Спосіб визначення життєздатності збудників туберкульозу при апробації дезінфектантів як туберкулоцидів

Реферат: UA 80144 U UA 80144 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі ветеринарної мікробіології і може бути використана для визначення бактерицидних властивостей дезінфікуючих препаратів щодо збудників туберкульозу сільськогосподарських тварин М. bovis та птиці М. avium виробниками препаратів, ветеринарними і медичними лабораторіями, учбовими і науково-дослідними інститутами. Відомий спосіб визначення життєздатності збудників кокцидіозу курей при вивченні дезінвазійних властивостей нових дезінфікуючих препаратів [Патент № 50748 Україна, від 25.06.2010, МПК G01N 33/00. "Спосіб визначення життєздатності збудників кокцидіозу курей при скринінгу хімічних препаратів як дезінвазійних засобів"]. Даний спосіб не передбачає визначення життєздатності збудників інфекційних захворювань сільськогосподарських тварин і птиці, що мають бактеріальну етіологію. Існує спосіб, що передбачає вивчення спектру бактерицидних властивостей нових дезінфектантів щодо мікобактерій [Патент № 60299 Україна, від 10.06.2011, МПК G01N 33/50. "Спосіб визначення спектру туберкулоцидних властивостей дезінфектантів"]. Недоліком даного способу є те, що він передбачає застосування лише атипових мікобактерій, і не регламентує проведення дослідів щодо М. bovis та М. avium, які є основними збудниками туберкульозу сільськогосподарських тварин і птиці. Для вивчення бактерицидних властивостей нових дезінфікуючих засобів щодо мікобактерій керуються методичними рекомендаціями "Визначення бактерицидних властивостей дезінфікуючих засобів, проведення дезінфекції та контроль її якості при туберкульозі сільськогосподарських тварин" (Затв. наук.-метод. радою Держ. комітету вет. мед. України 20.12.2007 р.). За цим способом накопичують бактеріальну масу збудників туберкульозу, готують завись в концентрації два мільярди мікробних клітин, контамінують мікобактеріями тестоб'єкти та проводять їх обробку розчинами дезінфектантів, центрифугують змиви з тест-об'єктів та проводять біопробу. Це рішення може бути прототипом. Недоліком цього способу є те, що він не передбачає визначення життєздатності збудника туберкульозу М. avium після дії деззасобів, а при визначенні життєздатності збудника туберкульозу М. bovis регламентує проведення біопроби лише після дії досліджуваного препарату і передбачає формування лише однієї контрольної групи тварин, без урахування визначення життєздатності мікобактерій після дії еталонного препарату, що робить отримані результати недостовірними та неповними. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення життєздатності збудників туберкульозу М. bovis та М. avium при апробації дезінфектантів як туберкулоцидів, що включає накопичення бактеріальної маси збудників туберкульозу, приготування зависі в концентрації два мільярди мікробних клітин, контамінацію мікобактеріями тест-об'єктів, їх обробку розчинами дезінфектантів, центрифугування та проведення біологічного дослідження шляхом проведення біопроби за допомогою формування окремо 4-х груп лабораторних тварин для кожного збудника туберкульозу щоб забезпечити ефективність способу. Порівняльний аналіз із прототипом показує, що спосіб, який заявляється, відрізняється від існуючого проведенням широкого біологічного дослідження бактерицидної дії дезінфектантів щодо збудника туберкульозу птиці, об'єктивністю визначення життєздатності культур мікобактерій М. bovis завдяки використанню тест-культури М. avium та формуванням додатково контрольних груп лабораторних тварин, що дозволяє отримати більш достовірні результати. Спосіб виконується таким чином: Визначення бактерицидної дії дезінфікуючого препарату здійснюють щодо збудників туберкульозу М. bovis та М. avium, які вирощують на середовищі Павловського за температури 37 °C протягом відповідно 30-45 та 14-21 доби. З вирощених тест-культур мікобактерій готують 3 завись в концентрації два мільярди бактеріальних тіл в 1 см фізіологічного розчину. У стерильному боксі розміщують металеві емальовані кювети з тест-об'єктами: батистові полоси, дерев'яні бруски, кахель, металеві та скляні пластини. На дослідні та контрольні тест-об'єкти наносять суміш зависі тест-культур окремо М. bovis та М. avium і стерильної гноївки з розрахунку на 1 см двомільярдної зависі мікобактерій 0,5 см 3 гноївки. Суміш в об'ємі 1,5 см рівномірно розподіляють на поверхні кожного тест-об'єкту. Висушування тест-культур на тест-об'єктах здійснюють за кімнатної температури протягом 24 годин. Потім кожний дослідний тест-об'єкт обробляють розчином випробуваного дезінфектанту шляхом рівномірного його нанесення. На контрольні тест-об'єкти наносять окремо стерильний фізіологічний розчин (позитивний контроль) та 3 % лужний розчин формальдегіду (негативний контроль). Після закінчення експозиції дії дезінфікуючого препарату з кожного дослідного та контрольного тест-об'єктів роблять змиви стерильним фізіологічним розчином у стерильні 1 UA 80144 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 чашки Петрі, вміст яких потім центрифугують за режиму 3000 об/хв. протягом 30 хвилин. Осад, що утворився після центрифугування, двічі відмивають на центрифузі стерильним фізіологічним розчином за 3000 об/хв. протягом 30 хвилин. Одну частину зависі осаду з дослідних та контрольних проб висівають на поживне середовище для культивування мікобактерій. Пробірки з висівами витримують у термостаті за температури 37 °C протягом 3 місяців та проводять облік росту посівів кожні 5-7 діб. Другу частину зависі осаду з дослідних та контрольних проб використовують для проведення біологічного дослідження (біопроби). Біопробу з тест-культурою М. bovis проводять на 20 здорових (5 дослідних і 15 контрольних) морських свинках масою 300-350 г. Морським свинкам дослідної групи роздільно вводять під 3 шкіру, в ділянці паху, в дозі 1 см суспензію осаду, який одержали після центрифугування змивів з дослідних тест-об'єктів. Першій та другій контрольним групам тварин окремо вводять під 3 шкіру, в ділянці паху, в дозі 1 см суспензію осаду, який одержали після центрифугування змивів з контрольних тест-об'єктів (позитивний контроль) та (негативний контроль) відповідно. Третя контрольна група лабораторних тварин - інтактна. Біопробу з тест-культурою М. avium проводять на 12 здорових (3 дослідних і 9 контрольних) 3 кролях масою 2-2,5 кг. Кролям дослідної групи роздільно внутрішньовенно вводять в дозі 1 см суспензію осаду, який одержали після центрифугування змивів з дослідних тест-об'єктів. Першій 3 та другій контрольним групам тварин окремо вводять внутрішньовенно в дозі 1 см суспензію осаду, який одержали після центрифугування змивів з контрольних тест-об'єктів (позитивний контроль) та (негативний контроль) відповідно. Третя контрольна група лабораторних тварин інтактна. За лабораторними тваринами ведуть спостереження протягом трьох місяців і один раз на місяць досліджують алергічним методом з використанням туберкуліну ППД для ссавців та птиці відповідно в дозі 25 М.О. Тварин, загиблих під час досліду та підданих евтаназії після його завершення, досліджують патологоанатомічним та бактеріологічним методами на туберкульоз. Приклад 1. За вищезазначеним способом визначали життєздатність збудників туберкульозу М. bovis і М. avium при апробації дезінфектанту "Гексадекон". Приклад 2. За вищезазначеним способом визначали життєздатність збудників туберкульозу М. bovis і М. avium при апробації дезінфектанту "ВетОкс 1000". Результати досліджень наведені в таблиці 1 і 2. З матеріалів таблиці 1 видно, що дезінфікуючий препарат "Гексадекон" при дії в концентрації 2,0 % за експозиції 5 годин і в концентрації 3,0 % за експозиції 3 години не пливає на життєздатність культур М. bovis та М. avium. Препарат повністю знезаражує тест-об'єкти, контаміновані збудниками туберкульозу при застосуванні в концентрації 2,0 % за експозиції 24 години і в концентрації 3,0 % за експозиції 5 годин. Препарат "ВетОкс 1000" в концентрації 4,0-5,0 % за експозиції 5-24 години не знищує збудників туберкульозу М. bovis та М. avium. Еталонний дезінфікуючий препарат 3,0 % лужний розчин формальдегіду дії на М. bovis та М. avium бактерицидно за експозиції 24 години. З матеріалів таблиці 2 видно, що в дослідах з препаратом "Гексадекон" протягом досліду (90 днів) реакції на внутрішньошкірне введення туберкуліну ППД для ссавців спостерігали лише у морських свинок першої контрольної (позитивний контроль) групи тварин. При патологоанатомічному дослідженні дослідних і контрольних тварин характерні для туберкульозу ураження були виявлені у морських свинок лише першої контрольної групи. Культуральним дослідженням патологічного матеріалу, відібраного від дослідних та контрольних тварин збудник туберкульозу М. bovis був виділений від тварин першої контрольної групи. В біопробі з культурою М. avium встановлено, що кролі першої контрольної (позитивний контроль) групи загинули на 18-25 добу після зараження від септичної форми туберкульозу. Тварини дослідної групи та 2 і 3 контрольних груп не реагували на внутрішньошкірне введення туберкуліну ППД для птиці, а через 90 днів у внутрішніх органах у жодному випадку туберкульозних уражень не виявили. Отримані результати засвідчують про наявність бактерицидних властивостей у препарату "Гексадекон" (2,0 % - 24 години). В дослідах з препаратом "ВетОкс 1000" протягом досліду (90 днів) реакції на внутрішньошкірне введення туберкуліну ППД для ссавців спостерігали у морських свинок дослідної і першої контрольної (позитивний контроль) груп тварин. При патологоанатомічному дослідженні лабораторних тварин характерні для туберкульозу ураження були виявлені у морських свинок як дослідної так і першої контрольної груп. Культуральним дослідженням патологічного матеріалу, відібраного від дослідних та контрольних тварин збудник туберкульозу М. bovis був виділений від тварин дослідної та першої контрольної групи. В біопробі з культурою 2 UA 80144 U 5 10 М. avium встановлено, що кролі дослідної та першої контрольної (позитивний контроль) груп загинули на 17-25 добу після зараження від септичної форми туберкульозу. Тварини 2 і 3 контрольних груп не реагували на внутрішньошкірне введення туберкуліну ППД для птиці, а через 90 днів у внутрішніх органах у жодному випадку туберкульозних уражень не виявили. Отримані результати засвідчують про відсутність туберкулоцидних властивостей у препарату "ВетОкс 1000" (5,0 % - 24 години). Запропонований спосіб визначення життєздатності збудників туберкульозу М. bovis та М. avium при апробації дезінфектантів як туберкулоцидів володіє конкретною спрямованістю та зручністю проведення дослідів, що дозволяє отримувати достовірні результати визначення життєздатності мікобактерій після дії дезінфектантів та використовувати в якості тест-культур збудників туберкульозу сільськогосподарських тварин М. bovis та птиці М. avium. Таблиця 1 Режим застосування дерево 2,0 % - 5 год. 2,0 % - 24 год. 3,0 % - 3 год. 3,0 % - 5 год. + + 4,0 % - 24 год. 5,0 % - 5 год. 5,0 % - 24 год. + + + 3,0 % - 24 год. Тест-об'єкт, контамінований мікобактеріями батист метал кахель "Гексадекон" + + + + + + "ВетОкс 1000" + + + + + + + + + Лужний розчин формальдегіду скло + + + + Примітка: "+" - наявність росту; "-" - відсутність росту тест-культури. Таблиця 2 Препарат Культура Гексадекон 2,0 % - 24 год. М. bovis ВетОкс 1000 5,0 % - 24 год. М. bovis Група тварин дослід контроль 1 контроль 2 контроль 3 дослід контроль 1 контроль 2 контроль 3 дослід контроль 1 контроль 2 контроль 3 дослід контроль 1 контроль 2 контроль 3 Метод дослідження алергічний патологоанатомічний культуральний + + + + + + + + + + + + + + + Примітка: "-" - результат негативний; "+" - результат позитивний. 3 UA 80144 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб визначення життєздатності збудників туберкульозу при апробації дезінфектантів як туберкулоцидів, що включає накопичення бактеріальної маси мікобактерій М. bovis та М. avium, приготування двомільярдної зависі культур мікобактерій, дію на них розчинів дезінфікуючого препарату, центрифугування, проведення біопроби, який відрізняється тим, що здійснюють біопробу з використанням тест-культур М. bovis та М. avium за допомогою формування 4-х груп: 1 - дослідна, якій інокулюють завись після дії дезінфектанту, 2 - контрольна, яку заражають живою культурою збудника туберкульозу (позитивний контроль), 3 - контрольна, якій інокулюють завись після дії еталонного дезінфектанту (негативний контроль), 4 - контрольна інтактна група. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4