Спосіб кількісного визначення змін активних форм кисню у клітинах в системі in vivo під впливом наночастинок металовмісних матеріалів

Реферат: Спосіб кількісного визначення змін активних форм кисню у клітинах в системі in vivo під впливом наночастинок металовмісних матеріалів. Визначення змін генерації активних форм кисню під впливом наночастинок магнітної рідини та наночастинок колоїдного золота проводять безпосередньо у пухлинних клітинах, зафарбованих специфічним барвником, без порушення їх структурної цілісності за допомогою проточної цитофлуориметрії. UA 89196 U (12) UA 89196 U UA 89196 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель, що заявляється, належить до медико-біологічних наук, а саме онкології, і спрямована на вирішення актуальної задачі - оцінку особливостей цитотоксичної дії металовмісних наноматеріалів на окисно-відновні процеси при створенні систем спрямованого транспорту цитостатиків до пухлинної тканини. На сьогодні відомо, що металовмісні наноматеріали, а саме наночастинки магнітної рідини та колоїдного золота завдяки своїм фізико-хімічним перевагам перед аналогічними частинками більших розмірів, знаходять застосування в онкології, в тому числі при створенні наносистем таргетної доставки протипухлинних засобів безпосередньо до тканини-мішені [1-3]. Вже існують певні надбання щодо біологічного впливу наночастинок магнітної рідини та колоїдного золота на структурно-метаболічні зміни у пухлинних клітинах в системі in vivo [4, 5]. Проте відомостей про наслідки дії цих металовмісних чинників на окисно-відновні процеси у клітинах як вирішальні в метаболізмі, зокрема на генерацію активних форм кисню (АФК), яка пов'язана із проліферацією та станом ДНК [6], і може бути використана для підсилення цитотоксичного ефекту цитостатиків, обмаль. Існує ряд способів для оцінки кількості АФК у клітинах як показника токсичності наносполук, які базуються на застосуванні електронно-парамагнітного резонансу [8] або спектрофотометрії [9]. Загальним недоліком зазначених аналогів є відсутність специфічності, недостатня точність досліджень та низька відтворюваність результатів. За найближчий аналог запропонованого нами способу кількісного визначення у пухлинних клітинах генерації АФК як показника порушення окисно-відновних процесів під впливом наночастинок магнітної рідини та колоїдного золота з використанням проточної цитофлуориметрії можна вважати спосіб оцінки кількості АФК у клітинах за допомогою флуоресцентної мікроскопії [10]. Перевагою найближчого аналога є використання флуоресцентного барвника, який специфічно реагує з АФК, що забезпечує високу відтворюваність результатів. Недоліком найближчого аналога є використання методу мікроскопії з візуальною оцінкою генерації АФК, яка дозволяє скласти суб'єктивне, недостатньо точне уявлення про досліджений об'єкт, і тому для більшої достовірності результатів необхідні повторні відтворення досліджень, і внаслідок цього відповідні додаткові витрати на реактиви і матеріали. В основу корисної моделі, що заявляється, поставлено задачу розробити об'єктивний спосіб кількісної реєстрації змін генерації АФК, як показника порушень окисно-відновних процесів у клітинах, під впливом різних концентрацій наночастинок магнітної рідини та колоїдного золота протягом певного часу, що досягається шляхом введення тваринам з перещепленою асцитною карциномою Ерліха (АКЕ) цих чинників у черевну порожнину із подальшою оцінкою ефекту їх дії на клітини методом проточної цитофлуориметрії із застосуванням специфічного барвника. Поставлена задача вирішується наступним чином: Тваринам із АКЕ внутрішньочеревно вводять частинки магнітної рідини у концентрації 3 та 6 мг/кг маси тіла та колоїдного золота у концентрації 30 та 60 мг/кг. У видалених з асцитичної рідини пухлинних клітинах, зафарбованих специфічним барвником, кількісно оцінюється утворення АФК у різні терміни дії цих чинників за допомогою методу проточної цитофлуориметрії. Схема застосування способу, що заявляється. Тваринам із перещепленою АКЕ внутрішньочеревно вводять наночастинки магнітної рідини: одній групі у концентрації 3 мг/кг маси тіла, другій - 6 мг/кг маси тіла, аналогічно іншим двом групам тварин вводять дві концентрації колоїдного золота - 30 та 60 мг/кг маси тіла відповідно. Результати дії цих металовмісних матеріалів оцінюють у пухлинних клітинах через 24 та 48 годин за допомогою методу проточної цитофлуориметрії з використанням специфічного барвника CM-H2DCFDA. Останній, проникаючи через мембрану клітини, піддається ряду ферментативно-метаболічних перетворень, внаслідок яких із нефлуоресцентної форми переходить у флуоресцентну під впливом АФК, і набута таким чином флуоресценція генерується прямо пропорційно кількості АФК [7]. Вилучені із черевної порожнини у складі асцитної рідини пухлинні клітини двічі відмивають фізіологічним розчином та після підрахунку у камері Горяєва відбирають у дослід. Визначення АФК клітин АКЕ методом проточної цитофлуориметрії здійснюється за наступною схемою: 6 1. Вихідна концентрація клітин АКЕ становить 0,510 клітин на пробу. 2. Проби готують в трьох варіантах: дослід - фарбування барвником СМ-H2DCFDA: контроль 1 (нефарбований); контроль 2 - позитивний контроль (фарбування барвником CMH2DCFDA з додаванням Н2О2), який характеризується тим, що, завдяки присутності разом з барвником Η2О2, флуоресценція АФК спостерігається при будь-якій їх кількості у клітинах. 1 UA 89196 U -1 5 10 15 20 3. Відмивають клітини розчином PBS (2 мл) та відцентрифуговують (1500 хв , 5 хв), надосадову рідину зливають. 4. Пробу розводять у 250 мкл PBS (+ 200 мкл PBS). 5. У контроль 2 додають 3 мкл Н2О2 та інкубують протягом 15 хв за 37 °С. -1 6. Всі проби відмивають розчином PBS (2 мл) та відцентрифуговують (1500 хв , 5 хв), надосадову рідину зливають. 7. У контроль 2 та дослід додають CM-H2DCFDA (+ 2,5 мкл), інкубують 20 хв за 37 °C. -1 8. Всі проби відмивають розчином PBS (2 мл) та відцентрифуговують (1500 хв , 5 хв), надосадову рідину зливають. 9. Розводять розчином PBS (0,5 мл). Приготовлені проби аналізують за допомогою проточного цитофлуориметра або зберігають у холодильнику в темряві (не більше 1 доби). Приклади практичного застосування способу: Приклад 1. Дослідження кількісних змін АФК під впливом наночастинок магнітної рідини проводили на моделі АКЕ. Одній частині білих безпородних мишей вагою 35 г з перещепленою 6 внутрішньочеревно карциномою Ерліха із розрахунку 210 клітин на тварину на 7 день після перещеплення внутрішньочеревно вводили наночастинки магнітної рідини в концентрації 3 мг/кг маси тіла тварини. Результати оцінювали через 24 та 48 годин після дії цього чинника. Отримані з асцитної рідини проби пухлинних клітин після фарбування барвником CM-H2DCFDA за вище наведеною схемою оцінювали кількісно за допомогою проточного цитофлуориметра (проточний цитофлуориметр Beckman Coulter, USA, оснащений аргоновим лазером із довжиною хвилі 488 нм). Аналіз результатів дослідження показав, що через 24 години після впливу наночастинок магнітної рідини у концентрації 3 мг/кг у клітинах АКЕ значно підвищувалась генерація АФК порівняно з контролем (табл. 1). 25 Таблиця 1 Зміни АФК у клітинах АКЕ після введення наночастинок магнітної рідини різної концентрації Група тварин Контроль Fe3O4, 3 мг/кг Fe3O4, 6 мг/кг Показники зміни АФК 24 години 4,2±0,7 6,6±0,7* 7,7±0,9* 48 годин 3,7±0,5 5,4±0,5* 7,8±1,0* Примітка: * - зміни показників достовірні порівняно з контролем (р