Спосіб добору в селекції соняшнику

Реферат: UA 75555 U UA 75555 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, а саме до використання ДНК-маркерів в гібридній селекції та насінництві соняшнику. Важливим напрямком сучасної селекції соняшнику (Helianthus annuus L.) є створення вихідних форм для гетерозисних гібридів. Як вихідні форми використовуються три типи ліній: лінії з цитоплазматичною чоловічою стерильністю (ЦЧС) (А), закріплювачі стерильності (Б) та відновники фертильності (В). При доборі матеріалу та створенні ліній-відновників фертильності пилку традиційно використовується метод зворотних схрещувань, який є досить тривалий і потребує значних витрат матеріалів і трудових ресурсів [1]. Аналогом є спроба диференціювати стерильні лінії та відновники фертильності пилку методом ізоферментного аналізу. За допомогою цього методу можливо диференціювати деякі лінії, але для виявлення ліній з геном Rf1 цей метод виявився неефективним [2]. Визначення відновників фертильності пилку можливо за допомогою молекулярних маркерів, які мають переваги перед іншими типами маркерів і тісно пов'язані з генами-відновниками фертильності пилку. Внаслідок найбільшої поширеності системи PET1-Rf1 найбільш актуальним є визначення саме гена Rf1. Для картування Rf1 використовуються RELP (restriction fragment length polymorphism) маркери [3]. Недоліком використання цього маркеру є складність методики та потреба у високоочищеній ДНК. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), та AELP (Amplified fragment length polymorphism) маркери [4-7] домінантні, RAPD-маркер не завжди стабільний у прояві. Простіший у застосуванні та з достатньою для гена Rf 1 розв'язувальною здатністю є SSR (simple sequence repeat) маркер [8], який знаходиться на відстані 3,7 сМ від гена Rf1 [8]. Найближчим до поданого способу є метод диференціації ліній за допомогою ізоферментного аналізу [2], в якому спробували диференціювати стерильні лінії в відновники фертильності харківської селекції та метод картування гена Rf1 за допомогою SSR маркера [8] у американських ліній. В останньому методі не описується диференціація ліній за цим маркером та не зазначаються алелі гена Rf1. Найближчим аналогом корисної моделі є методика дослідження самозапилених лінійвідновників фертильності пилку [1]. Колекцію самозапилених ліній висівають на одно-, дворядкових ділянках з метою отримання до цвітіння не менше 30-40 рослин кожної лінії. Поблизу колекції висівають джерела цитоплазматичної чоловічої стерильності (ЦЧС) по 100-200 рослин кожного (по 2-3 рослини для кожної форми, що перевіряється). Перед цвітінням ізолюють по 10-15 суцвіть кожної лінії і сумішшю цього пилку запилюють 2-3 ізольованих суцвіття кожного джерела ЦМС. Після дозрівання насіння його обмолочують, окремо кожний кошик, та в межах материнської лінії не об'єднують. В наступному році насіння F 1 висівають в 2 перевірочному розсаднику на ділянках 20-25 м (близько 50 рослин). В період цвітіння облічують стерильні та фертильні рослини. Кожну рослину необхідно оцінити хоч би два рази (на початку і в середині цвітіння) в перевірочному розсаднику. Результати підсумовують, що достатньо визначено характеризує реакцію окремих ліній на ЦЧС. В основу корисної моделі поставлено задачу оцінки батьківських інбредних ліній на наявність гена Rfb тобто визначення здатності до відновлення фертильності пилку шляхом аналізу спектрів ДНК у генотипів соняшнику у короткий термін на стадії насіння. З метою прискорення і спрощення визначення відновників фертильності пилку та диференціації їх від ліній-закріплювачів стерильності пропонується спосіб ідентифікації генотипів-носіїв гена Rf1, що є відновниками фертильності для стерильних ліній з цитоплазмою РЕТ1 та (ARG1, ARG3), (PRR1, PRH1), (RIG2), (DEB2) Rf 1, [9]. Поставлена задача вирішується за допомогою електрофорезу у 2 % агарозному гелі продуктів ампліфікації мікросателітного локуса ORS511 генома соняшнику та ідентифікації генотипу, що аналізується, як носій гена Rf 1, тобто при наявності в спектрі ДНК алелі ORS511_169 або кількох алелів ORS511_287, ORS511384, ORS511_461 незалежно або разом з алеллю ORS511169. Відмінними від найближчого аналога ознаками в корисній моделі, що заявляється, є: - можливість проводити оцінку здатності до відновлення фертильності пилку на стадії насіння; - простота у використанні кодомінантного SSR-аналізу. Спосіб був експериментально розроблений та апробований в лабораторії генетики, біотехнології і якості біосировинних ресурсів Інституту рослинництва ім. В.Я. Юр'єва НААН впродовж 2011-2012 років. Дослідження здійснено на матеріалі стерильних ліній і лінійвідновників фертильності пилку соняшнику, лінії-закріплювача стерильності. Спосіб забезпечує високу точність і надійність у визначенні здатності до відновлення фертильності пилку. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю заявлених ознак та 1 UA 75555 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 досягнутим результатом виявляться внаслідок ПЛР-аналізу мікросателітного локусу ORS511, який зчеплений з геном Rf 1, що контролює здатність до відновлення фертильності пилку, дозволяє отримувати кодомінантний ДНК-маркер. Алель ORS511_169 є характерною для більшості генотипів - відновників фертильності пилку. При наявності алелів ORS511_287, ORS511_384, ORS511_461 також можна ідентифікувати ген Rf 1. Спосіб здійснюється таким чином: 1. Виділення ДНК. Кінчик корінця проростка соняшника довжиною 1 см гомогенізувати в 1,5 мл пластикових пробірках в лізуючому буфері (1-7М NaCl; 0,2-1M EDTA; 1-4M TrisHCl; 1-4% СТАВ рН=7,5) об'ємом 0,5 мл до повної мацерації тканин. Лізат інкубувати 60 хв при 60 °C. Після інкубації провести невелику додаткову гомогенізацію. До лізату додати рівний об'єм хлороформ:ізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом). Перемішати на вортексі ТЕТА 2 ("Біоком", Росія) - до утворення білої емульсії. Центрифугувати при 10-15.000 об/хв 4-10 хв на мікрофузі СМ-50 ("Elmi", Латвія) при кімнатній температурі. Поверхневу надосадову рідину перенести в чисті пластикові пробірки об'ємом 1,5 мл і додати рівний об'єм ізопропилового спирту. Витримати отриману суміш на льоду 5-20 хв. Центрифугувати пробірки при 5-15.000 об/хв 4-10 хв на мікрофузі СМ-50 ("Elmi", Латвія) при кімнатній температурі. Злити надосадову рідину. Осад промити 0,5 мл 50-96 % етанолу двічі. Центрифугувати при 5-10.000 об/хв 3-10 хв на мікрофузі СМ-50 ("Elmi", Латвія). Осад ДНК підсушити при кімнатній температурі 15 хв і розчинити в 0,05 мл ТЕ буферу (5-15мМ TrisHCl, 0,5-3мМ EDTA). 2. Проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). ПЛР проводити на термоциклері "Терцик" ("ДНК-технологія", Росія). До складу реакційної суміші об'ємом 20 мкл входили: їх буфер (5-15 мМ Трис-НСІ, 20-70 мМ КСl, 0,8 % нонідет), 1-5 мМ dNTPmix, 0,1-0,5 мкМ кожного праймеру, 1-4 мМ MgCl2, 0,5-3 од. Taq-полімерази ("Fermentas", Латвія). Ампліфікацію проводили за стандартною методикою. Умови ампліфікації: Початкова денатурація 94 °C 1-5 хв, 30-40 циклів при таких режимах: денатурація 94 °C 30-60 с, відпал 50-60 °C 30-60 с, елонгація 72 °C 1-5 хв. Фінальна елонгація 72 °C 1-5 хв. Застосовувались праймери для мікросателітного локусу ORS511. 3. Електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації. Оцінювати продукти ампліфікації (5 мкл-аліквоту ПЛР-суміші) у 2 % агарозному гелі. Склад гелю: 1-4 % агароза в 1хТВЕ буфері (50 мМ Tris-H3BO3, 1 мM EDTA, рН=8,0). Для подальшої візуалізації продуктів ампліфікації при приготуванні гелю в нього вносяться 1 % розчин етидіум броміду. Умови електрофорезу: напруга 220-350 В протягом 45-120 хв. Для контролю за просуванням фрагментів ДНК в гелі зразок змішати з 1-5 мкл розчину барвника (1xOrange DNA Loading Dye ("Fermentas", Латвія). Продукти ампліфікації зразків разом з розчином барвника вносяться на відповідні доріжки. Не менше однієї доріжки гелю повинні містити маркер молекулярної ваги О'RangeRuler 100 bp DNA Ladder ("Fermentas", Латвія). 4. Візуалізація продуктів ампліфікації. Після закінчення форезу гель помістити в ультрафіолетове світло трансілюмінатора UVТ-1 ("Біоком", Росія), де завдяки світінню етидіум броміду візуалізуються продукти ампліфікації. 5. Документування отриманих електрофореграм. Документування електрофореграм проводити за допомогою відеокамери (AverMedia, Тайвань, або аналогічної). Розміри алелів мікросателітного локусу ORS511 встановлювати за допомогою комп'ютерної програми Gel Images-2 ("Хелікон", Росія) згідно з стандартом молекулярної ваги. 6. Наявність гена Rf1 у досліджених генотипів. За результатами ПЛР-аналізу мікросателітного локусу ORS511 встановити для генотипу, що тестується, характерний набір алелів. Наявність алеля ORS511_169, алелів ORS511_287, ORS511_384 та ORS511_461 разом, або незалежно від алелю ORS511169 буде свідчити про наявність гена Rf 1. Оцінка на наявність гена Rf1 ліній соняшнику селекції Інституту рослинництва ім. В.Я. Юр'єва. Для дослідження брали насіння материнських форм Сх908А, Сх1002А, Сх1006А, Сх1010А, Сх1012А, Сх2111А, Сх2552А, лінії-закріплювача Х908Б, батьківських форм X114В, Х526В, Х711В, Х712В, Х714В, Х720В, Х762В, Х782В, Х840В. Виділяли ДНК, проводили електрофорез у 2 % агарозному гелі продуктів ампліфікації за мікросателітним локусом ORS511. В ДНК-спектрі у ліній-відновників фертильності пилку: X114В, Х526В, Х711В, Х712В, Х714В, Х720В, Х762В, Х882В, Х840В виявлені відповідні алелі. У всіх ліній, крім Х762В, виявлені алелі ORS511_169. У ліній X114В, Х720В виявлені також алелі ORS511_287, ORS511384 та ORS511_461. У лінії Х762В виявлені лише алелі ORS_287, ORS_384 тa ORS_461 (графічне зображення). 2 UA 75555 U 5 10 15 20 25 На графічному зображенні представлена електрофореграма продуктів ампліфікації по локусу ORS511 у 2% агарозі: 1 - X114В, 2 - Х526В, 3 - Х711В, 4 - Х714В, 5 - Сх1006А, 6 - Ммаркер молекулярної маси 100 bp, 7 - Х908Б, 8 - Х720В, 9 - Х762В, 10 - Х882В, 11 - Х840В. У стерильних ліній та ліній-закріплювачів стерильності в ДНК-спектрі відповідних фрагментів не виявлено. Висновок: у ліній-відновників пилку соняшнику за допомогою мікросателітного маркеру ORS511 виявлено ген Rf1. За допомогою маркеру ORS511 можливо проводити добір відновників фертильності пилку соняшнику за системою PET1-Rf1. Джерела інформації: 1. Методические указания по селекции подсолнечника на гетерозис. - Москва, 1973. - 20 с. 2. Попов В. Н., Кириченко В. В. Мужская стерильность подсолнечника. - X., 2010. - 156 с. 3. Gentsbittel L., Vear F., Zhang Y.-X., Berville A., Nicolas P. Development of a consensus lineage RELP map of cultivated sunflower (Helianthus annuus L.) //Theor. Appl. Genet - 1995. - V.90. - №7-8. - P.1079-1086. 4. Serene I. M., Manivannan N., Muralidharan V. Identification of RAPD marker linked to a fertility restorer gene for PET-1 cytoplasm of sunflower - Helianthus annuus L.//Helia. - 2003. - V.26, №39. P.67-73. 5. GentsbittelL., VearF., ZhangY.-X., BervilleA., NicolasP. DevelopmentofaconsensuslincageRELPmapofcultivatedsunflower (HelianthusannusL.) // Theor. Appl. Genet. - 1995. - V.90. - №7-8. - P. 1079-1086. 6. Horn R, Kusterer B, Lazarescu E, Prufe M, Friedt W. Molecular mapping of the Rf1 gene restoring pollen fertility in PET 1-based F1 hybrids in sunflower (Helianthus annuus L.) //.TheorAppl Genet. - 2003. - V.106, №4. - P.599-606. 7. Kusterer В., Prufe M., Lazarescu E. Mapping of the restorer gene Rf1 in sunflower (HelianthusannusL.) // Helia. - 2002. - V.25. - №36. - P.41-46. 8. Yue В., Vick В., Cai X., Hu J. Genetic mapping for the Rf1 (fertility restoration) gene in sunflower (Helianthus annuus L.) by SSR and TRAP markers // Plant Breeding. - 2010. - V. 129, №1. - P.24-28. 9. Chepurnaya A., Sherstyuk V., Tikhomirov V. CMS-Rf system for sunflower breeding // Helia. 2003. - V. 26. - № 38. P. 59-65. 30 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Спосіб добору в селекції соняшнику генотипів-носіїв гена Rf1 за допомогою SSR-маркера, що включає диференціацію ліній-відновників від ліній-закріплювачів та стерильних ліній, який відрізняється тим, що здійснюється за допомогою електрофоретичного аналізу продуктів ампліфікації ДНК за мікросателітним локусом ORS511 генома соняшнику та ідентифікації лінійвідновників при наявності в спектрі ДНК відповідних алелей. 3 UA 75555 U Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4