Спосіб гідроксилювання a1 та a2-ланцюгів колагену людини першого типу в трансгенних рослинах

Реферат: Спосіб гідроксилювання 1- та 2-ланцюгів колагену людини першого типу в трансгенних рослинах включає створення генетичних конструкцій для агробактеріальної трансформації рослин, що містять гени - та -субодиниць проліл-4-гідроксилази, отримання трансгенних рослин та молекулярно-генетичний аналіз трансформованих рослин, при якому створюють генетичні конструкції для агробактеріальної трансформації рослин, що містять гени - та субодиниць проліл-4-гідроксилази людини (-Р4Н та -P4H) та послідовності, що забезпечують локалізацію синтезованих білків в апопласті або пластомі, під контролем 35S промотору ВМЦК, nos-термінатора, селективний ген фосфінотрицин-N-ацетилтрансферази (bar), що забезпечує стійкість рослин до антибіотика фосфінотрицину, під контролем nos-промотору; для генетичної трансформації генами - та -субодиниць проліл-4-гідроксилази використовують рослини Nicotiana benthamiana та N.excelsior, які є ефективними продуцентами для подальшої транзієнтної експресії 1- та 2-ланцюгів колагену першого типу; для підтвердження присутності трансгенів проводять молекулярно-біологічний аналіз за допомогою ПЛР з використанням праймерів для ампліфікації фрагментів генів -Р4Н, -Р4Н та bar; отримані трансгенні рослини N. benthamiana та N.excelsior, що експресують гени - та -субодиниць проліл-4-гідроксилази, застосовують як адаптовані продуценти для транзієнтної експресії 1- та 2-ланцюгів колагену людини. UA 87968 U (12) UA 87968 U UA 87968 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до генної інженерії, зокрема отримання трансгенних рослин, в яких проходить експресія ферментів, що можуть бути використані для пост-трансляційної модифікації 1- та 2-ланцюгів колагену людини першого типу (а саме гідроксилювання залишків проліну), для утворення коректної просторової структури рекомбінантного колагену, що транзієнтно синтезується в рослинах. Рослини, як продуценти рекомбінантних білків, мають ряд переваг у порівнянні з бактеріями, дріжджами або клітинами ссавців. Рослини не містять патогенних для людини вірусів та пріонів, не потребують застосування коштовного обладнання та культуральних середовищ для їх вирощування, а також проведення робіт в асептичних умовах. Крім створення трансгенних рослин, в яких проходить експресія цільових білків внаслідок переносу чужорідного гена в геном рослини, розроблено системи транзієнтної (тимчасової) експресії, при якій експресія клонованого гена відбувається без його обов'язкової інтеграції в геном рослини [1]. Доведено, що транзієнтна система експресії дає можливість значно збільшити кількість рекомбінантного білка, що синтезується у рослинах, у порівнянні зі стабільно трансформованими рослинами. Так було показано, що при використанні системи транзієнтної експресії MagnICON [2] кількість отриманого рекомбінантного білка у порівнянні з трансгенними рослинами збільшилась майже у 100 разів і досягла 80 % від сумарного розчинного білка рослини [3]. В цій же публікації було показано, що Nicotiana benthamiana, у порівнянні зі звичайним тютюном, при транзієнтній експресії накопичує у 7 разів більше білка. Колаген І типу є важливим сировинним матеріалом для цілого ряду напрямків фармацевтичного виробництва і використовується як хірургічний шовний матеріал, як допоміжна речовина в технології мазей, супозиторіїв, розчинів для ін'єкцій, очних лікарських плівок та ін. Вперше в рослинних системах колаген було отримано в трансгенних рослинах тютюну [4] і було показано, що в рослинах можливий синтез про-α-ланцюгів колагену, та формування потрійної спіральної структури. Однак, отриманий колаген мав низький вміст гідроксипроліну, що значно знизило його стабільність при фізіологічних температурах. Необхідним етапом у формуванні про-α-ланцюгів колагену є утворення 4-гідроксипроліну, який каталізує фермент проліл-4-гідроксилаза [5, 6]. Найбільш близьким рішенням, яке було вибрано як прототип, є спосіб, в якому запропоновано гідроксилювання рекомбінантного колагену першого типу у трансгенних рослинах кукурудзи, при сумісній експресії генів 1-ланцюгів колагену та субодиниць проліл-4гідроксилази (-Р4Н та -Р4Н). У способі запропоновано для стабільної трансформації кукурудзи використовувати генетичну конструкцію, в якій селективний bar ген знаходиться під контролем промотору та термінатору 35S вірусу мозаїки цвітної капусти (ВМЦК), гени субодиниць проліл-4-гідроксилази знаходяться під контролем убіквітинового промотору кукурудзи; генетична конструкція також містить ген α-ланцюга колагену під контролем глобулінового промотору кукурудзи. Завдяки наявності в геномі трансгенної рослини генів субодиниць проліл-4-гідроксилази, забезпечується гідроксилювання проліну та збільшується вміст 4-гідроксипроліну в синтезованих молекулах про-α-ланцюгів колагену, що дає можливість отримувати молекули колагену з максимально близькою до нативної просторовою структурою [7]. Для реалізації способу отримання молекул колагену, проводять стабільну трансформацію рослин кукурудзи генами α-ланцюгів колагену та генами субодиниць проліл-4-гідроксилази. Для підтвердження трансгенної природи отриманих рослин кукурудзи використовували молекулярно генетичний аналіз за допомогою ПЛР з праймерами для ампліфікації фрагментів генів -Р4Н, P4H, фрагменту гену Сl 1 (1-ланцюга колагену). Недоліком найближчого аналога є те, що даний спосіб передбачає експресію колагену внаслідок стабільної трансформації рослин кукурудзи відповідними генетичними конструкціями, проте, при отриманні рекомбінантного колагену доцільніше використовувати транзієнтну експресію, яка, як вказувалось раніше, дає можливість отримувати значно більшу кількість цільового білка та має потенціал для масштабної продукції рекомбінантних білків. Генетичні конструкції у способі розраховані на трансформацію саме кукурудзи, тому для контролю експресії генів колагену та субодиниць проліл-4-гідроксилази використані промотори специфічні для цього рослинного об'єкта, але для отримання рекомбінантної білка методом транзієнтної експресії використовують рослини Nicotiana benthamiana та N.excelsior. В основу запропонованої корисної моделі поставлено задачу створити спосіб гідроксилювання молекул колагену, що синтезується в рослинах при транзієнтній експресії, тобто спосіб гідроксилювання -ланцюгів рекомбінантного колагену в рослинах, для яких підтверджено активність ферменту проліл-4-гідроксилази та які доцільно використовувати для отримання рекомбінантного колагену методом транзієнтної експресії. Запропонований спосіб передбачає створення трансгенних рослин, що можуть бути використані як адаптовані 1 UA 87968 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 продуценти для синтезу рекомбінантного колагену людини першого типу. Для вирішення задачі запропонований спосіб гідроксилювання 1- та 2-ланцюгів колагену, передбачає створення варіантів генетичних конструкцій для агробактеріальної трансформації рослин, що містять гени - та -субодиниць проліл-4-гідроксилази людини та послідовності, що забезпечують локалізацію синтезованих білків в апопласті або пластомі, під контролем 35S промотору ВМЦК, nos-термінатора, селективний ген фосфінотрицин-N-ацетилтрансферази, що забезпечує стійкість рослин до антибіотика фосфінотрицину під контролем nos-промотору; генетичну трансформацію генами - та -субодиниць проліл-4-гідроксилази рослин Nicotiana benthamiana та N.excelsior, які є ефективними продуцентами для подальшої транзієнтної експресії 1 та 2ланцюгів колагену першого типу; для підтвердження присутності трансгенів проводять молекулярно-біологічний аналіз за допомогою ПЛР з використанням праймерів для ампліфікації фрагментів генів -Р4Н, -P4H та bar; отримані трансгенні рослини N. benthamiana та N.excelsior, що експресують гени - та -субодиниці проліл-4-гідроксилази застосовують як адаптовані продуценти для транзієнтної експресії 1 та 2-ланцюгів колагену людини першого типу. Конкретний приклад виконання способу Реалізацію даного способу виконують за допомогою генетичних конструкцій для трансформації рослин, що представлені на кресленні, де схематично позначено: RB, LB - права та ліва границі Т-ДНК; -Р4Н, -Р4Н - послідовності генів - та -субодиниць проліл-4гідроксилази; bar - ген фосфінотрицин-N-ацетилтрансферази; 35Spro - промотор 35S вірусу мозаїки цвітної капусти; nospro, nost - промотор та термінатор гена нопалінсинтетази; ocst термінатор гена октопінсинтетази; chloroplast targeting, apoplast targeting - послідовності, що забезпечують таргетинг білків в пластом або апопласт відповідно. Для створення генетичних конструкцій використовують вихідний бінарний вектор для агробактеріальної трансформації, що містить щонайменше: селективний ген для підтримання вектора в бактерії, область початку реплікації вектора, Т-ДНК з її граничними послідовностями, в межах яких присутній селективний ген bar з промотором та термінатором гену нопалінсинтази (nos) для ефективної експресії селективного гена в трансгенних рослинах. В Т-ДНК такого вектора клонують послідовність ген - або -субодиниці проліл-4-гідроксилази (-Р4Н, -Р4Н), які знаходяться під контролем 35S промотора вірусу мозаїки цвітної капусти, який забезпечує ефективну конститутивну експресію цих генів в рослинній клітині. Для створення варіантів генетичних конструкцій з генами -Р4Н та -Р4Н, які використовуються для експресії та накопичення субодиниць ферменту проліл-4-гідроксилази в пластомі клітини або апопласті, додатково проводять клонування ДНК послідовностей сигнальних пептидів в ділянку перед стартовим кодоном гена так, щоби рамки кодонів послідовностей сигнального пептиду та кодуючої частини гена (-Р4Н або -P4H) співпадали і утворювали загальну одиницю трансляції. Використовують послідовності сигнальних пептидів для пластидного та апопластного спрямування білкового продукту. Створені генетичні конструкції надалі використовують для трансформації ґрунтової бактерії Agrobacterium tumefaciens. За допомогою Agrobacterium tumefaciens, що несе кожну з конструкцій, проводять генетичну трансформацію рослин. Для агробактеріальної трансформації N.benthamiana використовують листя 5-6-тижневих рослин, що вирощуються в асептичних умовах. Експланти інкубують у бактеріальній суспензії протягом 10-15 хвилин. Після цього експланти переносять на середовище MS [8], яке додатково містить фітогормони 1 мг/л БАП та 0,1 мг/л НОК для ініціації регенерації рослин. Регенерацію та селекцію трансгенних рослин N.benthamiana, зважаючи на те, що генетичні конструкції містять селективний ген фосфінотрицин-N-ацетилтрансферази, проводять на селективному середовищі, що містить 5 мг/л фосфінотрицину. Через 5-6 тижнів сформовані пагони пересаджують на безгормональне середовище MS доповнене 5 мг/л фосфінотрицину. Для доведення наявності трансгенів в отриманих рослинах аналізують сумарну рослинну ДНК за допомогою ПЛР з використанням праймерів до гена bar та генів - та - субодиниць ферменту проліл-4-гідроксилази (Таб. 1). Як позитивний контроль для реакції ампліфікації використовують плазмідну ДНК векторів, за допомогою яких проводили генетичну трансформацію рослин. Електрофорез ПЛР фрагментів ДНК проводять у 1 % агарозному гелі. 55 2 UA 87968 U Таблиця 1 Праймери, які використанні в роботі, для проведення молекулярного аналізу за допомогою ПЛР Температура реасоціації Продукт ампліфікації bar 65 °C 463 п.н. Р4Н-alpha 60 °C 491 п.н. Р4Н-beta 61 °C 666 п.н. Р4Н-beta 64 С 668 п.н. Ген 5 10 15 20 25 30 35 Послідовність праймерів Вкорінені трансгенні рослини переносять в ґрунт в умовах теплиці. Через 4-5 тижнів добре розвинені рослини використовують для експериментів по інфільтрації та транзієнтній експресії генів 1- та 2-ланцюгів колагену людини І типу. Ступінь гідроксилювання залишків проліну в молекулах колагену, що були отримані запропонованим способом, оцінюють за температурою плавлення синтезованих ланцюгів колагену [9]. Трансгенні рослини N. benthamiana та N.excelsior, в яких відбувається синтез - та субодиниць ферменту проліл-4-гідроксилази, призначені для отримання в рослинах методом транзієнтної експресії рекомбінантного колагену з максимально близькою до нативної післятрансляційною модифікацією. Джерела інформації: 1. Komarova TV, Baschieri S, Donini M, Marusic C, Benvenuto E, et al. (2010) Transient expression systems for plant-derived biopharmaceuticals // Expert Rev Vaccines., 2010, v. 8, p. 85976. 2. Marillonnet S., Thoeringer C., Kandzia R., Klimyuk V., Gleba Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mcdiated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants // Nat Biotechnol, 2005, v. 23, p. 718-723. 3. Nausch H., Mikschofsky H., Koslowski R., Meyer U., Broer I., Huckauf J. High-level transient expression of ER-targeted human interleukin 6 in Nicotiana benthamiana // PLoS One., 2012, v. 7(11):e48938. 4. Ruggiero F., Exposito J.Y., Bournat P., Gruber V., Ferret S., Comte J., Olagnier В., Garrone R., Theisen M. Triple helix assembly and processing of human collagen produced in transgenic tobacco plants // FEBS Lett., 2000, v. 469(1), p. 132-6. a ab 5. Kelly L. Gorres and Ronald T. Raines Prolyl 4-hydroxylase // Crit Rev Biochem Моl Biol., 2010, v. 45, p. 106-124. 6. Myllyharju J. Prolyl 4-hydroxylases, the key enzymes of collagen biosynthesis // Matrix Biol., 2003, v. 22 (1), p. 15-24. 7. Xu X, Gan Q, Clough RC, Pappu KM, Howard JA, Baez JA, Wang K. Hydroxylation of recombinant human collagen type I alpha 1 in transgenic maize co-expressed with a recombinant human prolyl 4-hydroxylase // BMC Biotechnol., 2011, 11:69. - прототип 8. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol Plantarum, 1962, v. 15, p. 473-497. 9. Pakkanen O., Hamalainen E.R., Kivirikko K.I., Myllyharju J. Assembly of stable human type I and III collagen molecules from hydroxylated recombinantchains in the yeast Pichia pastoris-Effect of an engineered C-terminaloligomerization domain foldon // J Biol Chem, 2003, v. 278, p. 32478-32483. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 Спосіб гідроксилювання 1- та 2-ланцюгів колагену людини першого типу в трансгенних рослинах, що включає створення генетичних конструкцій для агробактеріальної трансформації рослин, що містять гени - та -субодиниць проліл-4-гідроксилази, отримання трансгенних рослин та молекулярно-генетичний аналіз трансформованих рослин, який відрізняється тим, що створюють генетичні конструкції для агробактеріальної трансформації рослин, що містять 3 UA 87968 U 5 10 гени - та -субодиниць проліл-4-гідроксилази людини (-Р4Н та -P4H) та послідовності, що забезпечують локалізацію синтезованих білків в апопласті або пластомі, під контролем 35S промотору ВМЦК, nos-термінатора, селективний ген фосфінотрицин-N-ацетилтрансферази (bar), що забезпечує стійкість рослин до антибіотика фосфінотрицину, під контролем nosпромотору; для генетичної трансформації генами - та -субодиниць проліл-4-гідроксилази використовують рослини Nicotiana benthamiana та N.excelsior, які є ефективними продуцентами для подальшої транзієнтної експресії 1- та 2-ланцюгів колагену першого типу; для підтвердження присутності трансгенів проводять молекулярно-біологічний аналіз за допомогою ПЛР з використанням праймерів для ампліфікації фрагментів генів -Р4Н, -Р4Н та bar; отримані трансгенні рослини N. benthamiana та N.excelsior, що експресують гени - та субодиниць проліл-4-гідроксилази, застосовують як адаптовані продуценти для транзієнтної експресії 1- та 2-ланцюгів колагену людини. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4