Спосіб оцінки мутагенної активності лікарських препаратів і допоміжних фармацевтичних речовин

Реферат: UA 95582 U UA 95582 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі фармакологічної генетики, а саме індукованого мутагенезу і призначена для оцінки мутагенної активності лікарських препаратів і допоміжних фармацевтичних речовин. Профілактика індукованого мутагенезу базується на широкому генетичному скринінгу, спрямованому на виявлення й усунення з фармацевтичної промисловості речовин з мутагенними властивостями. Специфічність біологічного об'єкта, на якому вивчається дія мутагену, а також специфічність мутаційного процесу, індукованого чинником, призводять до необхідності застосування декількох тест-систем - створення інтегральних схем, які включають набір (батареї) тестів з використанням різних тест-об'єктів, здатних виявляти як первинні пошкодження ДНК і генні мутації, так і хромосомні аберації в системах in vitro та in vivo. Найближчим аналогом способу, що заявляється, є спосіб для оцінки мутагенних властивостей нових лікарських препаратів [1], який складається з двох етапів: I етап - попередня оцінка мутагенної активності. Основними методами є напівкількісний метод обліку мутацій на мікроорганізмах (тест Еймса) та мікроядерний тест на клітинах кісткового мозку лабораторних тварин; II етап - кінцева кількісна оцінка мутагенної активності фармакологічних препаратів. Основні методи: метафазний аналіз аберацій хромосом у клітинах кісткового мозку ссавців (або у клітинах зародків тварин на постімплантаційних стадіях розвитку) та облік домінантних летальних мутацій у статевих клітинах самців лабораторних тварин. Недоліком існуючого способу можна вважати використання таких методів досліджень, частина з яких є економічно недоцільною. Виникає необхідність використання більш дешевих короткострокових методів. Численні дослідження засвідчують, що Drosophila melanogaster належить до високоінформативних та економічних тест-об'єктів. На дрозофілі можна вивчати весь спектр генетичних змін як у соматичних, так і статевих клітинах [2, 3]. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу тестування мутагенної активності лікарських препаратів і допоміжних фармацевтичних речовин, у якому за рахунок використання методів оцінки мутагенності на Drosophila melanogaster створюються нова сукупність ознак, що призводить до підвищення економічності, інформативності та експресності тестування. Поставлена задача вирішується таким чином, що у способі оцінки мутагенної активності лікарських препаратів, який включає етап попередньої оцінки in vitro з використанням як тестоб'єктів бактеріальних клітин з подальшим обліком їх генних мутацій і соматичних клітин ссавців та етап кінцевої кількісної оцінки з використанням як тест-об'єктів клітин кісткового мозку ссавців з подальшим обліком у них хромосомних аберацій у статевих клітинах ссавців з обліком домінантних летальних мутацій, на відміну від прототипу корисною моделлю передбачено, що етап попередньої оцінки включає як тест-об'єкт культуру лімфоцитів людини з подальшим обліком у ній хромосомних аберацій, а перед етапом кінцевої кількісної оцінки в системі in vivo мутагенну активність визначають в додаткових короткострокових тестах на Drosophila melanogaster шляхом обліку рецесивних, зчеплених зі статтю, летальних мутацій та домінантних летальних мутацій. Запропонований спосіб, який також складається з двох етапів, включає: І етап - попередня оцінка мутагенної активності у системі in vitro. Основними методами оцінки є: напівкількісний метод обліку генних мутацій на мікроорганізмах (тест Еймса) та облік хромосомних аберацій у культурі лімфоцитів людини; II етап - оцінки у системі in vivo, в яку входять відбіркові дослідження на Drosophila melanogaster (облік генних мутацій - рецесивних, зчеплених зі статтю, летальних мутацій і облік домінантних летальних мутацій у статевих клітинах) та кінцева кількісна оцінка мутагенної активності. Основні методи: метафазний аналіз аберацій хромосом у клітинах кісткового мозку ссавців та облік домінантних летальних мутацій у статевих клітинах самців лабораторних тварин. У новому способі набір методів, які використовуються, дозволяє поетапно вирішувати дві основні задачі: виявлення потенційних мутагенів (тест Еймса і короткострокові тести на Drosophila melanogaster) та визначення їх генетичної активності - небезпечності (кількісна оцінка в дослідах на ссавцях). Використання на 1-му етапі замість мікроядерного тесту (який виконується на клітинах кісткового мозку тварин) методу обліку хромосомних аберацій у культурі лімфоцитів людини дає змогу вивчити вплив мутагенів безпосередньо на геном людини. Значне підвищення інформативності запропонованого способу відбувається за рахунок застосування тесту з обліку рецесивних, зчеплених зі статтю летальних мутацій у дослідженнях 1 UA 95582 U 5 10 15 20 25 на Drosophila melanogaster, який дозволяє провести виявлення здатності індукції генних мутацій у таких речовин, як азосполуки, азобарвники та інші чинники, які не проявляють активності в тесті Еймса, що призводить до одержання "помилково негативних" результатів. Окрім того, застосування методу обліку домінантних летальних мутацій на Drosophila melanogaster значно підвищує економічність та експресність нового способу. Відбувається значне підвищення пропускної спроможності способу тестування. Виникає можливість проведення великої кількості (масових) дешевих дослідів на Drosophila melanogaster для виявлення мутагенів для подальшої кількісної оцінки їх активності на ссавцях. Таким чином, сукупність суттєвих ознак способу, що заявляється, дозволяє підвищити економічність, достовірність, експресність та інформативність тестування. Запропонований спосіб дозволяє дослідити мутагенну активність лікарських препаратів, визначити дозові залежності, виявити реальну небезпеку для здоров'я людини використання певних класів хімічних речовин, дослідити безпечні концентрації та провести пошук речовин з антимутагенними властивостями. Корисна модель ілюструється прикладами. Приклад 1 Метою дослідження було визначення за допомогою запропонованого способу мутагенної активності нового лікарського препарату - амніоцену (Ан) і допоміжної фармацевтичної речовини - червоного желатину 5 СХ (ЧЖ). Дослідження проводили на двох етапах. На I-му етапі у системі in vitro оцінювали здатність речовин індукувати генні мутації в тесті Еймса (ГМ) і хромосомні аберації (ХА) в культурі лімфоцитів людини. На ІІ-му етапі у системі in vivo виконували дослідження на Drosophila melanogaster визначали здатність препаратів викликати рецесивні, зчеплені зі статтю, летальні мутації (РЗСЛМ) й домінантні летальні мутації (ДЛМ) у статевих клітинах дрозофіли. Крім того виконували дослідження на ссавцях - оцінювали здатність препаратів індукувати хромосомні аберації (ХА) у соматичних клітинах кісткового мозку і домінантні летальні мутації (ДЛМ) у статевих клітинах мишей. Одержані результати представлені в таблиці. Таблиця Результати оцінки за допомогою заявленого способу тестування рівня мутагенної активності нових лікарських препаратів і допоміжних фармацевтичних речовин Методи, речовини Рівень мутаген. безпеки препар. Максим. виражений рівень Максим. виражен. індекс мутаген. ефекту (в балах) мутаген, активності IN VITRO 1 Тест-Еймса Salmonella/мікросоми: 0 0 0, III 0, III 2 Облік ХА у культурі лімфоцитів людини: І* І, III 0 0, III 3 Облік РЗСЛМ у дрозофіли: 2* 0 2, III 0, III В 4 Олік ДЛМ у статевих клітинах дрозофіли: 2* 2, III В червоний желатин 5 СХ; амніоцен 5 Облік ХА у клітинах кісткового мозку мишей 0 0 0, III 0, III червоний желатин 5 СХ; амніоцен 6 Облік ДЛМ у статевих клітинах мишей; 2* 0 2, III 0, III червоний желатин 5 СХ; амніоцен; червоний желатин 5 СХ; амніоцен; IN VIVO червоний желатин 5 СХ; амніоцен; червоний желатин 5 СХ; амніоцен 30 2 В В UA 95582 U Примітки: 1. Бал 0 - відсутність мутагенного ефекту; 2. Бал 1 - слабкий мутагенний ефект; 3. Бал 2 - середній мутагенний ефект; 4. Ранг III - перевищення добової дози в 15 та більше разів; 5. В - третій рівень мутагенної безпеки - "слабкий мутаген"; 6. * - P < 0,01 (по відношенню до контролю). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Результати дослідів свідчать, що лікарський препарат амніоцен (одержаний з плаценти людини) не виявляє мутагенної активності в системах in vitro та in vivo. Цей препарат не тільки не виявляє мутагенної активності у тесті Еймса - Salmonella/мікросоми ссавців, але і не індукує підвищення генних мутацій, а саме, рецесивних, зчеплених зі статтю летальних мутацій у дрозофіли. Амніоцен не індукував хромосомні аберації у клітинах кісткового мозку і домінантні летальні мутації у статевих клітинах мишей. Таким чином, було встановлено, що амніоцен не є мутагеном. У той же час допоміжна фармацевтична речовина - червоний желатин 5 СХ проявляє мутагенну активність. Завдяки використанню нового способу оцінки встановлено, що мутагенний ефект червоного желатину 5 СХ (ЧЖ) залежав як від особливостей його біотрансформації, так і від можливостей трансформуючих систем різних тест-об'єктів. Так, ЧЖ в концентраціях 0,1-1000,0 мкг/чашку не виявляв мутагенної активності у тесті Еймса8а1топе11а/мікросоми ссавців, тобто призводив до одержання "помилково негативних" результатів. Проте, у дослідах на Drosophila melanogaster ЧЖ індукував генні мутації рецесивні, зчеплені зі статтю летальні мутації і домінантні летальні мутації при обробці дорослих самців (500 мг/мл), а при дії на личинки (у концентраціях 0,3; 0,4; 0,6 %) дозозалежним чином підвищував частоту ембріональної і постембріональної летальності в F 1 та достовірно знижував показники плодючості дрозофіли за кількістю лялечок і імаго. Цитогенетичні ефекти ЧЖ мають ряд особливостей в системах in vitro та in vivo. В культурі лімфоцитів людини ЧЖ (у концентраціях 7; 70; 700 мкг/мл) дозозалежним чином підвищував частоту ХА. Виявлена висока позитивна кореляційна залежність мутагенного ефекту від концентрації - "доза-ефект". В системі in vivo на ссавцях показана висока тканинна специфічність ушкоджуючої дії ЧЖ, а саме, встановлена більша чутливість статевих клітин до впливу барвника, ніж соматичних. При пероральному введенні самцям в дозі 1,0 г/кг протягом 10 днів ЧЖ достовірно підвищував частоту ДЛМ у статевих клітинах мишей, але не індукував змін частоти ХА у клітинах кісткового мозку. Порівняльний аналіз показав, що максимально виражений рівень мутагенного ефекту ЧЖ у різних тестах був різним і коливався від 0 до 2 балів. У тесті Еймса відзначена відсутність мутагенного ефекту (бал 0). При аналізі цитогенетичної активності ЧЖ установлено слабкий ефект у культурі лімфоцитів людини (бал 1). Найвищий рівень мутагенного ефекту (середній ефект) відзначено у тестах з обліку: РЗСЛМ і ДЛМ у дрозофіли та ДЛМ у статевих клітинах мишей (бал 2). Дози, за яких відбувалися достовірні зміни більш ніж в 15 разів перевищують рекомендовані добові дози допоміжної речовини для фармацевтичної промисловості. За рівнем генетичної небезпеки для людини ЧЖ належить до категорії "слабкий мутаген". Встановлено, що найбільш інформативним тестом для оцінки мутагенності сполук, які містять канцерогенні угруповання азоструктури, є облік рецесивних, зчеплених зі статтю летальних мутацій і домінантних летальних мутацій у дрозофіли та облік домінантних летальних мутацій у статевих клітинах мишей у хронічному експерименті. Таким чином, заявлено новий спосіб визначення мутагенної активності лікарських препаратів та допоміжних фармацевтичних речовин, в якому за рахунок використання набору методів, відбувається поетапне вирішення двох основних задач: виявлення потенційних мутагенів (тест Еймса і короткострокові тести на Drosophila melanogaster) та визначення їх генетичної активності - небезпечності (кількісна оцінка в дослідах на ссавцях). Спосіб відрізняється підвищеною інформативністю; економічністю, достовірністю та експресністю тестування. Джерела інформації: 1. Оцінка мутагенних властивостей нових лікарських засобів / Бариляк І.Р., Неумержицька Л.В., Дуган О.М., Кривошеін Ю.С., Дорошенко Г.Г., Логодир Т.А. // Доклінічне вивчення нешкідливості лікарських засобів (методичні рекомендації). - К.: ФК МОЗ України, 2000. - С. 166182. 3 UA 95582 U 2. Тихомирова М.М. Генетический анализ. - Л.: Изд-во ЛГУ, 1990. - С. 270-271. 3. Магерамова Л.М. Изучение закономерностей мутагенного процесса в линиях дрозофилы, дефектных по системе репарации. Автореф. … кан. биол. наук-М., 1986. - 16 с. 5 10 15 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб оцінки мутагенної активності лікарських препаратів і допоміжних фармацевтичних речовин, що включає етап попередньої оцінки in vitro з використанням як тест-об'єктів бактеріальних клітин з подальшим обліком їх генних мутацій і соматичних клітин ссавців та етап кінцевої кількісної оцінки з використанням як тест-об'єктів клітин кісткового мозку ссавців з подальшим обліком у них хромосомних аберацій у статевих клітинах ссавців з обліком домінантних летальних мутацій, який відрізняється тим, що етап попередньої оцінки включає як тест-об'єкт культуру лімфоцитів людини з подальшим обліком у ній хромосомних аберацій, а перед етапом кінцевої кількісної оцінки в системі in vivo мутагенну активність визначають в додаткових короткострокових тестах на Drosophila melanogaster шляхом обліку рецесивних, зчеплених зі статтю, летальних мутацій та домінантних летальних мутацій. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4