Спосіб прогнозування виникнення захворювання нирок

Реферат: Спосіб прогнозування виникнення захворювання нирок включає дослідження HLA-фенотипу за антигенами локусів А і В. Проводять типування лімфоцитів крові і за наявності у дорослих осіб антигенів-провокаторів А10, А11, В14, В16 та В17 прогнозують схильність до розвитку пієлонефриту, а - А23, А24, А28, А29, В8, 38, 44 - хронічного гломерулонефриту з нефротичним синдромом. UA 80829 U (12) UA 80829 U UA 80829 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до нефрології, і може бути використана для визначення факторів ризику розвитку хвороб нирок, а саме пієлонефриту та хронічного гломерулонефриту з нефротичним синдромом. Антигенам головного комплексу гістосумісності (HLA), які забезпечують функціональну взаємодію практично всіх імунокомпетентних клітин, належить важлива роль в підвищенні ризику певних захворювань, і пошук генетичних основ схильності дозволив розкрити деякі механізми, які пояснюють зв'язок системи HLA з захворюваннями, в тому числі через кореляцію між певними генами цього комплексу і станом імунітету. Виявлення таких асоціацій може сприяти розробці методів профілактики і лікування захворювань нирок. Взаємозв'язок системи HLA з захворюваннями базується як на генетичній детермінованості (зчепленості), так і на генетичній асоціації. В першому випадку "патологічний" і ген має істинне зчеплення з HLA комплексом, тобто локалізується в тій самій хромосомі. Проте, найчастіше зв'язок HLA і захворювань проявляється в формі асоціацій, в цьому випадку говорять лише про схильність до патології. Причому, один ген може мати досить сильний зв'язок з одним захворюванням і слабкий з іншим. Відомий спосіб прогнозування розвитку патологій (1), що включає виявлення зв'язку HLAантигенів і ряду захворювань (анкілозуючий спондиліт, синдром Рейтера, синдром Шегрена та ін.), коли використовують показник відносного ризику захворювання RR, який дозволяє визначити ступінь ризику розвитку захворювання у носіїв антигену HLA в порівнянні з індивідами, що не несуть даний антиген. Дослідники передбачають цілий ряд механізмів, за допомогою яких гени, які контролюють імунну відповідь, здатні контролювати схильність або стійкість до захворювання, в тому числі хвороб нирок, за участю як аутоімунних, так і імунодефіцитних причин - наприклад, надто слабка реакція на бактеріальний антиген у нирці з незадовільною його елімінацією сприяє виникненню пієлонефриту. Недоліком цього способу є те, що він не враховує асоціації з патологією нирок всіх відомих на сьогодні антигенів різних локусів, а саме А і В, в тому числі при порівнянні хворих з інфекційним та аутоімунним походженням захворювань нирок. Відомий також спосіб визначення частоти HLA-A та В антигенів у хворих на гломерулонефрит (2), взятий нами за прототип, що включає дослідження HLA-фенотипу за антигенами локусів А і В при тестуванні дітей західноєвропейської популяції з хронічним гломерулонефритом та виявлення більшої частоти HLA-B12 в порівнянні з контрольною групою здорових дітей, у яких В12 рецидив захворювання був частішим, ніж в групі без цього антигену. Недоліком способу є те, що не визначені антигени-провокатори та протектори захворювань нирок для дорослих осіб в українській популяції (в той час як імуногенетики вважають необхідним визначати асоціації між системою HLA і патологічними станом в рамках популяцій і етнічних груп, частота розподілу антигенів, в яких може суттєво відрізнятися). В основі корисної моделі поставлена задача вдосконалити спосіб прогнозування виникнення захворювання нирок шляхом типування лімфоцитів крові у дорослих осіб української популяції та за наявністю у особи антигенів-провокаторів А10, А11, В14, В16 та В17 прогнозують схильність до розвитку пієлонефриту, а - А23, А24, А28, А29, В8, 38, 44 - хронічного гломерулонефриту з нефротичним синдромом. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб прогнозування виникнення захворювання нирок, що включає дослідження HLA-фенотипу за антигенами локусів А і В, згідно з винаходом, проводять типування лімфоцитів крові і за наявності у дорослих осіб антигенів-провокаторів А10, А11, В14, В16 та В17 прогнозують схильність до розвитку пієлонефриту, а - А23, А24, А28, А29, В8, 38, 44 - хронічного гломерулонефриту з нефротичним синдромом. Спосіб прогнозування виникнення захворювання нирок (пієлонефриту та/чи гломерулонефриту) виконують наступним чином: HLA-фенотип хворих визначають за методом стандартного лімфоцитотоксичного тесту на планшетах Терасакі з застосуванням спеціальної панелі анти-HLA сироваток. Лімфоцити периферичної крові вилучають за методом А. Воуum. Забір крові об'ємом 5-10 мл здійснюють шляхом венепункції у скляні силіконовані пробірки, які містять розчин гепарину, розведеного середовищем 199 у відношенні 1:9, або антикоагулянт ЕДТА. Об'єм венозної крові розводять середовищем 199 у співвідношенні 1:1, м'яко пікетують для одержання однорідної консистенції розчину й акуратно нашаровують на розчин фікол-верографіну (β=1,077). Увесь об'єм розведеної венозної крові (10-20 мл) нашаровують на фікол-верографін, розлитий у дві центрифужні пробірки об'ємом 4-5 мл. Після центрифугування за швидкості 1500 об/хв на центрифузі ОПН-3 протягом 25 хвилин акуратно відбирають пастерівською піпеткою весь лімфоцитарний шар в інтерфазі та обробляють 0,83 % розчином NH4Cl протягом 10 хвилин для повного лізису еритроцитів. Одержані лімфоцити відмивають двічі середовищем 199 в об'ємі 8 1 UA 80829 U 5 10 15 20 25 30 35 10 мл, центрифугуючи 10 хвилин за V=1500 об/хв. Одержаний лімфоцитарний осад розводять 3-5 мл середовища 199. Клітини підраховують у камері Горяєва та доводять до концентрації 2410 в 1 мл. HLA-фенотип хворих визначають за стандартним методом лімфоцитотоксичного тесту на планшетах Терасакі із застосуванням спеціальної панелі анти- HLA сироваток. Гістотипуючі сироватки розкапують в лунки планшетів Терасакі під вазелінове масло по 1 мкл та зберігають при t=-20 °C. Лімфоцитарну суміш мікрошприцом закапують у планшетки по 1 мкл в кожну лунку та інкубують при t+37 °C 30 хвилин. Потім у кожну лунку добавляють по 5 мкл кролячого комплементу та витримують 1 годину при t+37 °C. Після інкубації вазелін витрушують і в кожну лунку закапують по 3 мкл 5 % трипанового синього, через 3 хвилини закапують 5 мкл 40 % формальдегіду та через 15 хвилин під мікроскопом проводять облік інтенсивності цитотоксичної реакції. Антигени локусу HLA-DR визначають у пролонгованому тесті комплементзалежної лімфоцитотоксичності з попереднім збагаченням завису мононуклеарів Влімфоцитами на колонках з нейлонової вати. Результати реакції трактують шляхом підрахунку % "мертвих" (профарбованих) лімфоцитів в кожній лунці. Інтерпретація результатів реакції. 0-15 % "мертвих"- негативний результат; 16-20 % - " - слабо позитивний результат (+); 21-50 % - " - позитивний результат (+ +); 51-75 % - " - виражений позитивний результат (+ + +); 76-100 % - " - різко позитивний результат ( + + + +). Апробація способу, що заявляється, проведена у відділі нефрології та діалізу і лабораторії імунології ДУ "Інститут нефрології НАМН України" та відділі імунології ДУ "Інститут урології НАМН України" у 55 пацієнтів віком від 27 до 48 років з попереднім діагнозом гломерулонефрит, який підтверджений через проведення нефробіопсії. Проаналізовані фенотипи в групі 45 хворих з підтвердженим діагнозом гломерулонефриту. Якщо в трупі здорових (350 осіб) за локусом А у 16 % присутні антигени-провокатори (А23, А24, А28, А29), то в аналізованій групі - у 62 % (у 28 пацієнтів) і різниця достовірна (р0,05). За локусом В такі антигени (В8, 38, 44) у здорових визначені в 14 % випадків порівняно з 51 % (23 пацієнта) у хворих на ГН і різниця достовірна (р0,05). Частота зустрічальності HLA-А антигенів та критерій відносного ризику (RR) у хворих на пієлонефрит та гломерулонефрит в порівнянні з контрольними групами здорових донорів (К1 та К2) представлені в таблиці 1. Так, у хворих на пієлонефрит виявлено достовірне підвищення частоти HLA-A10 майже в 2 рази та A11 (35,4 % в порівнянні з 11,4 % у здорових, р