного препарату. Недоліком даного препарату є те, що він не володіє противірусною активністю (Заявка ЕПВ № 0287699, МКІ С12N 1/20, надр. 26.10.88 р.) Найбільш близьким аналогом препарату щодо компонентного складу біологічно активних речовин із Bacillus Subtilis є бактеріальний лікувально-профілактичний препарат, який включає композиційний склад біомаси бацилярних бактерій (Bacillus Subtilis-2 штами, та Bacillus licheniformis № 31). Суміш вказаних компонентів препарату являє собою мікробну асоціацію при об'ємному співвідношенні 1:1:1. Вміст кожного компоненту препарату 100-150 млрд. мікробних клітин в 1 мл фізрозчину. Таку рідину використовують для лікування гнійно-септичних післяродових захворювань (Авт. свід. СРСР № 1398868, МКІ А61К 35/74, надр. 1988 р.) Недоліком даного препарату є те, що він не має противірусної активності. Задачею корисної моделі є пошук нового штаму із бактерій роду Bacillus, який має крім антагоністичної активності проти патогенних штамів бактерій і грибів, що викликають захворювання людини і тварин, максимальну противірусну активність, а також такого, що позитивно впливає на процеси імунокорекції організму. Суть корисної моделі пояснюється тим, що бактерії нового штаму Bacillus Subtilis IBM В-7321 після проведення з ними додаткової спеціальної обробки мають більш широкий спектр антивірусної дії, а також виражені імуномоделюючі властивості. Доведено, що біологічно-активні компоненти нового штаму Bacillus Subtilis IBM B-732 не є пірогенними, не впливають на рівень мітотичних процесів, і не здійснюють токсичну дію на органи і тканини експериментальних тварин при тривалому застосуванні, а також мають хороший профіль безпеки і мають високі імунотропні властивості, що дозволяє віднести його до активних антивірусних препаратів. Суть винаходу доводиться такими прикладами При вивченні антивірусної активності бактерії нового штаму Bacillus Subtilis IBM B-7321 після проведення з ними додаткової спеціальної обробки було показано інгібування реплікації вірусу грипу A/FM/1/47(H1N1) in vitro. В дослідах in vivo на моделі експериментальної грипозної інфекції (профілактична і лікувальна схема) індекс ефективності склав відповідно 80,0-60,0 в порівнянні із стандартним препаратом Таміфлю - 80-70. Таблиця 1 Профілактична дія біологічно активних компонентів (БАК) нового штаму Bacillus Subtilis IBM В-7321 після спеціальної обробки при введенні мишам, інфікованим вірусом грипу Препарат, розведення БАК В. Subtilis ІВМ В-7321 1:10 БАК В. Subtilis ІВМ В-7321 1:50 Таміфлю Контроль вірусу 40 Кількість мишей 10 10 10 10 Із них загинуло всього % 2 20,0 2 20,0 2 20,0 10 100,0 КЗ IE 5,0 5,0 5,0 80,0 80,0 80,0 Як свідчать дані, наведені в табл. 1, при профілактичному застосуванні біологічно активних компонентів (БАК) нового штаму Bacillus Subtilis IBM B-7321 після спеціальної обробки у різних розведеннях до зараження вірусом грипу A/FM/1/47 (H1N1), адаптованого до легеневої тканини мишей, встановлено, що препарат в дозах 1:10 та 1:50 ефективно захищає мишей від грипозної інфекції (IE=80,0). 45 2 UA 74992 U Таблиця 2 Лікувальна дія біологічно активних компонентів БАК штаму Bacillus Subtilis IBM B-7321 після спеціальної обробки при введенні мишам, інфікованим вірусом грипу Препарат, розведення БАК В. Subtilis IBM B-7321 1:10 БАК В. Subtilis IBM B-7321 1:50 Таміфлю Контроль вірусу 5 Кількість мишей 10 10 10 10 Із них загинуло всього % 4 40,0 8 80,0 3 30,0 10 100,0 КЗ IE 2,5 1,25 3,3 60,0 20,0 77,0 При лікувальній схемі введення біологічно активних компонентів (БАК) штаму Bacillus Subtilis IBM B-7321 після спеціальної обробки встановлено, що вони ефективно захищають мишей від грипозної інфекції при розведенні 1:10, індекс ефективності при цьому дорівнює 60,0. Встановлено, що застосування біологічно-активних компонентів нового штаму Bacillus Subtilis IBM B-7321 достеменно пригнічують репродукцію ВІЛ при лікувальній і профілактичній схемі введення препарату. Таблиця 3 Вплив біологічно активних компонентів БАК штаму Bacillus Subtilis IBM B-7321 після спеціальної обробки на репродукцію ВІЛ в культурі МТ-4 Показники репродукції ВІЛ-інфекційний титр в Ig ID50 профілактика лікування 1,8