Спосіб лікування дегенеративно-дистрофічних змін міжхребцевого диска

Реферат: Спосіб лікування дегенеративно-дистрофічних змін міжхребцевого диска передбачає введення мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин в ушкоджений диск. Використовують кріоконсервовані клітини, які вводять на колагеновій губці, що розміщують поряд з ушкодженим диском у сформоване з м'яких тканин ложе. UA 88365 U (54) СПОСІБ ЛІКУВАННЯ ДЕГЕНЕРАТИВНО-ДИСТРОФІЧНИХ ЗМІН МІЖХРЕБЦЕВОГО ДИСКА UA 88365 U UA 88365 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини і може бути використана в ортопедії та травматології. Існує спосіб лікування дегенеративно-дистрофічних змін міжхребцевих дисків (МХД) шляхом трансплантації аутологічних хондроцитів, отриманих з біоптатів драглистого ядра [1]. Суттєвим недоліком цього способу є обмежена кількість клітин, які можуть бути виділені з біоптату, що обумовлює необхідність додаткового культивування отриманих клітин. Процес культивування займає досить тривалий проміжок часу та обумовлює необхідність повторного втручання на МХД з метою введення клітин, що призводить до додаткового ушкодження тканин диска. До того ж клітинна терапія за допомогою аутохондроцитів можлива і доцільна лише тоді, коли пацієнту показана операція з дискектомії. Питання профілактики рецидивів і терапії хворих, яким не показане або протипоказане оперативне втручання, взагалі залишається неохопленими даною методикою. Найбільш близьким до заявленого за своєю суттю є спосіб лікування дегенеративнодистрофічних ушкоджень МХД шляхом ін'єкційного введення нативних мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин (ММСК) кісткового мозку в ушкоджений диск з ® використанням як носія гелю Atelocollagen [2]. Проте цей спосіб не є оперативним, бо отримання необхідної для лікування кількості нативних ММСК займає доволі тривалий проміжок часу (2-3 тижні). А враховуючи те, що даний патологічний процес, як правило, з плином часу вражає МХД на інших рівнях, використання нативних ММСК призводить до додаткового травмування пацієнта, пов'язаного із повторним забором матеріалу для виділення стовбурових клітин. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити відомий спосіб лікування дегенеративно змінених МХД таким чином, щоб забезпечити оперативність способу та уникнути додаткового травмування пацієнта у разі розвитку дегенеративних ушкоджень на інших рівнях хребта. Поставлена задача вирішується тим, що в способі лікування дегенеративно-дистрофічних змін МХД, який передбачає введення ММСК в ушкоджений диск, згідно з корисною моделлю, використовують кріоконсервовані ММСК, які вводять на колагеновій губці, що розміщують поряд з ушкодженим диском у сформоване з м'яких тканин ложе. Використання кріоконсервованих клітин і введення їх на колагеновій губці забезпечує оперативність способу та виключає додаткове травмування пацієнта у разі розвитку дегенеративних ушкоджень на інших рівнях хребта. Спосіб здійснюють таким чином. Хірургічно забезпечують доступ до ураженого МХД, поряд з яким формують ложе з м'яких тканин, розмір якого відповідає розміру носія, та забезпечують гемостаз. В сформоване ложе розміщують колагенову губку, на яку наносять суспензію кріоконсервованих ММСК. Витримавши 2-3 хвилини, рану пошарово зашивають. Приклад. Дослідження виконували на 103 щурах-самцях, яких утримували в умовах клініки для експериментальних тварин на стандартному харчовому раціоні з вільним доступом до їжі і води. При дослідженні керувалися "Європейською конвенцією щодо захисту хребетних тварин, які використовуються з експериментальними та іншими науковими цілями" (Страсбург, 1986 p.), а також "Загальними принципами експериментів на тваринах", схваленими II Національним конгресом по біоетиці (Київ, 2004 p.). ММСК виділяли із резеційованих фрагментів стегнових кісток щурів (n=5, масою 100-150 г) шляхом вимивання розчином Хенкса з наступним пропусканням крізь голки діаметром, що зменшувався. Суспензію центрифугували при 1500 об./хв (834 g) протягом 5 хв. Осад 3 2 ресуспендували та висівали на культуральні флакони (РАА, Австрія) із щільністю 10 клітин/см . Культивування проводили у стандартних умовах (37 °C, 5 % СО2) в інкубаторі Sanyo (Японія) за методом адгезії стромальної фракції до культурального пластику з наступним видаленням фракції неадгезивних клітин. Живильне середовище культивування, що містило середовище IMDM (Sigma, США), 10 % ембріональну сироватку (ЕС) великої рогатої худоби (НуClone, США), гентаміцин (150 мкг/мл) (Фармак, Україна) та амфотерицин Б (10 мкг/мл) (Sigma, США), змінювали кожні 3 доби. Отримані при культивуванні нативні культури ММСК застосовували для кріоконсервування та лікування. Кріоконсервування нативних ММСК проводили під захистом 10 % ДМСО з додавання 20 % ЕС на середовищі культивування зі швидкістю 1 °C/хв до -80 °C з наступним зануренням у рідкий азот. Зразки зберігали в умовах низькотемпературного банку не менше 3 міс. Відігрівали на водяній бані (37 °C) з наступним видаленням кріопротектора. Експериментальне дослідження in vivo було проведене на 98 щурах-самцях масою 350±50 г. Всім тваринам спочатку моделювали компресійне дегенеративно-дистрофічне ушкодження 1 UA 88365 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 МХД [3]. На 60 добу дію компресії припиняли. У тварин І групи (n=21) загоєння проходило мимовільно. У тварин II групи (n=21) під кетаміновим наркозом робили серединний розтин шкіри хвоста з дорсальної сторони безпосередньо над МХД CoVI-VII, забезпечували гемостаз та тупим шляхом здійснювали скелетування дорсальної поверхні цього диска, формували ложе ® необхідного розміру, в яке після ретельного гемостазу поміщали колагенову губку Gelaspon (Ankerpharm, Німеччина) розміром 0,8×0,8×0,5 см, а на неї наносили 0,1 мл фізіологічного розчину. Тваринам III (n=21) і IV (n=21) груп аналогічним способом у зону дефекту вводили по 6 0,5×10 алогенних нативних або кріоконсервованих ММСК у 0,1 мл розчину Хенкса (РАА, Австрія), відповідно. З експерименту тварин виводили на 30, 60 та 90 добу після лікування. Крім того, в експерименті було використано 7 тварин відповідної маси і віку для визначення контрольних показників щурів, які не мали патологічного процесу (інтактні тварини), та 7 тварин для визначення показників на 60 добу моделювання компресії МХД, тобто на момент лікування (модельна група). Оцінку результатів експериментів проводили рентгенологічним та гістоморфометричними методами. Комп'ютерну томографію (КТ) із кроком 1 мм проводили на рентгенівському спіральному комп'ютерному томографі General electric СТ/е Dual (Німеччина) в стані наркозу 3-м тваринам з кожної групи таким чином, щоб зрізи проходили в сагітальній площині. Обробку отриманих зображень проводили за допомогою програмного забезпечення eFilm (TM) Lite (TM). Оцінювали щільність дорсальної частини фіброзного кільця (ФК) МХД CoVI-VII в одиницях Хаусфільда (HU). Для гістоморфометричного дослідження брали частину хребта на рівні CoIV-X і виготовляли целоїдинові зрізи, які фарбували гематоксиліном і еозином і вивчали на мікроскопі Carl Zeiss (Німеччина) з цифровою фотокамерою Cannon EOS 30D. За допомогою морфометричної сітки і окуляр-мікрометра за методом Автанділова оцінювали висоту і чисельну щільність клітин дорсальній частині ФК МХД CoVI-VII ступінь розволокнення і фрагментації колагенових волокон (KB), наявність тріщин/щілин і ділянок зі зниженою щільністю/відсутністю фіброхондроцитів в ФК, цілісність межі між ФК та драглистим ядром (ДЯ). Висоту визначали за кінцевими елементами ФК на рівні найбільш наближених один до одного поверхонь епіфізів суміжних хребців. Чисельну щільність клітин визначали як середнє арифметичне вимірювань в зовнішньому, центральному та внутрішньому відділах дорсальній частині ФК шляхом підрахунку 2 2 кількості ядер на одиниці площі зрізу (0,102 мм ) з наступним перерахунком на 1 мм . При визначенні ступеня розволокнення і фрагментації KB, поширеності тріщин і щілин, ділянок зі зниженою щільністю/відсутністю фіброхондроцітов оцінювалася питома площа, займана патологічним елементом. При дослідженні гістологічних препаратів МХД CoVI-VII інтактних тварин патологічних змін виявлено не було. ФК складалося з радіальних пластин KB, уздовж яких розташовувалися фіброхондроціти. Останні являли собою фібробластоподібні витягнуті клітини із щільними овоїдними ядрами. В деяких випадках спостерігали незначне розволокнення пучків KB, що, певно, було обумовлено віковими змінами. Гістологічна картина тварин I і II груп на всіх строках спостереження була схожа з такою у тварин модельної групи. У структурі МХД CoVI-VII визначалися ознаки дегенеративнодистрофічного ушкодження хрящової тканини у вигляді вираженого розволокнення, розшарування і фрагментації пластин KB, центральних тріщин і щілин, оточених ацелюлярними ділянками ФК, зниження щільності фіброхондроцитів, нечіткості контурів межі ФК/ДЯ. Фіброхондроцити розташовувалися поодинці або утворювали ізогенні групи і за своєю структурою були гетерогенні. У територіальній близькості до тріщин ФК поряд з характерними для цього типу хрящової тканини клітинами з овоїдними ядрами зустрічалися великі хондроцити зі сферичними ядрами, оточеними широким обідком цитоплазми. Така трансформація фіброхондроцитів на тлі різкого зниження чисельної щільності клітин свідчить про напруженість відновних процесів на даній ділянці ФК. При мікроскопічному дослідженні гістологічних зрізів МХД CoVI-VII тварин IIІ групи на 30 добу після введення нативних ММСК визначалася репарація тріщин, щілин, фрагментацій пучків KB, ставала більш чіткою межа ФК/ДЯ, при цьому фіброхондроцити розташовувалися не тільки по ходу пучків KB, але й густо пронизували їх товщу, що свідчило про високу інтенсивність репаративних процесів. А вже на 60 добу введення суспензії нативних ММСК призводило до відновлення гістоструктури хрящової тканини МХД CoVI-VII, за винятком незначного розволокнення пучків KB, подібно до того яке спостерігали у інтактних тварин. Застосування суспензії кріоконсервованих ММСК (група IV) так само сприяло стимуляції хондрорепаративних процесів у дегенеративно змінених МХД. На 30 добу відзначалися збільшення клітинності ФК, зниження ступеня розволокнення KB, значне скорочення площі, займаної тріщинами і щілинами, поліпшення контурів межі ФК/ДЯ. Клітинна популяція ФК, так 2 UA 88365 U 5 10 15 20 25 30 35 само як і у випадку застосування нативних ММСК, була представлена невеликими фібробластоподібними клітинами із вузьким обідком цитоплазми навколо центрально розташованого овоїдного ядра, при цьому клітини розташовувалися переважно вздовж KB, лише в окремих ділянках, пронизуючи їх товщу. Зі збільшенням строку спостереження до 60 діб відбувалось прогресування репаративних змін, проте майже у всіх препаратах залишались незначні ділянки з пониженою щільністю та повною відсутністю фіброхондроцитів, що оточували центрально розташовану щілину ФК. Відновлення структури хрящової тканини МХД CoVI-VII за умови введення кріоконсервованих ММСК відбувалося на 90 добу лікування. Отримані дані морфометричного дослідження гістологічних препаратів показали, що на тлі лікування кріоконсервованими ММСК відновлення чисельної щільності фіброхондроцитів випереджало нормалізацію інших досліджених показників і відбувалось на 60 добу лікування (фіг. 1). А відновлення висоти (фіг. 2) та рентгенологічної щільності хрящової тканини (фіг. 3) дорсальній частині ФК МХД CoVI-VII відбувалося на 90 добу лікування. Відповідно введення нативних ММСК супроводжувалося збільшенням чисельної щільності клітин хрящової тканини до показника інтактних тварин на 30 добу спостереження (фіг. 1), висоти та рентгенологічної щільності - на 60 добу (фіг. 2, 3). При цьому в групах контролю I і II спостерігали деяку тенденцію до збільшення лише чисельної щільності клітин хрящової тканини і лише на 90 добу дослідження (фіг. 1), що свідчить про доволі слабкі внутрішні резерви хрящової тканини МХД до самовідновлення. Примітка до фіг. 1, 2 та 3: І - мимовільне загоєння, II - введення фізіологічного розчину, III лікування нативними ММСК, IV - лікування кріоконсервованими ММСК, пунктирна лінія показник інтактних щурів, лінія основи - значення модельного показника * - різниця статистично значима з модельним показником (р