Спосіб приготування наномодифікованого стабілізуючого середовища для тривалого зберігання штамів бактерій

Реферат: Спосіб приготування наномодифікованого стабілізуючого середовища для тривалого зберігання штамів бактерій включає приготування стерильного гліцеринового середовища, крім того у стерильне гліцеринове середовище вносять препарат, приготовлений з розчинів наноаквахелатів міді і цинку. UA 75365 U (12) UA 75365 U UA 75365 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медичної мікробіології і може використовуватися для тривалого зберігання штамів бактерій. Відомий спосіб приготування стабілізуючого середовища для тривалого зберігання штамів бактерій включає приготування стерильного гліцеринового середовища. Готують 16 % гліцериновий бульйон шляхом змішування 6,25 г поживного бульйону, 42 г гліцерину та 208 мл дистильованої води, стерилізують 10 хвилин при температурі 115 °C, розливають по 1 мл у стерильні кріопробірки типу епендорф об'ємом 1,5-2 мл. Вирощують культуру ентерококів на кров'яному агарі протягом доби при температурі 37 °C. Культуру ентерококів вносять у попередньо марковані пробірки з гліцериновим бульйоном, складають у кріобокси та без попереднього підрощування зберігають у морозильній камері при температурі -20 °C або -80 °C [2]. Спосіб простий, доступний, проте у процесі тривалого зберігання, а також на періодичних етапах заморожування-відігріву у процесі відновлення культури для науково-практичних потреб знижується рівень життєздатності бактерій, що супроводжується пошкодженням мікробних клітин та призводить до зменшення кількості бактеріальної маси [1]. В основу корисної моделі поставлено задачу створення способу приготування рідкого поживного середовища з використанням карбоксилованих розчинів наноаквахелатів металів міді та цинку [3, 4, 5, 6], який би підвищив рівень життєздатності бактерій при їх зберіганні. Поставлена задача вирішується у способі приготування наномодифікованого стабілізуючого середовища для тривалого зберігання штамів бактерій, який включає приготування стерильного гліцеринового середовища. Новим є те, що у стерильне гліцеринове середовище вносять препарат, приготовлений з розчинів наноаквахелатів міді і цинку. Між сукупністю ознак корисної моделі і технічним результатом, якого можна досягти при її реалізації, існує причинно-наслідковий зв'язок: Застосування наномодифікованого рідкого стабілізуючого середовища дозволяє отримати значно більшу біомасу життєздатних мікроорганізмів у процесі тривалого зберігання та забезпечує стабільність біологічних характеристик еталонних штамів без втрати їх ростових і біохімічних властивостей, що особливо важливо в роботі бактеріологічних лабораторій діагностичного, наукового призначення та музеїв живих культур. Наноаквахелати біогенних металів є системою з деіонізованої води і карбоксилованих наночастинок металів, отриманих ерозійно-вибуховим способом за методом КаплуненкаКосінова [5,6]. Метали в наноаквахелатній формі є значно активніші, ніж їх класичні молекулярні форми. Особливістю наноаквахелатів біогенних металів є їх здатність виражено активувати фізіологічні і біохімічні процеси унаслідок прояву корпускулярних, хвильових, квантових та інших властивостей. Крім того, вони мають високу дифузійну рухливість, що також інтенсифікує перебіг процесів обміну речовин. Так, мідь є важливою складовою частиною ферментів антиоксидантних систем і сприяє відновленню морфофункціональних параметрів клітин. Цинк є кофактором багатьох ферментів, які приймають участь у білковому та інших видах обміну, та бере участь у процесах ділення і диференціації клітин, тому він необхідний для перебігу багатьох біохімічних процесів. Таким чином, додавання розчинів наноаквахелатів металів міді та цинку у традиційне гліцеринове середовище покращує перебіг обмінних та репаративних процесів штамів мікроорганізмів у процесі їх тривалого зберігання. Спосіб здійснюють наступним чином: Готують 16 % гліцериновий бульйон наступним чином: 6,25 г поживного бульйону, 42 г (не мл) гліцерину, 208 мл дистильованої води акуратно перемішують, розливають по 1 мл у стерильні кріопробірки типу епендорф, стерилізують 10 хвилин при температурі 115 °C. З наноаквахелатних розчинів міді (Сu) у концентрації міді 500 мг/л та цинку (Zn) у концентрації цинку 4500 мг/л та фізіологічного розчину готують комбінований препарат в діапазоні 1 5 концентрацій від 10- до 10- . До епендорфів з гліцериновим середовищем вносили комбіновані препарати розчинів наноаквахелатів зазначених концентрацій у кількості 0,1 мл. Музейні еталонні штами Staphylococcus aureus ATCC25923 та Enterococcus faecalis ATCC 29212, вирощені на жовтково-сольовому агарі та ентерококагарі відповідно при температурі 37 °C протягом 24 годин (для штаму Staphylococcus aureus ATCC 25923 термін інкубації складав 48 годин), змивали фізіологічним розчином. За допомого приладу денситометру DENSIMAT 8 (виробництва bioMerieux, Франція) встановлювали густину мікробної зависі 10 КУО/мл та вносили у попередньо марковані епендорфи з приготовленим гліцериновим середовищем з додаванням наноаквахелатів у кількості 0,1 мл. Зберігали культури у морозильній камері при температурі -20 °C протягом року. Дослідження біохімічних властивостей еталонних культур здійснювали з використанням автоматичного баканалізатора VITEK 2-compact 15 (виробництва bioMerieux, Франція). Визначення ефективності способу. 1 UA 75365 U 5 Через 1, 3 та 9 місяців після заморожування проводили висів культур еталонних штамів за допомогою бактеріологічної петлі на відповідні поживні середовища, які інкубували в термостаті при 37 °C протягом 24 годин (для штаму Staphylococcus aureus ATCC 25923 термін інкубації складав 48 годин). На другу добу проводили облік та оцінку росту життєздатних мікроорганізмів у четвертому секторі поживного середовища. Як контроль проводили висів та облік росту відібраних еталонних штамів із гліцеринового середовища без додавання розчинів наноаквахелатів. Результати досліджень наведені в таблицях 1 та 2. Таблиця 1 Вплив наномодифікованого стабілізуючого середовища на життєздатність еталонних культур Staphylococcus aureus АТСС 25923 та Enterococcus faecalis АТСС 29212 Вид штаму Staphylococc us aureus АТСС 25923 Enterococcus faecalis АТСС 29212 Життєздатність (КУС)* через 1,3 і 9 місяців зберігання на гліцериновому середовищі з додаванням наноаквахелатів Cu+Zn 1 2 3 4 5 10101010102 5 50 по 55 0 2 40 85 60 Контроль 10 15 0 3 20 50 30 10 3 20 25 15 25 25 10 80 30 13 90 50 10 70 20 2 3 10 10 Примітка: * КУО - кількість колонієутворюючих одиниць в 4-му секторі відповідного поживного середовища. 4 15 20 Таким чином, комбінація наноаквахелатів Сu+Zn у концентрації 10- через місяць після заморожування стимулювала ріст грампозитивних мікроорганізмів Staphylococcus aureus в 11 разів та Enterococcus faecalis у 6,5 разу. Після трьохмісячного терміну зберігання ріст Staphylococcus aureus посилювався у 5,7 разу, Enterococcus faecalis у 30 разів, а через 9 місяців спостерігалось зростання біомаси обох видів грампозитивних бактерій у 5 разів. Результати досліджень біологічних властивостей еталонних штамів Staphylococcus aureus АТСС 25923 та Enterococcus faecalis АТСС 29212 свідчать про стабільність біохімічних характеристик культур, які зберігали традиційним та запропонованим нами способом (табл.2.). 2 UA 75365 U Таблиця 2 Біохімічні властивості еталонних штамів Staphylococcus aureus ATCC 25923 та Enterococcus faecalis ATCC 29212 після традиційного та запропонованого методів зберігання Біохімічні характеристики штамів після зберігання способом № лунки Тест Staphylococcus aureus ATCC 25923 Enterococcus faecalis ATCC 29212 традиційним новим традиційним новим 2 D-амігдалин + + Фосфатидилінозитфос4 фоліпаза С 5 D-ксилоза 8 Аргініндигідролаза 1 + + + + 9 Бета-галактозидаза 11 Альфа-глюкозидаза 13 Ala-Phe-Pro Ариламідаза 14 Циклодекстрин 15 L-Аспартатариламідаза + + 16 Бета-галактопіранозида за 17 Альфа-манозидаза 19 Фосфатаза + + 20 Лейцинариламідаза 23 L-пролінариламідаза 24 Бета-глюкуронідаза 25 Альфа-галактозидаза 26 L-Піролідоніл-ариламідаза + + + + 27 Бета-глюкуронідаза 28 Аланінариламідаза + + 29 Тирозинариламідаза + + 30 D-сорбіт 31 Уреаза 32 Стійкість до поліміксину В + + + + 38 D-рибоза + + 39 L-лактат, олужнення + + 42 Лактоза + + 44 N-ацетил-О-глюкозамін + + + + 45 D-мальтоза + + + + 46 Стійкість до бацитрацину + + + + 47 Стійкість до новобіоцину + + 50 Ріст при 6,5 % NaCl + + + + 52 D-манніт + + + + 53 D-манноза + + + + 54 Метил-B-D-глюкопіранозид + + + + 56 Пулулан 57 D-рафіноза 58 Стійкість до O/129 + + + + 59 Саліцин + + 60 Сахароза + + + + 62 D-трегалоза + + + + 63 Аргініндигідролаза 2 + + + + 64 Стійкість до оптохіну + + + + 5 10 15 Таким чином, технологія приготування наномодифікованого стабілізуючого середовища для тривалого зберігання еталонних штамів Staphylococcus aureus ATCC 25923 та Enterococcus faecalis ATCC 29212 у запропонованому нами способі більш перспективна у порівнянні з традиційним способом, дозволяє отримати значно більшу біомасу життєздатних мікроорганізмів та забезпечує довгострокове зберігання штамів без втрати їх ростових і біологічних властивостей, що особливо важливо для тривалої підтримки життєздатності еталонних штамів у бактеріологічних лабораторіях діагностичного, наукового призначення та музеях живих культур. Джерела інформації: 1. Мироненко Л.Г., Перетятко Е.Г., Холодная Т.В., Турина Т.М. Стабильность биологических свойств Enterococcus faecium в процессе криоконсервирования // Методи одержання чистих культур мікроорганізмів та їх довгострокового зберігання в колекціях: роботи співробітників Музею патогенних для людини мікроорганізмів. - К.: Знання України, 2009. - Вип. 7. - С.48-54. 2. Методичні рекомендації "Методи виділення та ідентифікації ентерококів" // Поліщук О.І., Міроненко Л.Г., Глушкевич Т.Г., Яновська В.В., Покас О.В., Перетятко О.Г. - К.: Знання України, 2009. - С. 22-23. 3 UA 75365 U 5 10 3. Патент України № 29280 Аквахелат нанометалу // Косінов М.В., Каплуненко В.Г. /МПК (2006): C07F 19/00, C12N 1/20. Опубл. 10.01.2008, бюл. № 1/2008 4. Патент України на корисну модель № 35580. Гідратована і карботована наночастинка // Косінов М.В., Каплуненко В.Г. / МПК (2006): B01J 13/00, В32В 5/00. Опубл. 25.09.2008, бюл. № 18/2008 5. Патент України на корисну модель №38391. Спосіб отримання карбоксилатів металів "Нанотехнологія отримання карбоксилатів металів" // Косінов М.В., Каплуненко В.Г. / МПК (2006): С07С 51/41, C07F 5/00, C07F 15/00, С07С 53/126 (2008.01), С07С 53/10 (2008.01), A23L 1/00, В82В 3/00. Опубл. 12.01.2009, бюл. № 1/2009. 6. Патент України на корисну модель № 49049. Надчистий нанокарбоксилат // Косінов М.В., Каплуненко В.Г. / МПК (2009): С07С 51/41, C07F 5/00, C07F 15/00, С07С 53/00, В82В 3/00. Опубл. 12.04.2010, бюл. № 7/2010. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 Спосіб приготування наномодифікованого стабілізуючого середовища для тривалого зберігання штамів бактерій, що включає приготування стерильного гліцеринового середовища, який відрізняється тим, що у стерильне гліцеринове середовище вносять препарат, приготовлений з розчинів наноаквахелатів міді і цинку. 20 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4