Застосування хімічного розщеплення полісахаридного каркасу рослинних клітин як методу підготовки рослинної біомаси до екстракції білків

Реферат: Застосування хімічного розщеплення полісахаридного каркасу рослинних клітин, що включає інкубацію рослинної біомаси у присутності хімічного агенту (або суміші хімічних агентів), що хімічно деградують полісахаридні ланцюги в умовах, які забезпечують цілісність протопластів рослинних клітин, та подальше видалення нерозщеплених решток рослинної біомаси за допомогою центрифугування, як методу підготовки рослинної біомаси до екстракції білків UA 87967 U (12) UA 87967 U UA 87967 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до загальних способів одержування пептидів та до видобування, розділяння, очищання цих пептидів з рослин, і може бути застосована у технологічному процесі підготовки рослинного матеріалу до виділення та очистки білків із апопластною або протопластною локалізацію. Наявність у клітинах рослин системи посттрансляційних модифікацій білків, що є подібною до систем посттрансляційних модифікацій у клітинах ссавців, обумовлює перспективність використання рослинних експресійних систем у біотехнологічному виробництві [1, 2]. З огляду на те, що для рослинних експресійних систем з одного боку характерний відносно низький рівень накопичення цільового білка, а з іншого боку - індукція потужної протеолітичної активності під час деструкції рослинних клітин, використання рослинних експресійних систем вимагає застосування "м'яких" та селективних умов екстракції цільового білка з рослинної біомаси. Рослинні клітини мають зовнішній полісахаридний каркас, основним компонентом якого є целюлоза. Цей каркас є практично непроникним для білків, розмір яких перевищує 15000 Да [3]. Більшість комерційно перспективних біологічно-активних рекомбінантних білків мають значно більший розмір. Таким чином, обов'язковим елементом майже будь-якої технології виділення білків з рослинної біомаси - є деструкція зовнішнього полісахаридного каркасу клітин цієї біомаси. Аналоги корисної моделі (тобто, відомі способи деструкції полісахаридного каркасу рослинних клітин з метою подальшого виділення та очищення білків) засновані на механічному впливі на рослинну біомасу. Для цього застосовують: вологе перетирання, вологий чи сухий помел або подрібнення заморожуваного матеріалу у рідкому азоті [4]. Перевагою вищеперерахованих процесів є те, що для них розроблене відповідне лабораторне та промислове устаткування, орієнтоване на різну за своїми механічними властивостями рослинну сировину. Недоліком вищезгаданих способів є те, що механічна деструкція рослинної біомаси не може бути здійснена у спосіб, що мінімізував би рівень деструкції протопластів рослинних клітин. При механічній деструкції рослинні протопласти руйнуються одночасно із руйнуванням полісахаридного каркасу. Деструкція рослинних протопластів призводить по-перше - до активації всіх протеолітичних систем рослинної клітини (що в свою чергу призводить до деградації цільового білку), по-друге - у екстрагуючих розчин вивільняються майже всі розчинні в умовах, які створюють компоненти екстрагуючого розчину, власні білки рослинних клітин. Це призводить до зменшення частки цільового рекомбінантного білка у екстракті загального білка нижче рівня, за якого технічно можливе застосування економічно-доцільних методів очищення білків. Таким чином, використання рослинних експресійних систем у біотехнологічному виробництві за умов застосування існуючих способів механічної деструкції рослинної біомаси лімітується: економічно неприйнятним рівнем витрат на інгібітори протеаз та протеосом (які потрібно вносити підчас деструкції біомаси для зменшення рівня протеолізу цільового білка); необхідністю застосовувати дороге та малопродуктивне обладнання (яке дає можливість виділити цільовий рекомбінантний білок із складної суміші власних рослинних білків із наднизькою часткою його вмісту) при здійсненні очистки цільового рекомбінантного білка. Технічним завданням є пошук способу підготовки рослинного матеріалу до екстракції білків, що має забезпечувати селективність розщеплення полісахаридного каркасу клітин рослинної біомаси і одночасне збереження цілісності протопластів цих клітин. При цьому повинно бути можливе подальше відокремлення незруйнованих протопластів від середовища, в якому відбувалось хімічне розщеплення, та від решток рослинної біомаси. Останнє необхідно для забезпечення роздільної екстракції білків окремо з апопласту і окремо з протопластів. Відомий метод, що використовують при культуральній роботі з рослинними клітинами, та орієнтований на роботу з живими протопластами рослинних клітин, який включає метод виділення живих протопластів з живих клітин рослин (з культур рослинних тканин чи калюсів або з частин асептично культивованих рослин) [5, 6]. Одним з етапів цього методу є ферментативне розщеплення полісахаридного каркасу рослинних клітин, з яких виділяють протопласти. Це розщеплення відбувається у ізотонічному до цитоплазми протопластів розчині ферментів, які мають щонайменше одну з таких активностей: целюлазна, геміцелюлазна, пектиназна, або ізотонічний розчин суміші ферментів із вищенаведеними активностями. Крім того, компоненти ізотонічних розчинів підбираються таким чином, щоб на наступному етапі здійснити розділення живих протопластів від решток непроферментованих рослинних тканин після ферментації за допомогою центрифугування. Це забезпечується за рахунок певної густини ізотонічного розчину, за якою живі протопласти при центрифугуванні спливають у верхній шар, а рештки рослинних тканин утворюють осад. 1 UA 87967 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Цією корисною моделлю вперше пропонується використовувати діючі компоненти та умови хімічного розщеплення полісахаридного каркасу рослинної біомаси, що застосовуються у методі виділення живих протопластів рослинних клітин, як метод розщеплення полісахаридного каркасу рослинних клітин для екстракції білків з рослинної біомаси. Технічним результатом застосування хімічного розщеплення (замість механічної деструкції) полісахаридного каркасу рослинних клітин хімічними агентами та в умовах, що забезпечують цілісність протопластів рослинних клітин в процесі підготовки цього матеріалу до екстракції білків є: мінімізація рівня протеолізу цільового білка без застосування інгібіторів протеаз та протеосом, що суттєво зменшує вартість технологічної стадії виділення білка; можливість проведення екстракції білків окремо з протопластів і окремо з апопласту, що дозволяє збільшити частку вмісту цільового білка в екстракті (особливо - у випадку білка із апопластною локалізацією) і, відповідно, використовувати доступні та економічно доцільні технології подальшої очистки цільового білка; можливість проведення екстракції білків з більшої питомої кількості клітин рослинної біомаси по відношенню до питомої кількості клітин, з яких можлива екстракція при механічній деструкції. Відомості, які підтверджують можливість здійснення корисної моделі 100 г листя N. bentamiana, що транзієнтно експресували рекомбінантний білок-аналог колагену людини першого типу (який мав у своїй структурі апопластний сигнальний пептид), розміщували у чашки Петрі та заливали розчином у співвідношенні: 1 г біомаси до 5 мл розчину наступного складу (на 1 л): 1,01г; СаСl22Н2О Гліцин 7г; Сахароза 160 г; Macerozyme-10 5 г; pH 5,6-5,8. Чашки накривали та інкубували у термостаті за температури плюс 28 °C протягом двох годин при повільному перемішуванні на орбітальному шейкері. Отриманий лізат, що містив незруйновані протопласти рослинних клітин та рештки непроферментованих тканин листя, закисляли для забезпечення розчинення рекомбінантного білка-аналогу колагену людини першого типу, та центрифугували протягом 5 хв при 700 g при кімнатній температурі. Відбирали супернатант. Шар протопластів та осад відкидали. Доводили значення рН у отриманому розчині до значення 8,0. Осад білка, що утворився, виділили за допомогою центрифугування при 14000 g протягом 20 хв. при кімнатній температурі. Супернатант відкинули. Осад розчинили у 10 мл 0,1М розчину фосфорній кислоті. Білковий склад розчину дослідили методом Натрийдодецилсуфат-ПААГ з подальшою денсітометрією пофарбованого гелю. Після проведення очищення з екстракту рослинного матеріалу, що був отриманий із використанням запропонованої корисної моделі, виділили 7,3 мг рекомбінантного білка-аналогу колагену людини першого типу із ступенем очистки 94 % (за результатами денсітометрії гелю), що в перерахунку на середній вміст загального білка N. Bentamiana складає 0,73 %. Це добре узгоджується із середньою продуктивністю транзієнтної експресії рекомбінантних білків у N. Bentamiana. Факт виділення без застосування інгібіторів протеаз та протеосом недеградованого рекомбінантного білка із суміші загального рослинного білка за допомогою преципітації вказує на те, що відносна частка цього рекомбінантного у екстракті білка з рослинного матеріалу перевищувала необхідний мінімум для забезпечення технічної можливості застосування цього методу очищення білка (чого не було досягнуто при референсному використанні механічної деструкції рослинної біомаси, що транзієнтно експресувала рекомбінантний білок-аналог колагену людини першого типу, у зв'язку із високим вмістом у кінцевому продукті контамінуючих рослинних білків та частин деградованого цільового білка). Джерела інформації: 1. Кучук Н.В. Генетическая инженерия высших растений. - К.: Нукова думка, 1997. - 152 с. 2. Kirakosyan Ara, Kaufman Peter В., Recent Advances in PlantBiotechnology // Springer Science+Business Media, 2009. - 404 p. 3. Полевой В.В. Физиология растений. - М.: Высшая школа, 1989. - 464 с. 4. Lisa R. Wilken, Zivko L. Nikolov Recovery and purification of plant-made recombinant proteins // Biotechnology Advances. - 2012. Vol. - 30. - P. 419-433 (аналоги корисної моделі) 5. Cocking E.С. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles // Nature. - 1960. Vol. - 187. - P. 927-929 (відомий спосіб, що пропонується для нового застосування) 6. Зубко М.К., Кириченко И.В, Куксова В.Б., Махорина O.K., Сахно Л.А., Сидоров В.А., Скаржинская М.В., Юзефович Л.В. Методы культивирования растительных объектов IN VITRO. 2 UA 87967 U - Препринт. - К.: Киевская книжная типография научной кники, 1988. - 38 с. (відомий спосіб, що пропонується для нового застосування). ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Застосування хімічного розщеплення полісахаридного каркасу рослинних клітин, що включає інкубацію рослинної біомаси у присутності хімічного агенту (або суміші хімічних агентів), що хімічно деградують полісахаридні ланцюги в умовах, які забезпечують цілісність протопластів рослинних клітин, та подальше видалення нерозщеплених решток рослинної біомаси за допомогою центрифугування, як методу підготовки рослинної біомаси до екстракції білків. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3