Спосіб зберігання бактерій роду staphylococcus та enterococcus

Реферат: Спосіб зберігання бактерій роду Staphylococcus та Enterococcus включає приготування суспендуючого гліцеринового середовища. Суспендуюче гліцеринове середовище розливають у стерильні епендорфи по 2 мл та стерилізують, готують комбінований препарат з розчинів -4 -5 наноаквахелатів міді (Сu) та цинку (Zn) у концентрації 10 та 10 . Вносять комбінований препарат в кількості 0,1 мл у приготовлене стерильне гліцеринове середовище, вносять мікробну завись у гліцеринове середовище в кількості 0,1 мл та зберігають культури при температурі -20 °C. UA 75716 U (12) UA 75716 U UA 75716 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медичної мікробіології і може використовуватися для тривалого зберігання штамів бактерій. Відомі складні способи довготривалого збереження штамів мікроорганізмів із застосуванням методів ліофільного висушування, кріоконсервації та сорбційно-контактного зневоднення. Метод ліофілізації, що є найбільш поширеним у практиці тривалого зберігання бактерій в колекціях науково-дослідних інститутів, полягає у видаленні води із заморожених суспензій бактерій шляхом сублімації при низькому тиску. З цією метою вирощують велику кількість клітин 8 мікроорганізмів (не менше 10 КУО/мл). У стерильних умовах змивають колонії, що виросли на поверхні агару у період максимальної стабільності та життєздатності культури (пізня експоненціальна або рання стаціонарна фази), суспендують у середовищі, що містить кріопротектори, розливають в ампули, які закривають ватними пробками, заморожують клітини при температурі -65 °C і висушують за допомогою приладу ліофільного сушіння. Недоліком способу збереження штамів із застосуванням ліофільного висушування є те, що він потребує багато часу для його здійснення, відпрацювання показників режиму висушування, визначення якісного та кількісного складу інгредієнтів стабілізуючого середовища та постійного технологічного обслуговування упродовж всього процесу висушування [1, 2]. Метод сорбційно-контактного зневоднення включає приготування сорбційно-дисперсійного модуля, до складу якого входять: наповнювач-зневоднювач біомаси - гранульована іонообмінна смола марки КБ-4П-2, дезагрегант-диспергатор біомаси - гідрофобний аеросил марки AM-1-300 і посередник-зневоднювач - лактоза. Зазначені компоненти змішують у лабораторному шаровому барабані та додають суміш агарового змиву культури із захисним стабілізувальним середовищем. Отриману суху біомасу відділяють від шарів барабана, витримують 5 годин при температурі 4 - 6 °C і знову інтенсивно перемішують. Оптимально підібране співвідношення адсорбенту та адсорбтиву за рахунок повного перерозподілу вологи від біомаси на наповнювач забезпечує високу стійкість отриманого препарату, який зберігають при температурі (4 ± 2)°С [3]. Проте застосування зазначеної технології з використанням щадного режиму висушування забезпечує вищий рівень збереження життєздатності бактерій в контактно зневоднених зразках порівняно з кількістю життєздатних мікробних клітин після ліофільного висушування в незначній мірі. Крім того, для кожного таксономічного виду бактерій необхідно здійснювати індивідуальний підбір співвідношення адсорбенту з адсорбтивом. Відомий спосіб тривалого зберігання (до п'яти років) штамів ентерококів у гліцериновому бульйоні шляхом заморожування при температурі -20 °C. Спосіб включає приготування 16% гліцеринового бульйону, який розливають у стерильні кріопробірки. Вирощують культуру ентерококів на кров'яному агарі протягом доби при температурі 37 °C. Культуру ентерококів вносять у попередньо марковані пробірки з гліцериновим бульйоном, складають у кріобокси та без попереднього підрощування зберігають у морозильній камері при температурі -20 °C або 80 °C [4]. Спосіб простий, доступний, проте у процесі тривалого зберігання знижується рівень життєздатності бактерій, що призводить до зменшення кількості бактеріальної маси у процесі відновлення культури для науково-практичних потреб. В основу корисної моделі поставлено задачу створення способу зберігання бактерій роду Staphylococcus та Enterococcus шляхом використання карбоксилованих розчинів наноаквахелатів металів для збільшення рівня життєздатності бактерій, спрощення технологічних операцій при підготовці до зберігання. Запропонований спосіб зберігання бактерій роду Staphylococcus та Enterococcus шляхом використання карбоксилованих розчинів наноаквахелатів металів може застосовуватись як альтернативний за відсутності умов застосування зазначених вище методів ліофілізації та сорбційно-контактного зневоднення. Поставлена задача вирішується у способі зберігання бактерій роду Staphylococcus та Enterococcus, який включає приготування суспендуючого гліцеринового середовища. Новим є те, що суспендуюче гліцеринове середовище розливають у стерильні епендорфи по 2 мл та стерилізують, готують комбінований препарат з розчинів наноаквахелатів міді (Сu) та цинку (Zn) -4 -5 у концентрації 10 та 10 , вносять комбінований препарат в кількості 0,1 мл у приготовлене стерильне гліцеринове середовище, вносять мікробну завись у гліцеринове середовище в кількості 0,1 мл та зберігають культури при температурі -20 °C. Між сукупністю ознак корисної моделі і технічним результатом, якого можна досягти при її реалізації, існує причинно-наслідковий зв'язок: Наноаквахелати металів є системою з деіонізованої води і карбоксилованих наночастинок металів, отриманих ерозійно-вибуховим способом за методом Каплуненка-Косінова [5, 6, 7]. Метали в наноаквахелатній формі є значно активніші, ніж їх класичні молекулярні форми. Особливістю наноаквахелатів біогенних металів є їх здатність виражено активувати фізіологічні і біохімічні процеси унаслідок прояву корпускулярних, хвильових, квантових та інших 1 UA 75716 U 5 10 15 20 25 30 35 властивостей. Крім того, вони мають високу дифузійну рухливість, що також інтенсифікує перебіг процесів обміну речовин. Так, мідь є важливою складовою частиною ферментів антиоксидантних систем і сприяє відновленню морфофункціональних параметрів клітин. Цинк є кофактором багатьох ферментів, які приймають участь у білковому та інших видах обміну, та бере участь у процесах ділення і диференціації клітин, тому він необхідний для перебігу багатьох біохімічних процесів. Таким чином, додавання розчинів наноаквахелатів металів міді та цинку у традиційне гліцеринове середовище покращує перебіг обмінних та репаративних процесів штамів мікроорганізмів у процесі їх тривалого зберігання та дозволяє отримати значно більшу біомасу життєздатних мікроорганізмів у процесі періодичного відновлення життєздатності штамів без втрати і зміни їх біологічних властивостей, що має велике значення в практиці роботи мікробіологічних лабораторій медичних закладів та наукових установ. Спосіб здійснюють наступним чином: Готують 16% гліцериновий бульйон наступним чином: 6,25 г поживного бульйону, 42 г (не мл) гліцерину, 208 мл дистильованої води акуратно перемішують, розливають по 1 мл у стерильні кріопробірки типу епендорф, стерилізують 10 хвилин при температурі 115 °C. З наноаквахелатних розчинів міді (Сu) у концентрації міді 500 мг/л та цинку (Zn) у концентрації цинку 4500 мг/л та фізіологічного розчину готують комбінований препарат в діапазоні -1 -5 концентрацій від 10 до 10 . До епендорфів з гліцериновим середовищем вносили комбіновані препарати розчинів наноаквахелатів зазначених концентрацій у кількості 0,1 мл. Музейні еталонні штами Staphylococcus aureus ATCC 25923 та Enterococcus faecalis ATCC 29212, вирощені на жовтково-сольовому агарі та ентерококагарі відповідно при температурі 37 °C протягом 24 годин (для штаму Staphylococcus aureus ATCC 25923 термін інкубації складав 48 годин), змивали фізіологічним розчином. За допомого приладу денситометру DENSIMAT (виробництва bioMerieux, Франція) встановлювали густину мікробної зависі 10 КУО/мл та вносили у попередньо марковані епендорфи з приготовленим гліцериновим середовищем з додаванням наноаквахелатів у кількості 0,1 мл. Зберігали культури у морозильній камері при температурі -20 °C протягом року. Дослідження біохімічних властивостей еталонних культур здійснювали з використання автоматичного баканалізатору VITEK 2 - compact 15 (виробництва bioMerieux, Франція). Визначення ефективності способу. Через 1, 3 та 9 місяців після заморожування проводили висів культур еталонних штамів за допомогою бактеріологічної петлі на відповідні поживні середовища, які інкубували в термостаті при 37 °C протягом 24 годин (для штаму Staphylococcus aureus ATCC 25923 термін інкубації складав 48 годин). На другу добу проводили облік та оцінку росту життєздатних мікроорганізмів у четвертому секторі поживного середовища. Як контроль проводили висів та облік росту відібраних еталонних штамів із гліцеринового середовища без додавання розчинів наноаквахелатів. Результати досліджень наведені в таблицях 1 та 2. Таблиця 1 Вплив наномодифікованого стабілізуючого середовища на життєздатність еталонних культур Staphylococcus aureus ATCC 25923 та Enterococcus faecalis АТСС 29212 Вид штаму Staphylococcus aureus ATCC 25923 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Життєздатність (КУО)* через 1, 3 і 9 місяців зберігання на гліцериновому середовищі з додаванням наноаквахелатів Cu+Zn -1 -2 -3 -4 -5 10 10 10 10 10 2 5 50 110 55 0 2 40 85 60 0 3 20 50 30 3 15 10 13 10 20 25 80 90 70 25 25 30 50 20 Контроль 10 15 10 2 3 10 Примітка: * КУО - кількість колонієутворюючих одиниць в 4-му секторі відповідного поживного середовища. 40 -4 Таким чином, комбінація наноаквахелатів Cu + Zn у концентрації 10 через місяць після заморожування стимулювала ріст грампозитивних мікроорганізмів Staphylococcus aureus в 11 2 UA 75716 U 5 разів та Enterococcus faecalis у 6,5 разу. Після тримісячного терміну зберігання ріст Staphylococcus aureus посилювався у 5,7 разу, Enterococcus faecalis у 30 разів, а через 9 місяців спостерігалось зростання біомаси обох видів грампозитивних бактерій у 5 разів. Результати досліджень біологічних властивостей еталонних штамів Staphylococcus aureus ATCC 25923 та Enterococcus faecalis ATCC 29212 свідчать про стабільність біохімічних характеристик культур, які зберігали традиційним та запропонованим нами способом (табл. 2). Таблиця 2 Біохімічні властивості еталонних штамів Staphylococcus aureus ATCC 25923 та Enterococcus faecalis ATCC 29212 після традиційного та запропонованого методів зберігання № лунки 2 4 5 8 9 11 13 14 15 16 17 19 20 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 38 39 42 44 45 46 47 50 52 53 54 56 57 58 59 60 62 63 64 10 Тест D-амігдалин Фосфатиділінозитфосфоліпаза С D-ксилоза Аргініндигідролаза 1 Бета-галактозидаза Альфа-глюкозидаза Ala-Phe-Pro Ариламідаза Циклодекстрин L-Аспартатариламідаза Бетагалактопіранозидаза Альфа-манозидаза Фосфатаза Лейцинариламідаза L-пролінариламідаза Бета-глюкуронідаза Альфа-галактозидаза L-Піролідоніл-ариламідаза Бета-глюкуронідаза Аланінариламідаза Тирозинариламідаза D-сорбіт Уреаза Стійкість до поліміксину В D-рибоза L-лактат, олужнення Лактоза N-ацетил-D-глюкозамін D-мальтоза Стійкість до бацитрацину Стійкість до новобіоцину Ріст при 6,5% NaCl D-маніт D-маноза Метил-B-D-глюкопіранозид Пулулан D-рафіноза Стійкість до O/129 Саліцин Сахароза D-трегалоза Аргініндигідролаза 2 Стійкість до оптохіну Біохімічні характеристики штамів після зберігання способом Staphylococcus aureus ATCC Enterococcus faecalis ATCC 25923 29212 традиційним новим традиційним новим + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Таким чином, технологія тривалого зберігання еталонних штамів Staphylococcus aureus ATCC 25923 та Enterococcus faecalis ATCC 29212 у запропонованому нами способі більш перспективна у порівнянні з традиційним способом, дозволяє отримати значно більшу біомасу життєздатних мікроорганізмів та забезпечує довгострокове зберігання штамів без втрати їх 3 UA 75716 U 5 10 15 20 ростових і біологічних властивостей, що особливо важливо для тривалої підтримки життєздатності еталонних штамів у бактеріологічних лабораторіях діагностичного, наукового призначення та музеях живих культур. Джерела інформації: 1. Мироненко Л.Г., Перетятко Е.Г., Холодная Т.В., Турина Т.М. Стабильность биологических свойств Enterococcus faecium в процессе криоконсервирования // Методи одержання чистих культур мікроорганізмів та їх довгострокового зберігання в колекціях: роботи співробітників Музею патогенних для людини мікроорганізмів. - К.: Знання України, 2009. - Вип. 7. - С. 48-54. 2. Методы общей бактериологии // Под ред. Ф. Герхардта и др. - М.: Мир. - 1983. - С. 516524. 3. Пінчук Н.Г. Розробка технології довготривалого зберігання бактерій з використанням методу сорбційно-контактного зневоднення // Автореферат на здоб. наук. ступ. канд. вет. наук: 16.00.03. - Нац. наук, центр "Ін-т експерим. і клініч. вет. медицини". - Харків, 2008. - 20 с. 4. Методичні рекомендації "Методи виділення та ідентифікації ентерококів" // Поліщук О.І., Міроненко Л.Г., Глушкевич Т.Г., Яновська В.В., Покас О.В., Перетятко О.Г. - К.: Знання України. 2009. - С. 22-23. 5. Патент України № 29280 Аквахелат нанометалу // Косінов М.В., Каплуненко В.Г. / МПК (2006): C07F 19/00, C12N 1/20. Опубл. 10.01.2008, бюл. № 1/2008. 6. Патент України на корисну модель № 35580. Гідратована і карботована наночастинка // Косінов М.В., Каплуненко В.Г. / МПК (2006): B01J 13/00, В32В 5/00. Опубл. 25.09.2008, бюл. № 18/2008. 7. Патент України на корисну модель № 49049. Надчистий нанокарбоксилат // Косінов М.В., Каплуненко В.Г. / МПК (2009): С07С 51/41, C07F 5/00, C07F 15/00, С07С 53/00, В82В 3/00. Опубл. 12.04.2010, бюл. № 7/2010. 25 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 Спосіб зберігання бактерій роду Staphylococcus та Enterococcus, що включає приготування суспендуючого гліцеринового середовища, який відрізняється тим, що суспендуюче гліцеринове середовище розливають у стерильні епендорфи по 2 мл та стерилізують, готують -4 комбінований препарат з розчинів наноаквахелатів міді (Сu) та цинку (Zn) у концентрації 10 та -5 10 , вносять комбінований препарат в кількості 0,1 мл у приготовлене стерильне гліцеринове середовище, вносять мікробну завись у гліцеринове середовище в кількості 0,1 мл та зберігають культури при температурі -20 °C. 35 Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4