Спосіб отримання мініатюрних насінників цукрових буряків в культурі in vitro

Реферат: UA 92393 U UA 92393 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до сільського господарства і може бути використана в сільськогосподарській біотехнології та селекції для прискорення селекційного процесу. Відомо вирощування та вкорінення мікроклонів цукрових буряків в умовах in vitro [Ильенко И.И. Микроклональное размножение и сохранение селекционного материала сахарной свеклы в культуре in vitro //Физиология и биохимия культурных растений. - 1983. Т. 15, № 4. - С. 351355, Роїк М.В., Редько В.I., Нурмухамедов А.К., Кулік О.Г. Оптимізація методів клонального мікророзмноження цукрових буряків // Цукрові буряки. - 2004. № 5. - С. 12], що забезпечує тільки розмноження, вкорінення у вигляді розетки та збереження мікроклонів в умовах in vitro, а не генеративний розвиток мікроклонів. Відомий спосіб збереження мікророслин буряків в умовах in vitro [Патент № 16702 від 15.08.2006 р. "Спосіб довготривалого збереження буряків в умовах in vitro"], в якому збереження мікророслин проводять при температурі 3-6 °C, 14-16-годинному фотоперіоді та освітленні 1-2 клк. Мікроклони зберігають на певному живильному середовищі без кореневої системи. Тоді як в способі, що пропонується, охолоджують експланти - гілочки з пуп'янками, квітками для запобігання реверсії розвитку та поверненню до вегетативного розвитку (утворення на верхівці стебла розетки листків) на живильному середовищі, яке стимулює утворення кореневої системи. Найбільш близьким за сукупністю ознак до запропонованого способу є "Спосіб стимуляції цвітіння цукрових буряків в культурі in vitro", який полягає в тому, що рослини вирощують в умовах in vitro, яровизацію мікроклонів проводять in vitro на модифікованому агаризованому середовищі Гамборга або Мурасіге-Скуга з вітамінами: тіамін - 1-10 мг, піридоксин та нікотинова кислота по 1 мг на літр середовища, з додаванням 0,1-0,2 мг/л БАП або 1-5 мг/л проліну, мікророслини витримують в холодильній камері 42-70 діб, з освітленням 14-16 годин на добу. Після яровизації для утворення стебла мікроклони пересаджують на модифіковане живильне середовище Гамборга або Мурасіге-Скуга, до складу якого додатково вводять 1-10 мг/л тіаміну, 1 мг/л піридоксину, 1 мг/л нікотинової кислоти, 5-15 мг/л гібереліну, 10-25 мг/л аскорбінової кислоти, утримують у стандартних умовах культивування. Після утворення стебла для появи генеративних органів мікророслини пасивують на модифіковане агаризоване середовище Гамборга або Мурасіге-Скуга, до складу якого вводять 1-10 мг/л тіаміну, 1 мг/л піридоксину, 1 мг/л нікотинової кислоти, 1-5 мг/л проліну та знов розміщують в холодильній камери, але за температури 10-16 °C, освітленні 1-2 клк протягом 14-16 годин до появи генеративних органів цвітіння. Відомий та пропонований способи мають спільні суттєві ознаки: стерилізація експлантів, охолодження мікророслин в холодильній камері, вкорінення, цвітіння in vitro. Але відомий спосіб не забезпечує отримання мікронасінників цукрових буряків в культурі in vitro. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб отримання мікронасінників цукрових буряків в культурі in vitro шляхом вкорінення експлантів з насінників цукрових буряків з бутонами або з бутонами та квітками на певному живильному середовищі без реверсії розвитку рослин з генеративного до вегетативного. Поставлена задача вирішується тим, що cпосіб отримання мікронасінників цукрових буряків в культурі in vitro, що включає отримання експлантів, стерилізацію, вкорінення, культивування їх в холодильній камері з температурою повітря 3-10 °C з фотоперіодом 14-16-годин освітлення 12 клк, згідно з корисною моделлю, як експланти використовують гілочки з бутонами, квітками, які відокремлюють з насінників цукрових буряків у фазі бутонізації - цвітіння in vivo, вичленовують експланти розміром 1,5-3 см, розміщують їх на живильному середовищі - модифікованому середовищі Мурасіге-Скуга, що містить ½ дози макроелементів та повну дозу мікроелементів з додаванням вітамінів: нікотинової кислоти, піридоксину, тіаміну та аскорбінової кислоти по 1 мг/л, амінокислот: глютамінової - 250-500 мг/л, аспарагінової кислоти - 30-50 мг/л, тирозину - 110 мг/л, аргініну - 2-10 мг/л, гідроксипроліну - 2-4 мг/л, регуляторів росту: 2,4-Д - 1-2,0 мг/л та БАП - 0,3-0,8 мг/л, а в холодильній камері витримують експланти для їх вкорінення та запобігання реверсії розвитку генеративного на вегетативний, після формування кореневої системи мікророслини переносять в культуральну кімнату, температурою повітря 18-24 °C, з фотоперіодом 16-годин освітлення 2-5 клк, де отримують мікронасінники цукрових буряків з ремонтантним типом цвітіння, відокремлюють вторинні експланти з мікронасінників in vitro, субкультивують на модифікованому середовищі Мурасіге-Скуга, що містить ½ дози макроелементів та повну дозу мікроелементів, з додаванням вітамінів: нікотинової кислоти - 0,5 мг/л, піридоксину - 0,1 мг/л, тіаміну - 0,1-0,5 мг/л, аскорбінової кислоти - 1 мг/л, а також глютамінової амінокислоти - 250-300 мг/л, регуляторів росту: НУК - 1,0 мг/л та ГК - 0,1-0,05 мг/л, вкорінюють та отримують нові мікронасінники та депонують їх в умовах in vitro, що дає змогу 1 UA 92393 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 безперервно отримувати квіткові пагони та рослини цукрових буряків з ремонтантним цвітінням. Новими суттєвими ознаками корисної моделі є: - використання для отримання мікронасінників цукрових буряків в умовах in vitro експлантів з насінників цукрових буряків в період їх бутонізації або цвітіння; - вкорінення експлантів в умовах in vitro в холодильній камері за температури 3-10 °C, освітленні 1-2 клк з довжиною світлового періоду 14-16 годин для запобігання реверсії розвитку рослин та поверненню з генеративного до вегетативного розвитку; - отримання мікронасінників цукрових буряків в умовах in vitro з ремонтантним типом цвітіння. - склад живильного середовища для стимуляції коренеутворення та цвітіння при охолодженні генеративних пагонів - експлантів з насінників цукрових буряків in vivo в період їх бутонізації або цвітіння - Мурасиге-Скуга (1/2 дози макроелементів, мікроелементи у повній дозі) + амінокислоти: глютамінова - 250-500 мг/л, аспарагінова кислоти - 30-50 мг/л, тирозин - 110 мг/л, аргінін - 2-10 мг/л, гідроксипролін - 2-4 мг/л + регулятори росту: БАП - 0,3-0,8 мг/л, 2,4-Д - 1-2 мг/л, або НУК - 0,1-1 мг/л, або ІМК - 0,1-1 мг/л - склад живильного середовища для утворення мікронасінників при субкультивуванні вторинних експлантів (експлантів з мікронасінника in vitro) - модифіковане агаризоване середовище Гамборга або Мурасіге-Скуга, що містить ½ дози макроелементів та мікроелементи у повній дозі, до складу якого додатково вводять: тіамін - 0,1-0,5 мг/л, піридоксин - 0,1-0,5 мг/л, нікотинову кислоту - 0,5 мг/л, аскорбінову кислоту - 1 мг/л, глютамінову амінокислоту - 250-300 мг/л, НУК 0,5-1,0 мг/л або те ж + ГК - 0,5-1,0 мг/л. Відмінні від найближчого аналога (нові суттєві ознаки) при взаємодії з відомими дозволяють отримати мікронасінники цукрових буряків в умовах in vitro. Спосіб здійснюють таким чином. Від насінників цукрових буряків у фазі бутонізації - цвітіння in vivo відокремлюють гілочки з бутонами, стерилізують їх, вичленовують експланти розміром 1,5-3 см, висаджують на модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, що містить ½ дози макроелементів та повну дозу мікроелементів з додаванням вітамінів: нікотинової кислоти, піридоксину, тіаміну та аскорбінової кислоти по 1 мг/л, амінокислот: глютамінової - 250-500 мг/л, аспарагінової кислоти - 30-50 мг/л, тирозину - 1-10 мг/л, аргініну - 2-10 мг/л, гідроксипроліну - 2-4 мг/л, регуляторів росту: 2,4-Д - 12,0 мг/л та БАП - 0,3-0,8 мг/л та культивують в холодильній камері з температурою повітря 310 °C - 14-16-годинному фотоперіоді та освітленні 1-2 клк, де витримують до утворення корінців. Після формування кореневої системи мікророслини переносять в культуральну кімнату з освітленням 1-5 клк, 16-годинному фотоперіоді, температурі повітря 18-24 °C, де вирощують сформовані мікронасінники цукрових буряків та депонують в умовах in vitro. З утвореного в умовах in vitro мікронасінника відокремлюють нові експланти, та імплантують їх на нове живильне середовище – модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, що містить ½ дози макроелементів та повну дозу мікроелементів з додаванням вітамінів: нікотинової кислоти - 0,5 мг/л, піридоксину - 0,1 мг/л, тіаміну - 0,1-0,5 мг/л, аскорбінової кислоти - 1 мг/л та глютамінової амінокислоти - 250-300 мг/л, регуляторів росту: НУК - 1,0 мг/л та ГК - 0,1-0,05 мг/л та культивують в приміщенні з освітленням 1-5 клк, 16-годинному фотоперіоді, температурою повітря 16-24 °C, що призводить до утворення нових мікронасінників з квітковими бруньками, квітками, корінням. Дані, що наведені в таблиці, свідчать, що холодова обробка експлантів - пагонів з бутонами розміром 1,5-3 см, отриманих з насінників цукрових буряків in vivo, запобігає онтогенетичній регресії, яка властива цукровим бурякам. Так, при культивуванні експлантів з насінників цукрових буряків в умовах культуральної кімнати з освітленням 1-5 клк, 16-годинному фотоперіоді, температурі повітря 22-30 °C - вегетативних утворень - розеток листя на верхівках експлантів (табл.). Причому, таке явище найбільш виражене при культивуванні експлантів на середовищі з цитокінінами (варіанти). Додавання у живильне середовище гіберелінів призводило до подальшого подовження стебла без утворення нових квіткових бруньок (варіант 3), ауксинів - утворення коренів на базальному кінці експланту та вегетативних утворень - на апікальному, що ускладнювало підтримання репродуктивного стану експлантів (цвітіння) в умовах in vitro (варіант 5). При охолодженні експлантів утворення розетки на генеративному стеблі не спостерігалося (варіанти 2, 4, 6), але на середовищах з цитокінінами та гіберелінами вкорінення експлантів не відбувалося. До того ж на середовищі з гіберелінами в дозі 10-25 мг/л при охолодженні відбувалася вітрифікація експлантів (варіант 4). При культивуванні експлантів в холодильній камері на середовищі з переважаючим кількісним вмістом ауксинів (для індукції коренеутворення), з додаванням цитокінінів, вітамінів та амінокислот (для кращого збереження експлантів та мікророслин в умовах знижених 2 UA 92393 U температур) спостерігали утворення розгалуженого мікронасінника цукрових буряків з новоутвореними бутонами, квітками, насінням. Таблиця Вплив живильного середовища та умов культивування на розвиток експлантів - пагонів з бутонами розміром 1,5-3 см, отриманих з насінників цукрових буряків in vivo в культурі in vitro № 1. 2. 3. 4. 5. 6. Живильне середовище та умови культивування Гамборга або Мурасіге-Скуга + вітаміни: тіамін 1-10 мг/л, піридоксин 1 мг/л, нікотинова кислота 1 мг/л + 0,1-0,2 мг/л БАП або пролін - 1-5 мг/л, (середовище прототипу), без охолодження Гамборга або Мурасіге-Скуга + вітаміни: тіамін 1-10 мг/л, піридоксин - 1 мг/л, нікотинова кислота 1 мг/л + БАП - 0,1-0,2 мг/л або пролін - 1-5 мг/л, охолодження (прототип) Гамборга або Мурасіге-Скуга + тіамін-1-10, піридоксин - 1 мг/л, нікотинова кислота - 1 мг/л, аскорбінова кислота - 5-15 мг/л, гіберелін - 10-25 мг/л, без охолодження Гамборга або Мурасіге-Скуга + тіамін-1-10, піридоксин - 1 мг/л, нікотинова кислота - 1 мг/л, аскорбінова кислота - 5-15 мг/л, гіберелін - 10-25 мг/л, охолодження * Мурасіге-Скуга (1/2 дози макроелементів, мікроелементи у повній дозі) + вітаміни: нікотинова, аскорбінова кислоти, піридоксин, тіамін по 1 мг/л + аміно-кислоти: глютамінова 250-500 мг/л, аспарагінова - 30-50 мг/л, тирозин 1-10 мг/л, аргінін - 2-10 мг/л, гідроксипролін - 2-4 мг/л + БАП - 0,3-0,8 мг/л, 2,4-Д - 1-2 мг/л, або НУК - 0,1-1 мг/л, або ІМК - 0,1-1 мг/л, без охолодження Мурасіге-Скуга (1/2 дози макроелементів, мікроелементи у повній дозі) + вітаміни: нікотинова, аскорбінова кислоти, піридоксин, тіамін по 1 мг/л + амінокислоти: глютамінова 250-500 мг/л, аспарагінова - 30-50 мг/л, тирозин 1-10 мг/л, аргінін - 2-10 мг/л, гідроксипролін - 2-4 мг/л + БАП - 0,3-0,8 мг/л, 2,4-Д - 1-2 мг/л, або НУК - 0,1-1 мг/л, або ІМК - 0,1-1 мг/л, охолодження Розвиток мікроклонів Розетка на ВкоріненРіст пагоні з Цвітіння ня стебла бутонами + + + + + + + + + + + + + + * вітрифікація експлантів 5 10 15 Відокремлення нових експлантів з такого, утвореного в умовах in vitro мікронасінника, та імплантація їх на нове живильне середовище - модифіковане середовище Мурасіге-Скуга, що містить ½ дози макроелементів та повну дозу мікроелементів з додаванням вітамінів: нікотинової кислоти - 0,5 мг/л, піридоксину - 0,1-0,5 мг/л, тіаміну - 0,1-0,5 мг/л, аскорбінової кислоти - 1 мг/л та глютамінової амінокислоти - 250-300 мг/л, регуляторів росту: НУК - 1,0 мг/л та ГК - 0,1-0,05 мг/л, культивування в приміщенні з освітленням 1-5 клк, 16-годинному фотоперіоді, температурою повітря 16-24 °C призводить до утворення нових мікронасінників з квітковими бруньками, квітками, корінням. Встановлено, що при культивуванні нових експлантів за більш високих температур (2530…°С) відбувається подальший ріст стебла та збільшується ризик реверсії генеративного розвитку рослин. А подальше зниження температури < 16 °C гальмує ріст пагонів мікронасінників. 3 UA 92393 U 5 Таким чином, субкультивування вторинних експлантів з мікронасінників in vitro дає змогу безперервно отримувати квіткові пагони та рослини цукрових буряків з ремонтантним цвітінням. Пропонований спосіб отримання мікронасінників цукрових буряків в культурі in vitro сприятиме прискоренню селекційного процесу завдяки тому, що надає можливість депонувати мікророслини з квітками, фертильним пилком, підтримувати цвітіння таких мікророслин та тривало, не залежно від пори року, забезпечити селекційний процес донорними органами (насіннєві зачатки, пиляки) та пилком. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 20 25 30 Спосіб отримання мікронасінників цукрових буряків в культурі in vitro, що включає отримання експлантів, стерилізацію, вкорінення, культивування їх в холодильній камері з температурою повітря 3-10 °C з фотоперіодом 14-16-годин освітлення 1-2 клк, який відрізняється тим, що як експланти використовують гілочки з бутонами, квітками, які відокремлюють з насінників цукрових буряків у фазі бутонізації - цвітіння in vivo, вичленовують експланти розміром 1,5-3 см, розміщують їх на живильному середовищі - модифікованому середовищі Мурасіге-Скуга, що містить ½ дози макроелементів та повну дозу мікроелементів з додаванням вітамінів: нікотинової кислоти, піридоксину, тіаміну та аскорбінової кислоти по 1 мг/л, амінокислот: глютамінової - 250-500 мг/л, аспарагінової кислоти - 30-50 мг/л, тірозину - 1-10 мг/л, аргініну - 210 мг/л, гідроксипроліну - 2-4 мг/л, регуляторів росту: 2,4-Д - 1-2,0 мг/л та БАП - 0,3-0,8 мг/л, а в холодильній камері витримують експланти для їх вкорінення та запобігання реверсії розвитку генеративного на вегетативний, після формування кореневої системи мікророслини переносять в культуральну кімнату, температурою повітря 18-24 °C, з фотоперіодом 16-годин освітлення 25 клк, де отримують мікронасінники цукрових буряків з ремонтантним типом цвітіння, відокремлюють вторинні експланти з мікронасінників in vitro, субкультивують на модифікованому середовищі Мурасіге-Скуга, що містить ½ дози макроелементів та повну дозу мікроелементів, з додаванням вітамінів: нікотинової кислоти - 0,5 мг/л, піридоксину - 0,1 мг/л, тіаміну - 0,1-0,5 мг/л, аскорбінової кислоти - 1 мг/л, а також глютамінової амінокислоти - 250-300 мг/л, регуляторів росту: НУК - 1,0 мг/л та ГК - 0,1-0,05 мг/л, вкорінюють та отримують нові мікронасінники та депонують їх в умовах in vitro. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4