Спосіб одержання гібридних рослин несумісних видів баклажана роду solanum l

Реферат: Спосіб одержання гібридних рослин несумісних видів баклажана роду Solanum L. включає прямі схрещування між культурними і дикими формами баклажана in planta та виділення незрілих міжвидових гібридних насінин з плодів в умовах асептики. Потім здійснюють пророщування на агаризованому поживному середовищі. Гібридні насінини культивують на модифікованому поживному середовищі з додаванням ГК3 і НОцК в культурі in vitro до утворення пробіркових гібридних рослин. UA 79677 U (12) UA 79677 U UA 79677 U 5 10 15 20 25 30 Корисна модель належить до галузі сільського господарства, і може бути використана в генетиці і селекції баклажана (Solanum melongena L.) для покращення генофонду цієї овочевої рослини за рахунок інтрогресії зародкової плазми від диких та предкових форм, які є генетичними джерелами високої стійкості до біотичних і абіотичних стресів та відзначаються високим вмістом біологічно-цінних компонентів у плодах. Аналіз генеалогії сортів і гібридів баклажана, як закордонної так і вітчизняної селекції свідчить, що гени, які контролюють важливі господарсько-цінні ознаки знаходяться у зародковій плазмі віддалених і предкових форм, які у більшості випадків мають природні бар'єри несумісності з геномом культурних сортів. Досить ефективним методом подолання цих бар'єрів є застосування біотехнологічних методів вирощування незрілих зародків віддалених гібридних форм у культурі in vitro [1, 2]. Таким чином, у дослідах по ініціації проростання насіння культурних видів рослин було встановлено ряд спільних закономірностей в реалізації метаболічних процесів, пов'язаних з фітогормональною регуляцією цього процесу. При міжвидовому запиленні у формуванні насінин існує кілька періодів, під час яких можуть виявлятися бар'єри природної несумісності [3, 4]. У багатьох випадках загибель гібридних зародків відбувається на середніх і пізніх стадіях ембріогенезу. Часто це результат відсутності ендосперму або його аномальний розвиток, що викликає голодування зародку і абортування плоду, що розвивається. У цьому випадку вирощування ізольованих зародків найбільше перспективно на штучних середовищах, які мають необхідні поживні речовини, які in planta зародок недоотримує з тканин ендосперму [5]. Найбільш близьким за суттю до запропонованої корисної моделі є спосіб одержання фертильних амфідиплоїдних міжвидових гібридів гречки [6], який полягає у наступному: 1. Плоди вихідних форм на 12-14 день після запилення зривали і стерилізували 1 хвилину в 96 % етиловому спирті і 12 хвилин в 10 % хлораміну. 2. Виділяли з плодів незрілі зародки і розміщували їх для індукції морфогенезу на поживному середовищі Мурасиге-Скуга (МС) [7], модифікованому 0,2-0,5 мг/л БАП, 1,5-2,5 мг/л IOлК та 2,5-3,5 мг/л НОцК. 3. Дорощування та розмноження мікропагонів проводили на безгормональному поживному середовищі МС. Найближчим за складом компонентів до середовища, яке використовується у корисній моделі є пропис МС. Склад поживного середовища найближчого аналога наступний, мг/л: Компоненти мг/л Макроелементи: NH4NO3 1650 KNO3 1900 440 СаСl2 ×2Н2О 370 MgSO4 ×7H2O KН2РО4 170 Fe-хелат: 27,85 FeSO4 ×7H2O 37,25 Nа2ЕДТА ×2H2O Мікроелементи: Н3ВО3 6,2 24,1 MnSO4 ×5Н2О 8,6 ZnSO4 ×4H2O KJ 0,83 0,25 Na2MoO4 ×2H2O 0,025 CuSO4 ×5H2O 0,025 СоСl2 ×6H2O Вітаміни та інші біологічно-активні речовини: Мезоінозит 100 Гліцин 2,0 В1 0,1 B6 0,5 PP 0,5 Джерела вуглеводневого живлення: Сахароза, г/л 30 Агар, г/л 7 1 UA 79677 U рН 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 5,8 Основними недоліками даного способу є те, що: розроблене середовище не може бути використаним при культивуванні гібридного насіння баклажана, так як потреби ізольованого in vitro зародка в елементах живлення визначаються видовими особливостями рослинних об'єктів; рекомендовані строки вилучення незрілого насіння гречки (12-14 день) не ефективні для баклажана, так як швидкість і тривалість диференціації зародків цих культур мають значні відмінності. Задачею корисної моделі є одержання фертильних міжвидових гібридів між культурною формою (S. melongena) та дикими видами баклажана після застосування методу культивування недозрілих гібридних зародків in vitro. Поставлена задача вирішується наступним чином: 1) з запилених пилком диких форм материнських рослин баклажана на 20-25 день відокремлювали плоди; 2) недозрілі плоди промивали водопровідною водою з додаванням миючого засобу і занурювали на 3 хвилини для стерилізації у розчин гіпохлориду натрію у концентрації 30 %, далі плоди в стерильних умовах ламінарного боксу занурювали дворазово у 96 % етанол і після чого опалювали над спиртівкою, для додаткової стерилізації зовнішньої тканини; 3) простерилізовані плоди розрізали навпіл скальпелем, після чого з них вилучали незрілі насінини, відокремлюючи від них насіннєві оболонки; 4) насінини розмішували на випробувальне поживне середовище МС, модифіковане регуляторами росту: 0,1 мг/л НОцК (нафтилоцтва кислота) та 0,1 мг/л ГК3 (гіберелова кислота) для ініціації їх проростання; 5) культивування незрілих насінин проводили протягом 3 тижнів за температури 22-23 °C, фотоперіоду 16 год. освітлення, 8 год. темноти та інтенсивності освітлення - 2 тис. люкс; 6) отримані проростки підрощували, а перед висадкою у ґрунтові умови пробіркові рослини висотою 50-70 мм з добре розвиненою кореневою системою адаптували згідно із загальноприйнятими біотехнологічними методами [8]. Приклад. В таблиці 1 наведено дані щодо ефективності використання модифікованого поживного середовища МС з додаванням 0,1 мг/л ГК3 і 0,1 мг/л НОК (МСмод1) для ініціації росту міжвидових гібридних зародків баклажана. Як контроль використали агаризоване безгормональне середовище МС. Для проведення біотестів запропонованого способу подолання постгамної несумісності баклажана застосовувалися наступні рослинні об'єкти: 1) культурна форма - S. melongena L. (сорт Алмаз); 2) дикий вид - S. macrocarpon L.; 3) дикий вид - S. aethiopicum gr. Gilo; 4) дикий вид - S. integrifolium L.; 5) дикий вид - S. linnaeum L.; 6) дикий вид - S. sisimbrifolium L. У процесі випробувань поживних середовищ нами була виявлена залежність між проростанням насіннєвих зародків та їх стадією розвитку (табл. 1). Найбільш диференційовані зародки, з яких вдалося одержати пробіркові рослини були віком 20-25 діб. За цього строку ізоляції у всіх 4 використаних гібридних комбінаціях отримано проростки у кількості 223 шт. При застосуванні середовища МСмод1 формування проростків спостерігали з частотою утворення 67,7-98,7 %, одержаних від схрещування: ♀ S. melongena x ♂ S. aethiopicum gr. Gilo; ♀ S. melongena x ♂ S. integrifolium; ♀ S. melongena x ♂ S. sisimbrifolium; ♀ S. melongena x ♂ S. linnaeum. Це є свідченням того факту, що застосоване нами середовище є досить збалансованим по елементам трофічного і гормонального живлення для дозрівання незрілого насіння міжвидових гібридів. При ізоляції 15-денних гібридних насінин, одержаних від інших комбінацій схрещування несумісних видів баклажана частота формування проростків в культурі in vitro значно зменшувалась 27,3-33,3 %. Виділення гібридних насінин на 30 добу після запилення мало певні складнощі, оскільки їх насіннєва оболонка на той час вже була достатньо сформована і її було важко надрізувати скальпелем. З даних таблиці видно, що відсоток виходу гібридних зародків, які були здатні проростати, долаючи самостійно насіннєву оболонку на 30 добу культивування становив 50,054,5 % відповідно. 2 UA 79677 U 5 Таким чином, неоднозначність реакції гібридних зародків на застосовані умови культивування in vitro обумовлена різними строками їх ізоляції та генотипом. Найкращі результати по їх дорощуванню було одержано при застосуванні середовища МСмод1, а застосування технологічного прийому ізолювання зиготичних зародків від насіннєвої оболонки значно підвищило їх життєздатність і інтенсивність росту в культурі in vitro. Зафіксовано ріст та розвиток проростків з формуванням із них повноцінної пробіркової рослини із кореневою системою. Таблиця Залежність проростання насіннєвих зародків міжвидових гібридів від віку плодів на різних модифікаціях поживного середовища МС Поживне середовище МС (контроль) МСмод1 Кількість Кількість Кількість Кількість Кількість Комбінації схрещувань Кількість пророслих насінин висаджених пророслих насінин насінин із висаджених насінин із насінин, калюсом, насінин, шт. калюсом, шт. % шт. % шт. % % через 15 діб після запилення ♀ S. melongena х ♂ S. 11 0 0 5,5 11 0 0 90,9 mасrосаrроn ♀ S. melongena x ♂ S. 18 0 0 11,1 18 6 33,3 61,1 aethiopicum gr. Gilo ♀ S. melongena x ♂ S. 11 0 0 9,1 11 3 27,3 54,5 integrifolium через 20-25 діб після запилення ♀ S. melongena x ♂ S. 173 0 0 12,1 173 169 97,7 13,87 aethiopicum gr. Gilo ♀ S. melongena x ♂ S. 11 0 0 9,1 11 10 90,9 22,2 integrifolium ♀ S. melongena x ♂ S. 25 0 0 20,0 25 18 72,0 48,0 sisimbrifolium ♀ S. melongena x ♂ S. 39 0 0 12,8 39 26 66,7 53,84 linnaeum через 30 діб після запилення ♀ S. melongena x ♂ S. 18 0 0 9,1 18 9 50,0 11,11 aethiopicum gr. Gilo ♀ S. melongena x ♂ S. 11 0 0 9,1 11 6 54,5 22,2 integrifolium 10 15 20 25 Джерела інформації: 1. Stanys V. In vitro culture in plant breeding. Variability and stability: Abstract of habilitative doctor thesis. - LUA, 1996. - 81 p. 2. Обручаева Н.В., Антипова О.В. Физиология инициации прорастания семян // Физиология растений.-1997. - Т. 44, № 2. - С. 287 - 302. 3. Ramming D.V. In ovulo embryo culture in early maturing Prunus // Hort. Science. - 1990. Vol. 25, № 4. - P. 393-398. 4. Howarth C. The Heat-shock Proteins in Sorghum bicolor and Pennisetum amercanum. II Stored RNA in sorghum seeds and its relationship to heat shock protein synthesis during germination // Plant Cell Environm.-1990. - V. 13, № 1. - P. 57-64. 5. Helm K., Abernethy R. The heat shock protein and their mRNAs in dry and early embryos of wheat // Plant Physiol.-1990. - V. 93, № 4. - P. 1626-1633. 6. Пат. 51690Україна, МПК А01Н 1/08. Спосіб одержання фертильних амфідиплоїдних міжвидових гібридів гречки / Рубцова М.О., Левенко Б.О., Тараненко Л.К.; заявник та патентовласник Інститут фізіології рослин і генетики НААНУ. № 98074048; заявл. 23.07.1998; опубл. 16.12.2002, Бюл. № 1. 7. Murashige Т., Skoog F.A. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant.-1962. - V. 15. - P. 473-497. 3 UA 79677 U 8. Методика досліджень в культурі ізольованих тканин овочевих рослин / [В.П. Мірошніченко, О.Ф. Сергієнко, Т.В. Івченко та ін.]. - Мерефа: IOБ УААН, 2004. - 25 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб одержання гібридних рослин несумісних видів баклажана роду Solanum L., що включає прямі схрещування між культурними (материнська форма) і дикими формами баклажана (батьківська форма) in planta, виділення незрілих міжвидових гібридних насінин з плодів в умовах асептики, пророщування на агаризованому поживному середовищі, який відрізняється тим, що гібридні насінини 20-25-денного віку культивують на модифікованому поживному середовищі МС з додаванням 0,1 мг/л ГК3 і 0,1 мг/л НОцК (МСмод1) в культурі in vitro до утворення пробіркових гібридних рослин. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4