Спосіб моделювання гіногенезу для створення алоплазматичних ліній цукрових буряків з цитоплазматичною чоловічою стерильністю від дикої форми буряків beta vulgaris ssp maritima l.

Реферат: UA 89503 U UA 89503 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до селекції рослин і може бути використана в сільському господарстві для збагачення генетичного різноманіття, стерильних цитоплазм, підвищення ефективності створення промислово цінних форм цукрових буряків з ЦЧС від дикої форми, нових стерильних аналогів ліній 0-типу. В зв'язку з використанням в селекційних програмах цукрових буряків роздільноплідних пилкостерильних форм з єдиною цитоплазмою S і ростом вірусних захворювань, наявна проблема генетичноюї уніфікації материнського компонента гібридів за єдиною цитоплазмою. Незважаючи на те що нові стерильні цитоплазми виділені та ідентифіковані зарубіжними дослідниками ЦЧС, більшість гібридів цукрових буряків з дикою формою практично не використовується. Це пояснюється тим, що виділення стерильних аналогів, ліній закріплювачів стерильності є довготривалою справою при міжвидовій і міжродовій гібридизації та потребує не менше 8-10 циклів насичуючих схрещувань (Боземарк, 1999; Kubo Т, 2006; Малецкий С.И., 2005). Відомий спосіб одержання ЧС-форм, при якому стерильні за пилком материнські рослини схрещують із закріплювачами стерильності 0-типу (Балков И.Я. Селекция сахарной свеклы на гетерозис. // - М., Россельмаш - 1978 - 178 с. (14)). Відомий спосіб має такі спільні з запропонованою корисною моделлю ознаки: - використання ліній 0-типу, як аналізаторів, для пошуку нових джерел цитоплазматичної чоловічої стерильності (ЦЧС); - відбір гібридів F1 чс 0 і чс 1 типу за Оуеном (1945). Однак, незважаючи на наявність у відомому способі цих спільних ознак, для створення стерильних аналогів на основі нових джерел стерильності необхідні додаткові схрещування, які б забезпечували заміщення геному дикої форми з домінантними ознаками: дерев'янистість кореня, нерівномірне дозрівання насіння, низьку цукристість, однорічний цикл розвитку. Найбільш близьким до даної корисної моделі за сукупністю ознак є спосіб одержання гомозиготних рослин. Патент на винахід 21403А (Україна). Парій Ф.М., Рябовол Л.О., Небикова Т.А. - 1997 р. Найбільш близький спосіб має такі спільні суттєві з запропонованою корисною моделлю ознаки: - виділення ізольованих насіннєбруньок від гетерозиготних за забарвленням гіпокотеля рослин; - культивування їх на поживних середовищах in vitro; - ідентифікація регенераційноздатних калюсних культур і проростків прямої регенерації за плоїдністю; - відбір гаплоїдів і дигаплоїдів за рецесивною ознакою відсутності антоціанового забарвлення in vitro (r-r-). Проте у найбільш близькому способі для створення дигаплоїдних ліній із виділених гаплоїдних мікророслин запропоновано використовувати середовище з 0,1 % колхіцином, а визначення плоїдності регенерантів можливе лише за допомогою складного цитологічного аналізу, де при цьому аналізується апікальна меристема одного із клонів і ми стабілізуємо надалі регенеранти із сусідніх клонів випадкової і дуже часто іншої плоїдності. Найбільш близький спосіб не може забезпечити заміщення геному дикої форми буряків в повній мірі лише за однією рецесивною ознакою так, як не передбачає детермінації за морфологічними маркерними ознаками вихідних батьківських форм, а тому за умов лише гетерозиготності алелей антоціанового забарвлення гіпокотелю донорів насіннєбруньок, не може бути використаний для створення алоплазматичних ліній на основі нових джерел стерильності. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб моделювання гіногенезу для створення алоплазматичних ліній цукрових буряків з цитоплазматичною чоловічою стерильністю від дикої форми буряків Beta vulgaris ssp maritima L. шляхом зменшення циклів з 8-10 до 3-х, завдяки упередженим схрещуванням моделюванню гіногенезу, вдосконаленого доборами in vitro за генетичними селективними маркерами та диференціації дигаплоїдів з використанням цитофометричних методів. В запропонованій корисній моделі моделювання гіногенезу для створення алоплазматичних ліній цукрових буряків з ЦЧС від дикої форми буряків Beta vulgaris ssp maritima L. добір гетерозиготних рослин на відміну від близького способу здійснюється в результаті схрещування чітко відібраних компонентів. Основними відмінними суттєвими ознаками корисної моделі є: - відбір донорів нових стерильних цитоплазм від дикої форми буряків з маркерним антоціановим забарвленням гіпокотелю (R+r-R+R+); 1 UA 89503 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 - схрещування з закріплювачами стерильності цукрових буряків, лише домінантними гомозиготами за рецесивною ознакою забарвлення гіпокотелю r-r-; - гібридизація за схемою Beta maritima R+r-B+B+x Beta vulgaris N xxzz r-r-b-b-; - відбір гаплоїдів за рецесивними щепленими ознаками (r-b-) присутності алелей зеленого забарвлення (r-) мікроклонів від закріплювачів стерильності цукрових буряків і дворічного циклу розвитку (b-); - спонтанна поліплоїдизація і застосування цитофотометричних методів для одержання дигаплоїдних регенерантів (r-r-в-в-); Нові (відмінні) ознаки при взаємодії з відомими ознаками забезпечують виявлення нових технічних властивостей корисної моделі. Проведення обов'язкових упереджених схрещувань донорів нових стерильних цитоплазм від дикої форми буряків з антоціановим забарвленням гіпокотеля і закріплювачами стерильності цукрових буряків за рецесивною ознакою (r-r-). Відбір гетерозигот F1, з присутністю антоціанового забарвлення гіпокотелю серед проростків насіння, є вихідним матеріалом для моделювання гіногенезу і одержання гаплоїдів та дигаплоїдів за рецесивною ознакою. Використання групи щеплених генів R+B+, r-b- є відміною суттєвою ознакою від близького способу і необхідною умовою для створення нових плазмотипів із стерильною цитоплазмою від дикої форми буряків. Спосіб моделювання гіногенезу для створення алоплазматичних ліній цукрових буряків з цитоплазматичною чоловічою стерильністю від дикої форми буряків Beta vulgaris ssp maritima L. здійснюється наступним чином: 1. Серед проростків насіння гібридів F1 (Beta maritima S x Beta vulgaris Nxxzz) проводять добір гетерозигот за забарвленням гіпокотеля (R+ r-); 2. Виділяють однорічні рослини з ЦЧС (чс-0 і чс-1 типу), депонують в умовах in vitro і використовують як донорів нових плазмотипів. 3. Після тиражування в умовах in vitro вкорінюють мікроклони і отримують стерильні за пилком насіннєві рослини з однолітнім циклом розвитку. 4. Методом індукції насіннєбруньок виділяють гаплоїдні і дигаплоїдні регенеранти. 5. Відбирають мікророслини для вкорінення в умовах in vitro з відсутністю антоціанового забарвлення і двохрічним циклом розвитку (фенотип-цукрові буряки). 6. Вибраковують мікророслини з антоціановим забарвленням і однорічним циклом розвитку в умовах in vitro на основі генетичної моделі (креслення - схема моделювання гіногенезу за генетичними селективними маркерами для добору нових плазмотипів). В генетичній моделі упереджених схрещувань, схрещують реципієнт - донорну рослину з новою стерильною цитоплазмою і червоним забарвленням гіпокотелю із запилювачем донором рецесивних алелей r-r-. Серед проростків насіння, отриманого в результаті пророщування перших беккросних потомств F1 виділяють рослини гетерозиготні за антоціановим забарвленням гіпокотелю. Відбирають насінники чс 0 і чс 1 типу, депонують і вкорінюють в умовах in vitro. Індукція гаплоїдів проводиться методом гіногенезу і виділяють регенеранти з зеленим забарвленням мікророслин, а також диференціюють дигаплоїдні рослини з використанням цитофотометричних методів (АП "Partec"). Від схрещування реципієнта з донором двох рецесивних алелей, утворюється фенотипово однорідне насіння гібридів F1 у випадку дикої форми Beta maritima L., як домінантної гомозиготи (R+R+) і 50 % генотипу R+r- і r-r- у випадку гетерозиготи за антоціановим забарвленням гіпокотеля. В популяції дикої форми буряків, як правило, присутній ген однорічного циклу розвитку (В+В+) в формі домінантної гомозиготи. Відбираємо для нових насичуючих схрещувань регенеранти з відсутністю антоціанового забарвлення клонів. Індуковані спонтанно дигаплоїдні регенеранти r-r- в процесі культивування in vitro відбираємо з використанням цитофотометричних методик АП "Partec", вкорінюємо в ґрунті і досліджуємо за ознаками роздільно плідності і стерильності. Генетичний аналіз в умовах in vitro проводимо за щепленими алелями R+B+, r-b- присутності і відсутності антоціанового забарвлення мікророслин та ідентифікації однолітнього і дволітнього циклу розвитку за фенотипом (дика форма, цукрові буряки). 2 UA 89503 U Таблиця 1 Аналіз розщеплення дигаплоїдів за генами антоціанового забарвлення однорічного і дворічного циклу розвитку від гібридів F 1S (Греція) R+r-B+bФенотипи Забарвлені однорічні - Зелені дворічні r b + + R B + + F1 № 2 S (Греція) xxzz R r -B b х Beta vulqaris Nxxzzbbrr Фактичні 53 15 Очікувані q при 1:1 34 34 Відхилення d +19 -19 2 d /q 10,62 10,62 + - + F1 № 7 S (Греція) xxzz R r В b х Beta vulqaris Nxxzzbbrr Фактичні 27 30 Очікувані q при 1:1 28 28 Відхилення d -1 +2 2 d /q 0,035 0,143 Дані 5 Сума  2 X 68 68 0 21,24 57 57 0 0,178 Спосіб створення алоплазматичних ліній з ЦЧС від дикої форми буряків Beta maritime L. завдяки впровадженню методу упереджених схрещувань, експериментального моделювання гіногенезу in vitro за щепленими генами антоціанового забарвлення і однорічного та дворічного циклу розвитку, дозволяє прискорити селекційний процес з 8-10 до 3 років. Використання цитофотометричних методів для добору за рівнем геному гаплоїдів і дигаплоїдів вилучає з експерименту шкідливу мутагенну речовину колхіцин, є екологічно безпечнішим, бо знижує трудозатратність цитологічних досліджень. 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Спосіб моделювання гіногенезу для створення алоплазматичних ліній цукрових буряків з ЦЧС від дикої форми буряків Beta vulgaris ssp maritima L., що включає: схему беккросних схрещувань, відбір алоплазмотичних ліній від гібридів F1, який відрізняється тим, що відбір донорів нових стерильних цитоплазм проводять від дикої форми буряків з маркерним антоціановим забарвленням гіпокотелю (R+r-R+R+); схрещування з закріплювачами стерильності цукрових буряків проводять лише з домінантними гомозиготами за рецесивною ознакою забарвлення гіпокотелю r-r-; гібридизацію проводять за схемою Beta maritima R+rB+B+x Beta vulgaris Nxxzz r-r-b-b-; відбір гаплоїдів проводять за рецесивними щепленими ознаками (r-b-) присутності алелей зеленого забарвлення (r-) мікроклонів від закріплювачів стерильності цукрових буряків і дворічного циклу розвитку (b-); спонтанною поліплоїдизацією і застосуванням цитофотометричних методів для одержання дигаплоїдних регенерантів (r-r-в-в-). 3 UA 89503 U Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4