Спосіб оцінки змін метаболізму реактивних форм кисню та азоту за умов дії низьких доз радіації

Реферат: Спосіб оцінки змін метаболізму реактивних форм кисню та азоту за умов дії низьких доз радіації, що передбачає проведення біохімічних досліджень. Додатково (одночасно) визначають вміст активних метаболітів кисню та стабільних метаболітів азоту. Отримані дані порівнюють з контролем і при їх зміні оцінюють зміни метаболізму реактивних форм кисню за умов дії низьких доз радіації. UA 84143 U (54) СПОСІБ ОЦІНКИ ЗМІН МЕТАБОЛІЗМУ РЕАКТИВНИХ ФОРМ КИСНЮ ТА АЗОТУ ЗА УМОВ ДІЇ НИЗЬКИХ ДОЗ РАДІАЦІЇ UA 84143 U UA 84143 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель, що заявляється, належить до медицини, а саме до радіаційної медицини, (радіобіології) і може бути використана для оцінки змін метаболізму реактивних форм кисню та азоту за умов дії низьких доз радіації. 2 Ендотелій - складний та багатофункціональний орган площею понад 5000 м і масою - 2-3 кг, який не просто утворює бар'єр між кров'ю та гладенькими м'язами судин, але діє і як модулятор функцій судин. Він є важливою ланкою формування та регуляції судинного тонусу завдяки синтезу і вивільненню вазоактивних речовин. Ендотелій є найбільш радіочутливим елементом судинної стінки [2, 3, 5, 7]. Одним з основних медіаторів судинної реактивності є оксид азоту (NO), який синтезується з L-аргініну трьома основними ізоформами NO-синтази (NOS): двома конститутивними - нейрональною (nNOS), ендотеліальною (eNOS) і індуцибельною (iNOS) [4, 6]. · Після відкриття системи NO стало зрозуміло, що не лише реактивні форми кисню (РФК: О2 , · · · ОН, стабільний Н2О2 та ін.), але і реактивні форми азоту (РФА: NO, NO2, ONOO , стабільні NO2 і NO3 та ін.) можуть чинити вазоактивну (вазопротекторну, вазотоксичну, вазоконстрикторну чи вазодилаторну) дію в серцево-судинній системі. Щодо ролі активних метаболітів кисню, то домінуюча концепція про виключно токсичну дію, останнім часом трансформувалася у їх токсичну дію при генерації у дозах, що перевищують фізіологічні, тоді як щодо останніх все очевидніше домінує думка, що вони виконують більш регуляторну, сигнальну функцію в серцево-судинній системі, в тому числі і щодо регуляції синтезу РФК і РФА. Ми вивчили певні біохімічні показники, що дозволяють судити про інтенсивність утворення як РФК, так і РФА у різних за радіочутливістю ліній мишей за умов постійного перебування у зоні відчуження (за хронічної дії низьких доз внутрішнього і зовнішнього /-опромінення). Дисфункція ендотелію за умов дії радіаційного фактора та старіння значною мірою пов'язана з дефіцитом ендотеліального NO, який може бути зумовлений пригніченням експресії NOS, зниженням синтезу NO eNOS, нестачею субстратів чи коферментів для синтезу NO, інактивацією NO РФК, синтезом ендогенних інгібіторів NOS, прискореним апоптозом і порушенням електричних реакцій ендотеліальних клітин. Усе це послаблює дію NO і ендотеліальних вазоконтрикторних факторів на судинні гладенькі м'язи [4, 10, 14]. Найбільш близьким аналогом (5) до способу, що заявляється, є спосіб визначення змін різних біохімічних показників на інтенсивність утворення як РФК, так і РФА у різних за радіочутливістю ліній мишей за умов постійного перебування у зоні відчуження (за хронічної дії низьких доз внутрішнього і зовнішнього опромінення). Недоліком цього способу є те, що він не дозволяє отримати достовірні дані про зміни метаболізму реактивних форм кисню та азоту. Задачею корисної моделі є дослідження особливостей метаболізму ендогенних рівнів реактивних форм кисню та азоту в аорті мишей ліній C57BL/6 і BALB/c при старінні за умов постійного перебування у зоні відчуження. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі, який передбачає проведення біохімічних досліджень, згідно з корисною моделлю, додатково (одночасно) визначають вміст активних метаболітів кисню та стабільних метаболітів азоту, отримані дані порівнюють з контролем і при їх зміні оцінюють зміни метаболізму реактивних форм кисню за умов дії низьких доз радіації. У гомогенаті аорти дорослих (6 міс.) і старих мишей (18 міс.) відносно радіочутливої лінії C57BL/6 та радіочутливої лінії BALB/c, які народилися і протягом усього свого життя перебували за умов зони відчуження (тварини знаходилися у віварії Інституту проблем безпеки атомних електростанцій НАН України, лабораторія експериментальної радіобіології і засобів радіозахисту, м. Чорнобиль), визначали вміст активних метаболітів кисню: супероксидного радикала (О2 ), гідроксильного радикала (ОН ), пероксиду водню (Н2О2)], активних метаболітів азоту [нітрит - (NO2 ) та нітрат - (NO3 )-аніонів], а також низькомолекулярних антиоксидантів (сечова кислота), продуктів ферментативного окислення ліпідів (тромбоксан В 2 - ТхВ2, лейкотриєн - LTC4). Контролем були 6-міс. миші обох ліній, що народилися і прожили своє життя за умов київського віварію за природного радіоактивного фону. Миші лінії C57BL/6 характеризуються середньою чутливістю до радіації: для самців ЛД 50/30 - 6,5 Гр, для самок - 6,7 Гр. Миші лінії BALB/c чутливі до дії радіації: для самців ЛД 50/30 < 5,7 Гр, для самок - 5,85 Гр [1]. Тварини цих ліній використовуються практично у всіх медичних та біологічних дослідженнях, які проводяться на лінійних мишах, а також як еталон для порівняння з особливостями інших інбредних ліній в галузі екології та радіобіології [1, 2]. Радіоактивне забруднення навколишнього середовища після аварії на Чорнобильській АЕС викликало підвищення рівня радіації на значних територіях України, особливо в зоні відчуження навколо станції. Тому проводилося дослідження кормів, які використовувалися для годування тварин, на радіоактивне забруднення. Встановлено, що цей показник (за -активними радіонуклідами) для 1 UA 84143 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зерна, що постійно використовується в середньому був - 1,550 Бк/кг. Тому цілком імовірним було також дослідження сумарної концентрації -випромінювачів та радіонуклідів з -активністю в тушках досліджуваних тварин, які по ретроспективній радіометрії не виявили накопичення радіонуклідів в органах і тканинах експериментальних тварин. Зовнішній фон у місці розташування тварин дорівнював 23-30 мкР/год. Згідно з даними звіту ДСНПП "Екоцентр" (1998) про радіаційну ситуацію в зоні відчуження, на основі картографічної 90 137 238-240 241 зйомки території м. Чорнобиля по розподілу Sr, Cs, Pu, Am у шару ґрунту 0-5 см від поверхні виявлено три зони з аномально високими рівнями вмісту вказаних радіонуклідів. 238-240 Територія віварію потрапляє до центру однієї з таких зон. На ній вміст радіонуклідів Рu 2 241 2 90 2 137 коливається від 2 до 3 кБк/м , Аm від 4 до 6,6 кБк/м , Sr від 100 до 180 кБк/м , Cs від 200 2 90 137 до 510 кБк/м . Співвідношення вказаних радіонуклідів є наступним: Sr - 30 %, Cs - 68 %, 241 238-240 Am - 0,3 %, Pu - 0,3 % [8]. Визначення вмісту Н2О2. Аліквоти проб (100-250 мкг білка) додавали в кварцову кювету (1 см), що містила 2 мл 0,1 моль розчину KJ, надлишок лактопероксидази (50 нмоль) у 0,05 моль фосфатному буфері (рН 7,33). Фіксували швидкі зміни екстинції проб при 353 нм. Вміст Н 2О2 виражали в пікомолях на мг білка проби, використовуючи коефіцієнт молярної екстинції =26000 -1 -1 моль см . · Визначення швидкості утворення супероксидного радикала. Вміст О2 в пробах визначали за окисненням цитохрому у 10 ммолях TRIS буфері (рН 7,4), фіксуючи зміни екстинції при 550 · нм після інкубації сумішей при 37 °С протягом 30 хв. Кількість О2 , генерованого пробами під -1 -1 час інкубації, визначали, використовуючи коефіцієнт молярної екстинції =21000 моль см . Визначення швидкості утворення ОН-радикала. Готували інкубаційну суміш [20 ммолів дезоксирибози, 1 ммоль Н2О2, 20 ммолів натрій-фосфатного буферу, рН 7,4 і проба (100-250 мкг білка)]. Інкубували суміш 30 хв при 37 °С після чого добавляли 0,5 мл 1 %-го розчину тіобарбітурувої кислоти в 50 ммолів NaOH і 0,5 мл 2,8 %-го розчину трихлороцтової кислоти. Отриману суміш витримували 20 хв на киплячій водяній бані, охолоджували і визначали величину екстинції при 532 нм. Кількість ОН-радикала, що генерувався при цьому за 30 хв 2 інкубації, виражали в умовних одиницях: Е·10 за 30 хв на 1 мг білка проби. Визначення вмісту NO2 , низькомолекулярних і високомолекулярних нітрозотіолів (НМНТ, ВМНТ). Спочатку досліджували за класичним методом Гріна, використовуючи реактив Гріса, сумарний вміст NO2 у гомогенаті аорти (вільний NO2 + NO2 , що утворюється при гідролізі НМНТ і ВМНТ). Аліквоту гомогенату гідролізували компонентом реактиву Гріна, що містить 2+ катіон Hg протягом 18 год., потім отримували безбілкові проби, осаджуючи білок хлорною кислотою в кінцевій концентрації 0,5 моль/л НСlО 4. Після центрифугування в надосадовій рідині визначали сумарний вміст NO2 , додаючи другий компонент реактиву Гріна. Отримували значення А1 (А1=вільний NO2 + ВМНТ + НМНТ). Визначання вмісту НМНТ. В безбілкових аліквотах гомогенатів аорти (осадження білків 0,5 2+ моль/л НСlО4) визначали вміст NO2 , використовуючи реактив Гріна з катіоном Hg для гідролізу НМНТ. Отримували значення А2 (А2=вільний NO2 + НМНТ). Визначання вмісту вільного NO2 . В безбілкових аліквотах гомогенатів аорти за допомогою 2+ реактиву Гріна без катіонів Hg визначали значення А3 (А3=вільний NO2 ). Після цього визначали вміст НМНТ і ВМНТ: вміст НМНТ=А2-А1 вміст ВМНТ=А3-А2. Визначення вмісту NO3 . Кількість NO3 визначали бруциновим методом у безбілкових аліквотах гомогенату аорти спектрофотометрично [11]. Визначення вмісту сечової кислоти. Вміст сечової кислоти визначали за допомогою стандартної добірки реактивів вітчизняного виробництва (фірма "Філісит Діагностика", Дніпропетровськ). Визначення вмісту тромбоксану В2 (ТхВ2) і лейкотриєну С4 (LTC4). Ейкозаноїди ТхВ2 і LTC4 визначали за допомогою RIA методу, використовуючи стандартні добірки реактивів фірми "Amersham" (Англія). Визначення вмісту білка. Вміст загального білка в пробах визначали загальновживаним методом Бредфорда, використовуючи барвник Cumassi G-250 ("Ferak", Німеччина) [8, 9, 11]. Дані обробляли методом варіаційної статистики з використанням комп'ютерних програм. В табл. 1 і 2 представлено абсолютні значення досліджених показників контрольної групи. Значення показників експериментальних груп представлено у відносних одиницях (значення в нормі приймаємо за 100 %). Ці результати представлено в табл. 3-4. Біохімічні показники вказують на те, що за тривалої дії низьких доз радіації має місце значна · активація генерації РФК в ендотеліальних і гладеньком'язевих клітинах аорти як О2 , так і ОНрадикали. Основним джерелом РФК швидше за все можуть бути мітохондрії, позаяк рівні · підвищення генерації О2 значно перевищують рівні підвищення пулів основних 2 UA 84143 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 немітохондріальних оксидаз - ксантиноксидази (маркер вміст сечової кислоти) і ліпідних оксидаз - ліпооксигенази (маркер вміст LTC4) і циклооксигенази (маркер вміст ТхВ2). · Швидкість генерації О2 (в мітохондріях) корелює із рівнем пошкодження NO-залежного розслаблення аорти. Так, у мишей лінії C57BL/6 він складав 958±84 % по відношенню до контрольних значень, тоді як у мишей лінії BALB/c лише 247±32 % через 6 міс. перебування у · зоні відчуження, а через 18 міс. рівні генерації О2 були однаково високими у мишей обох ліній відповідно 869±126 % і 864±75 % відносно контролю (табл. 3). Пули стабільного Н2О2 були підвищеними незначно (всього на 150-175 %) відносно контролю у мишей обох ліній протягом усього дослідженого періоду перебування у зоні відчуження (6-18 міс.). · Рівні генерації ОН-радикала були високими у мишей обох ліній, але вищий ступінь пошкодження ендотелію аорти супроводжувалась не вищими, а, навпаки, нижчими рівнями · генерації цього радикала. Так, через 6 міс. швидкість генерації ОН-радикала у мишей лінії C57BL/6 з більшими рівнями пошкодження складали 303±58 % відносно контролю, тоді у менш пошкодженому ендотелії аорти мишей лінії BALB/c - 758±144 %. Через 18 міс. ці рівні складали · відповідно 1480±219 % і 661±108 %, причому у мишей BALB/c з меншим рівнем генерації ОНрадикала відмічали більший ступінь пошкодження ендотелію (див. табл. 3). Окисний метаболізм L-аргініну (генерація РФА) в зоні відчуження за умов тривалої дії низьких доз радіації теж був підвищений, але в меншій мірі, ніж генерація РФК. При цьому достовірно підвищувалися лише пули нітрозильованих білків (ВМНТ) - максимально (624±26 %) через 18 міс. у мишей лінії C57BL/6, тоді як у мишей радіочутливої лінії BALB/c нітрозильованих білків було дещо нижче (401±96 % від рівня контролю), при цьому рівень пошкодження ендотелію у них, навпаки, був вищим. Аналогічно, у мишей лінії C57BL/6 через 6 місяців пули нітрозильованих білків були достовірно меншими (85±19 %) від таких у лінії BALB/c (151±30 %), при цьому ступінь пошкодження ендотелію у них, навпаки, був більшим (табл. 4). Отже, більшому рівню пошкодження ендотелійзалежних реакцій відповідає реципрокно менший рівень · нітрозилювання білків, аналогічно як і менший рівень генерації ОН-радикала. Більші пошкодження ендотелію за дії радіації обумовлюються також більш значним зниженням пулів NO2 і нітрозильованого глутатіону (НМНТ). Враховуючи той факт, що основним місцем синтезу NО є мітохондрії, можна припускати порушення цього процесу за дії радіації. Цікаво, що спостерігається певна кореляція між рівнем пошкодження ендотелію та пулами сечовини, основним місцем синтезу якої в аорті є мітохондріальна аргіназа II, що конкурує з NOсинтазами за спільний субстрат - L-аргінін [13]. В даному разі, вочевидь, конкуренція теж може мати місце, але ми спостерігали синхронне зниження пулів і NO 2 (маркер утворення NО), і сечовини (маркер активності аргінази). Так, при більш значному рівні пошкодження ендотелію (через 6 міс. у мишей лінії C57BL/6) спостерігали і більш значне пригнічення утворення NO 2 (в основному спонтанно при окисленні NО) і менше підвищення пулів сечовини (всього на 277±42 % проти 337±133 % у мишей лінії BALB/c) з меншим рівнем пошкодження ендотелію. Такі ж закономірності спостерігали і через 18 міс. - при більшому пошкодженні ендотелію у мишей лініїBALB/c спостерігали і менші пули NО 2 (139±16 % проти 407±82 %). Отже, можна зробити припущення, що більшому рівню пошкодження ендотелію за умов тривалої дії низьких доз радіації відповідає менший рівень генерації NО (при цьому окисний метаболізм L-аргініну спрямований на утворення не NО, а пероксинітриту (ОNОО ) за умов окисного стресу при · генерації значних кількостей О2 ) і менший рівень окисного аргіназного метаболізму аргініну, про що свідчать пули сечовини. Враховуючи, що як окисний процес генерації NO/ONOO , так і неокисний процес утворення сечовини має місце в основному в мітохондріях ендотеліальних і гладеньком'язових клітинах аорти [12, 15], можна зробити припущення, що вазотоксична дія низьких доз радіації обумовлюється саме порушенням мітохондріального гомеостазу, а саме - підвищенням · · генерації в них О2 і ОН-радикалів і, в меншій мірі, утворенням ONOO , одночасно із пригніченням утворення в них NО і низькомолекулярних нітрозотіолів (в основному нітрозоглутатіону). · Відмічено кореляцію між рівнями генерації ОН-радикала, активністю аргіназного · метаболізму L-аргініну і пошкодженням ендотелію. Позаяк відомо, що ОН-радикал є одним із · активаторів аргінази, меншим рівням генерації ОН-радикала відповідають менші пули сечовини (а, отже, і активності аргінази), що супроводжується більш значним пошкодженням ендотелію. Враховуючи цей факт, а також більш значне зниження пулів NO 2 при вищих рівнях пошкодження ендотелію, можна зробити припущення про активацію низькими дозами радіації процесу апоптозу в ендотеліальних клітинах, причому апоптозу в його класичному 3 UA 84143 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 мітохондріальнозалежному варіанті, опосередкованому (ініційованому) відкриттям мітохондріальної пори індикаторами РФК. З іншого боку, відомо, що відкриття пори пригнічується NО, але стимулюється ОNОО , а також, що потужним інгібітором пори є аміномасляна кислота (ГАМК), яка синтезується у мітохондріях з одного із продуктів аргіназного шляху - глутамату, що утворюється із орнітину. Отже, тривала дія низьких доз радіації супроводжується відкриттям мітохондріальної пори і ініціацією процесу апоптозу ендотеліальних клітин, внаслідок чого спостерігається практично повне знищення ендотелію, а отже і ендотелійзалежного розслаблення. Біохімічними причинами проапоптичної дії радіації є, з одного боку, стимуляція генерації РФК і ONOO в мітохондріях (індуктори відкриття пори і ініціатори апоптозу), а з іншого - пригнічення утворення NО і ГАМК (інгібітори відкриття пори). Спосіб, що заявляється, був апробований на базі радіологічного відділення КМКЛ № 14 та на кафедрі радіології та радіаційної медицини Національного медичного університету імені О.О. Богомольця. Джерела інформації: 1. Бландова З.К., Душкин В.А., Малашенко А.Н. и др. Линии лабораторных животных для медико-биологических исследований. - М.: Наука, 1983. - 180 с. 2. Воробьёв Е.И., Степанов Р.П. Ионизирующие излучения и кровеносные сосуды. - М.: Энергоатомиздат, 1985. - 296 с. 3. Лобанок Л.М., Лукша Н.П. Влияние гипоксии и аноксии на эндотелий-зависимые дилататорные реакции аорты крыс, подвергнутых воздействию низкоинтенсивных -излучений // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2002. - 42, № 2. - С. 498-502. 4. Мойбенко О.О., Сагач В.Ф., Ткаченко М.М. та ін. Фундаментальні механізми дії оксиду азоту на серцево-судинну систему як основи патогенетичного лікування її захворювань // Фізіол. журн. - 2004. - 50, № 1. - С. 11-30. 5. Руднев М.И., Варецкий В.В., Береговская Н.Н. и др. Влияние низких доз ионизирующей радиации и других факторов окружающей среды на организм. - К.: Наукова думка, 1994. - 216 с. 6. Ткаченко М.М. Оксид азоту та судинна регуляція // Журн. АМН України. - 1997. - 3, № 2. С. 241-254. 7. Ткаченко М.Н., Сагач В.Ф. Влияние малых доз радиации на сократительные ответы сосудистых гладких мышц при растяжении // Биофизика. - 1997. - 42, вып. 3. - С. 729-732. 8. Ткаченко М.М., Сагач В.Ф., Базілюк О.В. та ін. Вікові особливості змін скорочувальних судинних реакцій і вміст вільних радикалів кисню та метаболітів оксиду азоту у мишей лінії BALB/c за умов перебування у зоні відчуження // Фізіол. журнал. - 2005. - 51, № 3. - С. 32-41. 9. Ткаченко М.Н., Коцюруба А.В., Базилюк О.В. и др. Сосудистая реактивность и метаболизм реактивных форм кислорода и азота при действии низких доз радиации // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2009. - 49, № 4. - С. 462-472. 10. Фролькис В.В., Безруков В.В., Кульчицкий O.K. Старение и экспериментальная патология сердечно-сосудистой системы. - К.: Наук, думка, 1994. - 248 с. 11. Basaga H.S. Biochemical aspects of free radicals // Cell. Biol. - 1990. - 68, № 5. - P. 989-998. 12. Beckman J.S., Beckman J.W., Chen J. et al Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1990. - 87, № 7. - Р. 1620-1624. 13. Durante W., Johnson F.K., Johnson A.J. Arginase: a critical regulator of nitric oxide synthesis and vascular function // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. - 2007. - 34, № 9. - P. 906-911. 14. Gajdusek C, Onoda K., London S. et al. Early molecular changes in irradiated aortic endothelium // J. Cell Physiol. - 2001. - 188, № 1. - P. 8-23. 15. Honston M, Chumley P., Radi R. et al. Xanthine oxidase reaction with nitric oxide and peroxynitrite // Arch. Biochem. Biophys. - 1998. - 355, № 1. - P. 1-8. 50 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 Спосіб оцінки змін метаболізму реактивних форм кисню та азоту за умов дії низьких доз радіації, що включає проведення біохімічних досліджень, який відрізняється тим, що додатково (одночасно) визначають вміст активних метаболітів кисню та стабільних метаболітів азоту, отримані дані порівнюють з контролем і при їх зміні оцінюють зміни метаболізму реактивних форм кисню за умов дії низьких доз радіації. 4 UA 84143 U Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5