Спосіб адаптації мікроклонів винограду до умов in vivo

Реферат: Спосіб адаптації мікроклонів винограду до умов in vivo включає вирощування мікроклонів в умовах in vitro на агаризованому поживному середовищі, їх мікрочубукування, висаджування та дорощування мікроклональних рослин у шкілці захищеного грунту. На першому етапі адаптації, упродовж 5-7 днів проводять пристосування рослин до зниженої вологості повітря, обприскуючи вегетативну масу рослин розчином антитранспірантів та відкриваючи кришечки ємкостей на 510 хв., з кожним днем збільшуючи експозицію. На другому етапі мікроклони пересаджують на субстрати та повторно обприскують розчином антитранспірантів. UA 85881 U (54) СПОСІБ АДАПТАЦІЇ МІКРОКЛОНІВ ВИНОГРАДУ ДО УМОВ IN VIVO UA 85881 U UA 85881 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільського господарства, зокрема виноградного розсадництва для вирощування саджанців винограду з використанням методів культури тканин in vitro. Загальна схема клонального мікророзмноження рослин включає наступні етапи: відбір і стерилізація первинних експлантів, введення експлантів у культуру in vitro, проліферація бруньок та індукція розвитку пагонів, укорінення та розмноження мікроклонів на поживних середовищах і іонообмінних субстратах, адаптація рослин до умов in vivo. Найбільш відповідальним етапом у цій технології є адаптація мікроклональних рослин до нестерильних умов довкілля. Саме на цьому етапі спостерігається високий відсоток рослин, які гинуть. За деякими даними тільки 25 % регенерованих мікроклонів успішно приживаються у нестерильних умовах. Як прототип вибрано спосіб адаптації, який поєднує етапи адаптації та мікрочубукування, шляхом вирощування мікроклонів у закритих ємностях діаметром 5,0-5,5 см з об'ємом 3 поживного субстрату 45-50 см . Як поживний субстрат використовують суміш іонообмінного субстрату "Біона" і цеоліту у співвідношенні 3:1. Адаптацію мікроклонів винограду на цьому поживному субстраті проводять шляхом поступового розкривання кришечок ємностей протягом 8-10 днів. (Деклараційний патент України на корисну модель № UA 19053 U "Спосіб цілорічного вирощування садивного матеріалу рослин". A01G 1/00, A01G 31/00). Спільними ознаками відомих рішень та заявленого винаходу є такі: вирощування мікроклонів в умовах in vitro на агаризованому поживному середовищі, пересаджування на субстрати, вирощування до стандартних розмірів на цеоліті в умовах теплиці. Недоліком найближчого аналога є те, що у рослин, адаптованих за вказаним способом, утворюються витягнуті, тонкі пагони, так як простір для розвитку рослин обмежений стінками ємності, спостерігається недостатній розвиток листкового апарата, формуються нефункціональні продихи, недосконалий судинний зв'язок між коренем і пагоном. Такі особливості будови мікроклонів призводять до високого рівня транспірації листків рослин, та як наслідок, до їх інтенсивного зневоднення і в'янення. Крім цього, іонообмінний субстрат "Біона" в Україні не виробляється і відповідно виникають труднощі з його придбанням. В основу корисної моделі поставлена задача на основі застосування препаратів групи антитранспірантів, поживних торф'яних субстратів та гідроабсорбентів вдосконалити спосіб адаптації мікроклонів винограду, з метою підвищення їх життєздатності, приживлюваності в умовах in vivo та виходу стандартних саджанців. Технічний результат корисної моделі виражається у збільшенні кількості життєздатних мікроклонів винограду з добре розвиненою вегетативною масою та кореневою системою, підвищенні їх приживлюваності в умовах in vivo та збільшенні виходу стандартних саджанців із шкілки з покращеними якісними показниками. Поставлена задача вирішується тим, що у способі адаптації мікроклонів винограду до умов in vivo, який передбачає вирощування мікроклонів в умовах in vitro на агаризованому поживному середовищі, їх мікрочубукування, висаджування та дорощування мікроклональних рослин у шкілці знищеного ґрунту, згідно з корисною моделлю, на першому етапі адаптації (упродовж 5-7 днів) проводять пристосування рослин до зниженої вологості повітря шляхом відкривання кришечок культуральних ємкостей на 5-10 хв., з кожним днем збільшуючи експозицію. Перед першим відкриванням ємкостей проводять обприскування вегетативної маси рослин розчином антитранспірантів - ЕПАА 0,4 % або Vapor Gard 0,3 %. На другому етапі - проводять пересаджування мікроклонів на поживні субстрати: кокосовий субстрат + агроперліт (1:1) + теравет (3:1), кокосовий субстрат + вермикуліт (1:1) + теоавет (3:1), торф сфагнум + вермикуліт (1:1) та проводять повторне обприскування антитранспірантами. Протягом наступних 25-30 днів їх культивують у адаптаційних кімнатах, після чого висаджують у шкілку захищеного ґрунту. Поживний субстрат, який складається із кокосового торфу, агроперліту, вермикуліту та теравету характеризується ідеальною капілярною системою, стерильністю, високою вологозатримуючою здатністю, повітроємкістю, гідрофільністю та стійкістю до окислення. Містить окисли таких мікроелементів як кальцій, магній, калій, алюміній, залізо, кремній. Теравет - препарат групи гідроабсорбентів, який у сухому стані являє собою кристали, які після зволоження поглинають воду та утворюють желеподібну масу. Обплітаючи коренями насичені водою кристали рослина у будь-який момент часу може взяти рівно стільки води, скільки їй необхідно в даний період розвитку. Препарат Vapor Gard відносять до групи антитранспірантів. Діючими речовинами є пінолін та емульгатор. Після нанесення на рослину препарат під впливом світла формує напівпроникну, прозору плівку, завдяки якій зменшується транспірація та вплив стресу після висаджування рослин у ґрунт. Препарат ЕПАА - біологічний гель, створений на основі мікробних полісахаридів. Препарат також утворює міцні плівки на рослинах, фіксує корисну для рослин 1 UA 85881 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мікрофлору, допомагає рослинам переносити стреси, стимулює ріст рослин. Препарат виготовлений в Інституті мікробіології і вірусології НАН України. Спосіб здійснюють таким чином. Восени заготовляють лозу з кущів, які пройшли тестування на відсутність вірусної і бактеріальної інфекції. Лозу стерилізують, нарізають на 2-3-х вічкові чубуки і із сплячих вічок виганяють зелені пагони. Із них відбирають ініціальні експланти і вводять у культуру in vitro на поживні агарові середовища. Мікроклони вирощують у культуральних боксах при температурі 25-26 °C, освітленні 3,0-3,5 тис. лк та розмножують шляхом мікрочубукування [Голодрыга П.Я. и др. Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда. - Ялта: ВНИИВ, 1986. – 56 с]. Для адаптації відбирають мікроклони винограду висотою 4-5 см, які мають по 3-5 листочки, добре розвинену кореневу систему, без калусних утворень. Перший етап адаптації проводять в умовах культурального боксу впродовж 5-7 днів. При цьому пристосовують рослин до зниженої вологості повітря шляхом відкривання кришечок ємкостей на 5-10 хв., з кожним днем збільшуючи експозицію. Перед першим відкриванням кришечок проводять обприскування рослин розчинами антитранспірантів - Vapor Gard (0,5 %) та ЕПАА (0,4 %) і поверхню поживного середовища зволожують дистильованою автоклавованою водою. На другому етапі адаптації мікроклони переміщують до адаптаційних кімнат, де рослини знаходяться на поживних середовищах із відкритими кришечками культуральних ємкостей ще протягом 3-5 днів. Далі мікроклони виноград пересаджують на поживні субстрати: кокосовий субстрат+агроперліт (1:1)+теравет (3:1), кокосовий субстрат+вермикуліт (1:1)+ теравет (3:1), торф сфагнум+вермикуліт (1:1) і повторно обробляють антитранспірантами. Адаптація мікроклонів у адаптаційних кімнатах триває 20-25 днів, після чого рослини висаджують на мінеральний цеолітовий субстрат у шкілку захищеного ґрунту. У шкілці рослини поливають 2 рази на день протягом першого місяця культивування та 1 раз на день у подальшому, до кінця періоду вегетації. Протягом періоду вегетації рослин проводять 2-3 пасинкування і чеканку пагонів. Для кращого розуміння матеріалів заявки наводимо приклад наукових досліджень: Приклад. Удосконалення способу адаптації мікроклонів винограду на основі торф'яних поживних субстратів та антитранспірантів: Згідно з загальноприйнятою технологією ініціальні експланти вводять у культуру тканин in vitro і культивують на агарових поживних середовищах у культуральних боксах при температурі 25-26 °C, освітленні 3,0-3,5 тис. лк та розмножують до необхідної кількості шляхом мікрочубукування. Для проведення першого етапу адаптації (умови культурального боксу) відбирали мікроклони винограду висотою 4-5 см, які мали по 3-5 листочки, добре розвинену кореневу систему і пристосовували до зниженої вологості повітря шляхом поступового відкривання культуральних ємностей. Перед першим відкриванням ємностей проводили обробку вегетативної маси антитранспірантами. На другому етапі адаптації мікроклони винограду переносили до адаптаційних приміщень і пересаджували на поживні субстрати за схемою, яка включала такі варіанти: 1 - кокосовий субстрат чистий, 2 - кокосовий субстрат+вермикуліт (1:1)+теравет (3:1), 3 - кокосовий субстрат+агроперліт (1:1) +теравет (3:1), 4 - торф сфагнум+агроперліт (1:1), 5 - торф сфагнум+вермикуліт (1:1), 6 - субстрат Біона+цеоліт (3:1) (контроль). Усі мікроклони винограду, після пересаджування у ємкості за наведеною схемою, повторно обприскували розчинами антитранспірантів - Vapor Gard (0,3 %) або ЕПАА (0,4 %) і культивували у адаптаційній кімнаті протягом 20-25 днів. Після цього висаджували у цеолітовий субстрат теплиці. Рослини контрольного варіанта антитранспірантами не обробляли. Через 30 діб після висаджування у шкілку провели обліки приживлюваності мікроклонів, які показали, що після застосування різних субстратів та антитранспірантів - ЕПАА 0,4 % або Vapor Gard 0,3 % цей показник, порівняно із контролем, збільшувався і дорівнював 88-97 %. Так у варіанті після застосування чистого кокосового субстрату приживлюваність рослин знаходилася на рівні 87 %, після застосування суміші кокосового субстрату з агроперлітом і тераветом, суміші кокосового субстрату з вермикулітом, тераветом та суміші сфагнового торфу з вермикулітом - він знаходився у межах 96-98 % (Фіг. 1 Приживлюваність мікроклонів винограду в умовах теплиці). Приживлюваність мікроклонів у контрольному варіанті дорівнювала 77 %. Приживлюваність мікроклонів винограду на субстратах, що вивчали, але без застосування антитранспірантів зменшувалася у середньому на 5-9 %. Слід відмітити, що достовірної різниці після застосування препаратів ЕПАА та Vapor Gard ми не відмітили. Тому рекомендуємо використовувати будь-який із цих препаратів, що є у наявності, за вказаних концентрацій. Кращі результати, отримані у дослідних варіантах пояснюються зниженням інтенсивності транспірації у рослин, що обробляли розчинами антитранспірантів та кращим розвитком кореневої системи на субстратах, які вивчали. У рослин, які на етапі адаптації культивували на 2 UA 85881 U 5 10 вищевказаних субстратах, розвивалась більша кількість основних та додаткових (II та наступних порядків) коренів. Так, наприклад загальна кількість коренів у рослин дослідних варіантів була більшою за контрольну на 42-48 %, їх довжина зменшувалась - на 10-20 %, маса збільшувалась в 1,1-1,2 разу. Проведення агробіологічних обліків розвитку мікроклональних рослин у кінці періоду вегетації показало, що мікроклональні саджанці винограду, які отримано у варіантах, де адаптацію проводили на поживних субстратах кокосовий субстрат+вермикуліт+теравет, кокосовий субстрат+агроперліт+геравет, сфагновий торф+вермикуліт та двічі обробляли розчинами антитранспірантів характеризувалися і кращими біометричними показниками розвитку (Таблиця). Таблиця Біометричні показники розвитку однорічних мікроклональних саджанців винограду сорту Аліготе (дворазова обробка антитранспірантом ЕПАА 0,4 %) Варіант досліду Кокосовий субстрат + вермикуліт + теравет Кокосовий субстрат + агроперліт + теравет Сфагновий торф + вермикуліт Кокосовий субстрат чистий Торф сфагнум + агроперліт (1:1) Контроль 15 20 25 Довжина пагону, см Діаметр пагону, см Визрівання пагону, % Облиствленість 2 пагону, дм /м 245,5 0,58 94,0 7,9 224,8 0,58 92,5 7,5 225,0 0,55 89,8 7,5 168,0 0,40 77,0 6,0 178,2 0,38 75,8 5,8 170,0 0,37 75,0 5,7 Згідно з отриманими результатами вихід стандартних саджанців із шкілки також був більшим у дослідних варіантах, особливо після застосування антитрак, пірантів. Так, найкращими були варіанти у яких мікроклони винограду адаптували на субстратах-кокосовий субстрат+вермикуліт+теравет, кокосовий субстрат+агроперліт+теравет та сфагновий торф+вермикуліт (Фіг. 2 Вихід стандартних мікроклональних саджанців із шкілки). Taким чином, найкращі результати по приживлюваності та виходу стандартних мікроклональних саджанців із шкілки були отримані після адаптації мікроклонів на субстратах: кокосовий субстрат+агроперліт+еравет, кокосовий субстрат+вермикуліт+теравет та торф сфагнум+вермикуліт, які ми і рекомендуємо застосовувати у комплексі із обприскуванням приросту рослин розчинами антитранспірантів двічі (у культуральних ємкостях перед першим відкриванням кришечок та після пересаджування на поживні субстрати). Дослідження проведено в лабораторно-тепличному комплексі Національного наукового центру "Інститут виноградарства і виноробства ім. В.Є. Таїрова" на мікроклонах винограду сортів Добриня, Шардоне, Аліготе. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 35 40 1. Спосіб адаптації мікроклонів винограду до умов in vivo, який включає вирощування мікроклонів в умовах in vitro на агаризованому поживному середовищі, їх мікрочубукування, висаджування та дорощування мікроклональних рослин у шкілці захищеного грунту, який відрізняється тим, що на першому етапі адаптації, упродовж 5-7 днів проводять пристосування рослин до зниженої вологості повітря, обприскуючи вегетативну масу рослин розчином антитранспірантів та відкриваючи кришечки ємностей на 5-10 хв., з кожним днем збільшуючи експозицію, на другому етапі мікроклони пересаджують на субстрати та повторно обприскують розчином антитранспірантів. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що обприскування проводиться розчином антитранспірантів ЕПАА 0,4 % або Vapor Gard 0,3 %. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що мікроклони пересаджують на субстрати: кокосовий субстрат+агроперліт (1:1)+теравет (3:1), кокосовий субстрат+вермикуліт (1:1)+теравет (3:1), торф сфагнум+вермикуліт (1:1). 3 UA 85881 U Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4