Спосіб оцінки клітинних реакцій речовин медичного призначення та фармакологічних препаратів для офтальмології

Реферат: Спосіб оцінки клітинних реакцій речовин медичного призначення та фармакологічних препаратів для офтальмології включає комплексне дослідження життєздатності клітин. Проводять комплексне дослідження життєздатності клітин в динаміці (кінетика росту), розраховують за даними кінетики росту питому швидкість росту (μ) культури (у фазі логарифмічного росту), час подвоєння культури клітин (td) та швидкість розмноження клітин (n) за заданими формулами, порівнюють з контролем, після чого оцінюють клітинні реакції речовин. UA 76314 U (12) UA 76314 U UA 76314 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель, що заявляється, належить до медицини, біології, розділу офтальмології, цитології, і може бути використана для цитологічних досліджень біологічного впливу речовин медичного призначення та фармакологічних препаратів для офтальмології. Використання фармакологічних речовин в офтальмології у вигляді засобів медичного призначення, очних крапель, гелів, препаратів для інтракамерального та інтравітреального введення є невід'ємним елементом у моно- та комбінованій терапії очних захворювань. Речовини медичного призначення та фармакологічні препарати мають певні властивості для забезпечення їхнього специфічного ефекту, які скеровані на досягнення певних хірургічних та терапевтичних цілей. Тканини ока є надзвичайно високодиференційованими, тому фармацевтичні середники повинні, окрім специфічної дії, створювати мінімальний негативний вплив на клітинні елементи тканин. Фармакокінетика та фармакодинаміка препаратів медичного призначення в структурах ока є дуже складними та недостатньо вивченими. Особливості клітинного впливу препаратів залежать від концентрації діючих речовин, наявності та кількості консервантів та допоміжних речовин, часу аплікації, а також стану ока. Більшість фармакологічних препаратів добре всмоктуються зовнішніми та внутрішніми структурами ока та потрапляють у венозні та лімфатичні судини. Клітинний вплив медичних препаратів різниться в залежності від типу фізіологічної та патологічної клітинної системи, з якими препарат вступає у взаємодію. Для дослідження клітинного впливу препаратів медичного призначення in vitro використовують різноманітні клітинні культури in vitro з метою моделювання певних окремих структур ока, на які діють препарати. Серед них можна перелічити наступні: фоторецептори ока кролика чи свині, пігментний епітелій щурів, гангліонарні клітини сітківки щура (RGC5), хоріоідальні ендотеліальні клітини свиней (СЕС), людські мікроваскулярні ендотеліальні клітини (НМЕС), людський пігментний епітелій сітківки (ARPE19), людські ендотеліальні клітини пупкової вени (HUVEC) [1-4]. Проте, питання оцінки реакції клітинних систем ока на дію досліджуваних препаратів є достатньо складним, оскільки для структур ока характерна цитологічна та функціональна різноманітність, висока специфічність. Тому для узагальненої оцінки клітинних реакцій необхідне використання уніфікованої моделі вітальної клітини in vitro, яка б мала властивості більшості клітинних структур ока та людського організму загалом. Спосіб, що ми прийняли за аналог [5], полягає у виявленні клітинних ефектів та токсичності важких металів на гемато-енцефалічний бар'єр з використанням культури хоріоідальних епітеліальних клітин щура (СЕС). Первинні епітеліальні клітини були виділені з хоріоідеї з використанням пронази та культивовані в стандартному середовищі (DMEM), яке містить 10 % фетальну свинячу сироватку та 10 нг/мл епітеліального фактору росту. Культура являє собою домінантний політональний тип клітин з подвоєнням популяції впродовж 2-3 діб. Далі культура була адаптована до росту на повністю проникній мембрані та поміщена між двох камер з такою ж культурою. Формування непроникного конфлуентного шару наставало на п'яту добу після посадки культури. Непроникність культури була верифікована наявністю стійкої електричної 2 резистентності мембрани (80+/-10 ohm/cm ). Епітеліальний бар'єр проявляв активну здатність до транспорту [1251]-тироксину з базальної до апікальної камери. Приведені результати свідчать, що дана клітинна культура володіє властивостями пігментного епітелію хоріоідеї та може служити як модель для дослідження in vitro механізмів проникності гемато-енцефалічного бар'єру. Саме ці властивості даної культури використовуються для оцінки токсичності важких металів на гемато-енцефалічний бар'єр. Недоліком відомого способу є те, що використання часу інкубації є методичним прийомом (наближення умов експерименту до умов in vivo) для досягнення мети і дозволяє зробити висновок лише щодо здатності окремих антигенів (токсичних металів). Також даний спосіб дає можливість оцінити клітинні ефекти лише на окремій клітинній культурі (хоріоідальні епітеліальні клітини), яка анатомічно in vivo знаходиться за зовнішнім гемато-офтальмічним бар’єром та до якої в меншій мірі ніж до внутрішньоочних структур доходять лікувальні концентрації речовин медичного призначення та фармакологічних препаратів, що використовуються в офтальмології. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб оцінки токсичності іонів важких металів у тест-системі культури фібробластоподібних клітин ссавців лінії L929 [6]. Недоліком способу-прототипу є неможливість використання його з метою виявлення функціональних змін у клітинах тест-системи культури, які виникають внаслідок дії на них засобів медичного призначення та фармакологічних препаратів, що використовуються в офтальмології як для хірургічного, так і для терапевтичного лікування. 1 UA 76314 U 5 10 15 20 25 Задача, яку вирішує корисна модель, що заявляється, полягає в створенні способу оцінки стану клітин in vitro з використанням відповідних барвників і за допомогою мікроскопа при інкубації їх з іонами важких металів на основі можливості виявлення порушення здатності клітин до утворення щільного моношару за кінетикою росту, оцінки мітотичної активності досліджуваних клітин за показниками швидкості розмноження та часу подвоєння. Технічний результат вирішується за рахунок того, що проводять комплексне дослідження впливу медичних препаратів на тест-систему - асинхронну культуру фібробластоподібних клітин (лінія L929). Спосіб дозволяє визначити як загальний (мінімум декілька складових) стан клітин у культурі (за кінетикою росту клітинної популяції та мітотичній активності), так і окремі його характеристики (мінімум одна складова: кількість багатоядерних гігантських клітин), виявити відмінності у функціональному стані клітин, які перебувають у фізіологічних умовах та клітин, за наявності в поживному середовищі різних концентрацій іонів важких металів. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі, який включає комплексне дослідження життєздатності клітин, згідно з корисною моделлю, проводять комплексне дослідження життєздатності клітин в динаміці (кінетика росту), розраховують за даними кінетики питому швидкість росту (μ) культури (у фазі логарифмічного росту), час подвоєння культури клітин (td) та швидкість розмноження клітин (n), порівнюють з контролем і розраховують за формулам:   ln X  ln Xo  t 1 , де X - кількість клітин через проміжок часу t (на 5-у добу культивування); Xo - кількість клітин на 1-у добу культивування; t - час спостереження. За даними питомої швидкості росту (μ) розраховують час подвоєння культури клітин (t): td  ln 2 /   0693  та швидкість розмноження клітин: n  3,32 logX / Xo  , де 2 X - кількість клітин на площі препарату 0,05 мм на 5-у добу культивування; 2 30 35 40 45 50 55 Xo - кількість клітин на площі препарату 0,05 мм на 1-у добу культивування, після чого оцінюють клітинні реакції речовин. Спосіб дозволяє визначити як загальний (мінімум декілька складових) стан клітин у культурі (за кінетикою росту клітинної популяції та мітотичній активності), так і окремі його характеристики (мінімум одна складова: кількість багатоядерних гігантських клітин), виявити відмінності у функціональному стані клітин, які перебувають у фізіологічних умовах та клітин, за наявності в поживному середовищі різних концентрацій іонів важких металів. Перевагою запропонованого способу використання тест-системи культури фібробластоподібних клітин ссавців лінії L929 є те, що дана культура може служити одночасно як тест-система вітальної клітини, яка є структурним елементом усіх тканин ока, так і як тестсистема окремої ланки проліферативних процесів, які часто супроводжують патологічні стани високодиференційованих тканин ока. Використовуючи спосіб порівняння характерів відповідей клітин у тест-системі, які перебувають у нормальних фізіологічних умовах (інтактних), та в умовах інкубації їх з медичними препаратами, роблять висновок щодо патологічного стану клітин in vitro. Здійснення способу пояснюється прикладами дослідження показників життєздатності клітин у тест-системі культури фібробластоподібних клітин, які відображають різні складові функціонального стану клітини. Спосіб виконується наступним чином. До культури фібробластоподібних клітин лінії L929, посаджених в культуральні флакони з покривними скельцями в кількості 5 тис клітин в 1 мл поживного середовища складу RPMI 1640, фетальної телячої сироватки (10%) та антибіотиків, додають розчини речовин медичного призначення або фармакологічних препаратів, що використовуються в офтальмології, у різних концентраціях. Кожної доби упродовж шести діб готують препарати для оптичної мікроскопії: фіксація етиловим спиртом - 10 хвилин, відмивання проточною водою - 5 хвилин, фарбування гематоксиліном-еозином, просвітлення в ксилолі та наклеювання на предметне скло канадським бальзамом. Під мікроскопом при збільшенні у 1000 разів у 30 полях зору підраховують середню кількість клітин у полі зору, кількість мітозів (%) та кількість полікаріоцитів (%). За отриманими даними будують залежності кінетики росту, мітотичної активності та кількості багатоядерних клітин (як показника репродуктивної загибелі). За кривими росту клітинної 2 UA 76314 U 5 10 популяції розраховують питому швидкість росту (μ) культури клітин (у фазі логарифмічного росту). Приклад 1. Об'єкт дослідження - тест-система: асинхронна культура фібробластоподібних клітин (лінія L929) - інтактні клітини; значущий параметр - кінетика росту клітин в культурі без додавання в культуральне середовище речовин медичного призначення та медпрепаратів для офтальмології, мітотична активність клітин та кількість полікаріоцитів у культурі клітин; методика визначення - визначення середньої щільності клітинної популяції на площі препарату 0,05 мм на 1, 2, 3, 4, 5 та 6 доби культивування та розрахунок на основі цих даних питомої швидкості росту (μ) культури (у фазі логарифмічного росту) в контролі (інтактні клітини):   ln X  ln Xo  t 1 , де X - кількість клітин через проміжок часу t (на 5-у добу культивування); Xo - кількість клітин на 1-у добу культивування; 15 20 25 30 35 40 45 50 55 t - час спостереження. Для інтактної культури клітин питома швидкість росту μ=0,39. За даними питомої швидкості росту (μ) розраховуємо час подвоєння культури клітин (t): td  ln 2 /   0693  , який складає - 0,27, та швидкість розмноження клітин: n  3,32 logX / Xo  , де 2 на X - кількість клітин на площі препарату 0,05 мм 2 5-у добу культивування; - кількість клітин на площі препарату 0,05 мм на 1-у добу культивування. Xo Для інтактної культури клітин швидкість розмноження n=2,86. Одночасно на тих самих препаратах підраховують кількість мітозів на 1000 клітин (‰), а також кількість гігантських полікаріоцитів на 1000 клітин (‰). Приклад 2. Об'єкт дослідження - тест-система: асинхронна культура фібробластоподібних клітин (лінія L929), до якої після експлантації додавали ранібізумаб у дозі 50 мкг/мл; значущий параметр - кінетика росту клітин в культурі при інкубації з ранібізумабом, препаратом для внутрішньоочного введення, мітотична активність клітин та кількість полікаріоцитів у культурі клітин; методика визначення - визначення середньої щільності клітинної популяції на площі 2 препарату 0,05 мм на 1, 2, 3, 4, 5 та 6 доби культивування та розрахунок на основі цих даних питомої швидкості росту (μ) культури (у фазі логарифмічного росту), часу подвоєння культури клітин (td) та швидкості розмноження клітин (n) за умов інкубації клітин з ранібізумабом в концентрації 50 мкг/мл. Значення цих показників наступне: μ = -0,013; td = -0,09; n = -0,040. Аналіз вищеназваних показників та порівняння їх з такими в інтактному контролі вказує на те, що ранібізумаб в концентрації 50 мкг/мл майже у 2,5 рази інгібує проліферативну та мітотичну активність клітин у тест-системі культури клітин лінії L929, що свідчить про суттєву антипроліферативну дію ранібізумабу. Одночасно на цих же препаратах підраховували кількість мітозів на 1000 клітин (‰), а також кількість гігантських полікаріоцитів на 1000 клітин (‰). Приклад 3. Об'єкт дослідження - на тест-система: асинхронна культура фібробластоподібних клітин (лінія L929), до якої після експлантації додавали пегаптніб у концентрації 25 мкл/мл; значущий параметр - кінетика росту клітин - в культурі при інкубації з силіконовою олією в об'ємі 25 мкл/мл, мітотична активність клітин та кількість інкубації з силіконовою полікаріоцитів у культурі клітин; методика визначення - визначення середньої щільності клітинної популяції на площі 2 препарату 0,05 мм на 1,2, 3, 4, 5 та 6 доби культивування та розрахунок на основі цих даних питомої швидкості росту (μ) культури (у фазі логарифмічного росту), часу подвоєння культури клітин (td) та швидкості розмноження клітин (n) за умов інкубації клітин з силіконовою олією в об'ємі 25 мкл/мл. Значення цих показників наступне: μ = -0,247; td = -0,171; n = -1,070. При порівнянні значень вказаних показників з контрольними та при інкубації клітин з силіконовою олією видно, що у другому випадку пригнічується мітотичний індекс, проліферація та зростає індекс полікаріоцитів, що є ознакою репродуктивної загибелі клітин тест-системи. 3 UA 76314 U 5 10 15 20 25 Таким чином, спосіб, який заявляється, є достатньо простим у застосуванні і демонструє значні можливості по виявленню змін в клітинах in vitro на різних етапах розвитку патологічного процесу в умовах впливу різних концентрацій речовин медичного призначення та фармакологічних препаратів, які використовуються в офтальмології. На підставі даних порівняльного аналізу показників, які характеризують клітинні реакції на засоби медичного призначення та фармакологічних препаратів для офтальмології, роблять висновок про їх антипроліферативні, цитотоксичні, апоптотичні властивості та резервні можливості клітин відносно підтримання гомеостазу. Джерела інформації. 1. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / под общ. ред. проф. Дьяконова Л.П. - М.: Изд-во «Спутник+», 2009. - 656 с. 2. L-929 (NCTC-clone 929, Clone of strain L) (Connective tissue, mouse) // http://www.viromed.com/services/product/1929.htm. 3. Zheng W., Primary culture of choroidal epithelial cells:characterization of an in vitro model of blood-CSF barrier / Zheng W, Zhao Q, Graziano JH. // In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1998 Jan; 34(1):40-5. 4. Погорелова О.С. Влияние различных комбинаций солей тяжелых металлов на структурную перестройку миокарда крыс зрелого возраста // Морфология. - 2007. - Т. 1, № 4. С. 71-76. 5. Головко Л.Л. Стан захисних систем організму за умов поєднаної дії солей кадмію і свинцю та нітриту натрію // Медична хімія. - 2004. - Т.6, № 3. - С. 176. 6. Патент на корисну модель № 65598, (51) МПК G01N1/50 (2006/01), Спосіб оцінки токсичності іонів важких металів у тест-системі культури клітин ссавців / Талько В.В., Сергієнко А.М., Чоботько Г.М., Власко О.В., Лавренчук Г.Й. зареєстрований в Державному реєстрі патентів України на корисні моделі 12.12.2011. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 35 40 45 Спосіб оцінки клітинних реакцій речовин медичного призначення та фармакологічних препаратів для офтальмології, що включає комплексне дослідження життєздатності клітин, який відрізняється тим, що проводять комплексне дослідження життєздатності клітин в динаміці (кінетика росту), розраховують за даними кінетики росту питому швидкість росту (μ) культури (у фазі логарифмічного росту), час подвоєння культури клітин (td) та швидкість розмноження клітин (n), порівнюють з контролем та розраховують за формулами:   ln X  ln Xo  t 1 , де X - кількість клітин через проміжок часу t (на 5-у добу культивування); Xo - кількість клітин на 1-у добу культивування; t - час спостереження, за даними питомої швидкості росту (μ) розраховують час подвоєння культури клітин (t): td  ln 2 /   0693  та швидкість розмноження клітин: n  3,32 logX / Xo  , де 2 X - кількість клітин на площі препарату 0,05 мм на 5-у добу культивування; 2 Xo - кількість клітин на площі препарату 0,05 мм на 1-у добу культивування, після чого оцінюють клітинні реакції речовин. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4