Спосіб оцінки технологій виробництва лікарських препаратів методами біотестування

Винахід відноситься до області медицини, фармакології, зокрема, до способу оцінки технологій виробництва лікарських препаратів і може бути використаний для визначення найбільш безпечних з позицій живого організму і його клітин технологій виробництва лікарських препаратів, а також одержання додаткової інформації для ліків, що випускаються різними фірмами-виробниками. На сучасному етапі розвитку фармацевтичної галузі все більшої гостроти набуває проблема аналізу лікарських засобів на стадії контролю виробництва продукту. Обсяг виробництва лікарських препаратів зростає, збільшується також кількість нових токсичних речовин. Дія лікарських субстанцій на живі організми відома, а вплив компонентів лікарських форм важко передбачити. Стандартні методи аналізу хімічних речовин, що базуються на конкретному визначенні компонентів суміші, вже не можуть здійснити поставлену задачу - їх результати досить важко інтерпретува ти. Навіть при визначенні хімічного складу лікарського препарату, вплив усі х компонентів засобу на організм потрібно оцінити з точки зору їх токсичності, генотоксичності, тощо. Особлива роль повинна відводитись аналізу допоміжних речовин у складі лікарського засобу. Допоміжні речовини - не індиферентні наповнювачі, оскільки самостійно здатні вступати в складні взаємодії як із діючою речовиною (і наслідком може бути зміна її властивостей, утворення твердих розчинів, комплексів і т.п.), так і з навколишнім середовищем лікарського засобу (міжтканинною рідиною, вмістом шлунково-кишкового тракту і т.п.) У такий спосіб допоміжні речовини впливають на фізико-хімічні властивості лікарських засобів і, як наслідок, на фармакокінетику, а, відповідно, й на терапевтичну ефективність препарату. Необгрунтоване застосування допоміжних речовин може призвести до зниження, чи повної втрати лікувального ефекту щодо референтного препарату. Зміна властивостей препарату відбувається внаслідок його взаємодії з допоміжними речовинами ще на стадії змішування реагентів при приготуванні лікарської форми. Розглядаючи проблему безпечності лікарських засобів, необхідно підкреслити ту обставину, що часто нова технологія впроваджується швидко та широко, тому попередня оцінка її ефективності та безпечності робиться не належним чином. Для інтенсифікації процесу аналізу лікарських препаратів необхідно запроваджувати нові методи визначення токсичності або негативного впливу лікарського засобу на організмовому чи клітинному рівнях. В наш час країни - члени Європейської Економічної Співдружності (ЄЕС) при розробці ліків керуються єдиними правилами системи GLP (Good Laboratory Practice - Надійної Лабораторної Практики), які вперше були розроблені та запроваджені в США в 1979 р. Управлінням по контролю за якістю харчових продуктів та медикаментів (Food and Drug Administration - FDA). Для аналізу лікарських засобів за методами GLP потрібно дотримуватись стандартних умов прийому та утримання експериментальних тварин, оцінки їх якості, контролю за довкіллям та певного порядку проведення випробувань [Вступ до правил GLP. О.В. Стефанов, В.С. Даниленко, В.М. Коваленко, Ю.М. Максимов, Г.С. Григорьева, А.И. Соловйов та ін. - К.: МОЗ України, Державний фармакологічний центр, 2000. - 36с.] [1]. Стандартну методику випробувань на токсичність за протоколом Державної Фармакопеї України [Державне підприємство „Науково-експертний фармакопейний центр".-1-е вид. - Харків: РІРЕГ, 2001. - С. 109-110] [2] визначення токсичності готового лікарського засобу проводять таким чином: кількість випробуваного лікарського засобу, зазначену в окремій статті, розчинену в 0,5мл води для ін'єкцій Р або у стерильному розчині 9 г/л хлориду натрію, вводять внутрішньовенну кожній з п'яти здорових мишей масою від 17 г до 22г. Розчин вводять протягом інтервалу часу від 15с до 30с, якщо немає інших зазначень в окремій статті. Зразок витримує випробування, якщо жодна з мишей не гине в межах 24 годин або протягом часу, зазначеного в окремій статті. Якщо більш ніж одна тварина гине, зразок не проходить випробування. У випадку загибелі однієї тварини випробування повторюють. Зразок витримує випробування, якщо жодна з тварин у другій групі не гине в межах зазначеного інтервалу часу. Спосіб потребує значної кількості тварин, а також забезпечення необхідних умов для їх утримання, має низьку чутли вість і фіксує тільки гостру токсичність. Прототипом являється спосіб оцінки токсичності медпрепаратів [Muller L, Kikuchi Y, Probst G, Schechtman L, Shimada H, Sofuni T, Tweats D. 1999. ICH-harmonised guidances on genotoxicity testing ofpharmaceuticals: evolution, reasoning and impact. Mutation Research, v. 436, p. 195-225] [3], в якому використовують затверджену міжнародною конференцією по координації технічних вимог для реєстрації технічних препаратів, що використовуються людиною (ІСН), стандартизовану батарею для тестування генотоксичності лікарських препаратів. Дана батарея включає 4 біотести: тест на генні мутації у бактерій; in vitro тест щодо цитогенетичної оцінки хромосомних пошкоджень у клітках ссавців, in vitro tk тест мишачої лімфоми та in vivo тест на хромосомні аберації з використанням кровотворних клітин гризунів. До недоліків відомого способу відноситься те, що для тестування використовують тільки клітини ссавців та бактерій і проведення аналізу обмежено визначенням генотоксичності лікарських препаратів, що в кінцевому результаті не дозволяє виявляти найбільш безпечну технологію виготовлення певного лікарського препарату. Винахід, що заявляється, спрямовано на розробку комплексного, швидкого і дешевого способу оцінки різних технологій виробництва лікарських речовин, а також одержання додаткової інформації про вже існуючі лікарські препарати за допомогою біотестування, при якому проводиться комплексне дослідження різних типів токсичності одного і того ж лікарського препарату, виробленого із використанням різних те хнологій, шля хом застосування спеціальних індексів, що характеризують ступінь токсичності, гено- і цитотоксичності кінцевого продукту, а отже всього технологічного процесу. Для рішення поставленої задачі пропонується спосіб оцінки різних технологій виробництва лікарських речовин, заснований на тім, що для оцінки передбачається застосування всього спектру живих організмів: рослин, безхребетних і хребетних тварин; для тестів використовуються показники як на організмовому, так і на клітинному рівні і на основі отриманих даних оцінюється кожна технологія за розробленим набором спеціальних індексів, що характеризують ступінь токсичності, гено- і цитотоксичності кінцевого продукту, отриманого в результаті застосування даної технології, тобто лікарського препарату, а отже і біологічній безпеці тієї або іншої технології. Спосіб оцінки біологічної безпеки різних технологій виробництва лікарських речовин, що заявляється, заснований на комплексному дослідженні показників тест організму і його клітин, що включає вимір гальмування росту і зниження ваги корінців рослини, оцінку сублетальних і летальних ефектів для гідр і церіодафній (безхребетних тварин), реєстрацію смертності у риб (хребетних тварин), аналіз ядерцевих характеристик рослинних і тваринних кліток, облік частоти рослинних і тваринних клітин, що мають мікроядра і подвійні ядра, і з урахуванням отриманих результатів дозволяє зробити всебічну, об'єктивну оцінку різних те хнологій виробництва лікарських препаратів. З рослин для тестів використовується цибуля звичайна Allium cera, представник однодольних рослин. Швидкий розвиток корінців у водному середовищі, їхня висока чутливість і двоїна оцінка за довжиною і вагою корінців дозволяють адекватно оцінити рівень токсичності водного середовища; наявність багатьох корінців у однієї рослини дозволяє провести весь комплекс клітинних досліджень на обмеженій кількості організмів і збільшує вірогідність результатів; наявність еукаріотичного ядра дозволяє провести весь комплекс клітинних і субклітинних досліджень на цито- і генотоксичність. Швидка реакція ядерець на токсичний вплив дозволяє одержати результат у перші години тестування; поєднання аналізу ядерцевих характеристик, частоти мікроядер і подвійних ядер у клітинах найбільш об'єктивно характеризує різні типи токсичності на клітинному рівні. З хребетних тварин обраний представник коропових риб Carassius auratus gibelio, тому що для нього визначений спектр концентрацій багатьох токсичних речовин - LC50. Різноманітні in vitro та in vi vo досліди з рибами використовують як модельні для токсикологічних, біохімічних експериментів та дослідів з біології розвитку, а також для вивчення канцерогенезу. Різні види кісткових риб використовують для вивчення розвитку ранніх життєви х стадій риб та тератогенного ефекту факторів оточуючого середовища. Перевага використання риб у якості модельних організмів полягає у легкості, з якою кісткові можуть утримуватися у лабораторних умовах і піддаватися впливові токсичних речовин. Оскільки риби зазвичай реагують на токсиканти подібно до вищих хребетних (ссавців), вони використовуються для виявлення речовин, що потенційно можуть викликати тератогенний та канцерогенний ефекти у людини. Для дослідження токсичності фармакологічних препаратів необхідно використовувати, по-перше, високочутливі тести і, по-друге, комплексний підхід, об'єднуючи біотести з різною специфічністю, тобто диференційованою реакцією на речовини різної природи. Крім комплексного підходу на організмовому рівні при визначенні токсичності, необхідно враховувати ефекти клітинного та субклітинного рівнів (наприклад, цитотоксичність та генотоксичність). Результати цих двох підходів на організмовому та клітинному рівнях дають повну й об'єктивну оцінку досліджуваного зразку. Для визначення гострої і хронічної токсичності препаратів використовують представників безхребетних (церіодафнія та гідра) і хребетних тварин (риба), а також рослинні тест-організми (однодольні рослини - цибуля) із високочутливою реакцією на зовнішнє забруднення. Подальший аналіз грунтується на дослідженні змін ядерцевих і ядерних характеристик в клітинах тест-організмів, що відчувають вплив зовнішніх факторів. Таким чином, для аналізу .токсичності фармакологічних препаратів створено комплексний підхід як на організмовому рівні із застосуванням декількох високочутливих рослинних і тваринних тест-організмів, так і на (суб)клітинному з вивченням найбільш важливих цитологічних та генетичних показників, з метою забезпечення всебічної та об'єктивної оцінки токсичності, цито- та генотоксичності препаратів. Спосіб, що заявляється, передбачає порівняльний аналіз декількох (ця умова обов'язкова) технологій виробництва одного і того ж лікарського препарату. Оцінка окремо узятого препарату не дасть необхідного результату. Кожна із порівнюваних технологій оцінюється за допомогою спеціальних індексів за ступенем токсичності, гено- і цитотоксичності зробленого продукту, тобто лікарської речовини. Іншими словами, спосіб, що заявляється, не аналізує кожну ланку технологічного процесу (одержання сировини, її очищення, виробництво діючої, активної лікарської речовини, введення в її склад різних наповнювачів і інших речовин, використаних при виробництві препарату, їхньої концентрації, тощо), а оцінює технологію в цілому - за зробленим кінцевим продуктом. В таблиці 1 приведені показники якості кінцевого продукту (лікарського препарату) за біологічними критеріями. Для визначення загальної токсичності застосована батарея біотестів, що дозволяє одержати об'єктивну оцінку впливу досліджуваної речовини на тваринні і рослинні організми. Для її кількісної інтерпретації введено індекс загальної токсичності (IОТ) [Архипчук В.В., Малиновская М.В. Применение комплексного подхода в биотестировании природных вод // Химия и технология воды, 2000, т.22, N 4, С. 428-443] [4], що являє собою суму е фектів, розрахованих для всіх біотестів, що включені у батарею. Щоб виключити надмірний вплив якогонебудь з біотестів на загальний результат, максимальне значення однієї тест-функції обмежується 100 умовними одиницями. Число тест-організмів, включених в експеримент, автоматично визначає найбільше значення IОТ. Наприклад, у дослідженні з 2 рослинними і 2 тваринами біотестами даний індекс не може перевищувати 400 одиниць. В таблиці 2 показано як оцінюється технологія виробництва лікарських препаратів, при обов'язковій умові, що досліджується однакова концентрація лікарського препарату для всіх порівнювальних технологій . Пояснення до таблиці 2: Оскільки кількість біотестів і тест-функцій, використовуваних для оцінки лікарського препарату, може варіювати в різних дослідженнях (набір, що рекомендується нами, включає 4 тест-організми, а максимальне їхнє число залежить від можливостей дослідників і поставленої перед ними задачі), то IОТ визначається не за абсолютними величинами, а за ступенем токсичності від максимально можливого показника. Наприклад, при використанні 4 біотестів (довжина і вага корінців рослин, сублетальні і летальні ефекти гідри, смертність дафній і риб) максимальне значення IОТ в абсолютних величинах дорівнює 400, а у відносних - 100%. Якщо токсичність для всіх біотестів дорівнювала EC/LC50, тобто токсичність складала половину від максимально можливої, то IОТ=200 одиниць або 50%. Якщо кількість використовуваних біотестів зростає, наприклад, до 5 або 6, то при максимальній токсичності IОТ буде дорівнювати 500 або 600 (в абсолютних одиницях) або 100% для обох випадків (у відносних одиницях). Отже, для проведення порівняльного аналізу різних технологій за токсикологічними показниками ми вибираємо IОТ, виражений у відносних одиницях. У цьому випадку індекс може бути порівнюваний в різних дослідженнях. Кожна технологія виробництва лікарського препарату оцінюється на трьох рівнях: організмовому, клітиннофункціональному і клітинно-структурному. Оскільки ці рівні характеризують різні механізми впливу лікарської речовини на організм і його клітини, то їхнє просте складання не буде коректним. Тому кожна технологія одержує свою трьохрівневу оцінку: за індексами IОТ, IЦТ і IГТ. Для виявлення найбільше біологічно безпечної технології («еталонної») використовується наступна схема оцінки. Технологія, що має найменші значення за аналізованим індексом, одержує найбільш низький, 1-й ранг; наступна технологія з більш високими значеннями індексу - 2-й ранг і т.д. Ранги привласнюються технологіям за всіма трьома індексами: IОТ, IЦТ і IГТ. Оскільки значення того або іншого типу токсичності нерівноцінні для життєдіяльності організму, наприклад, смертність значно більш негативний наслідок, ніж зміни у функціональній активності кліток, тому кожному з рангів привласнюється свій коефіцієнт: для IОТ цей коефіцієнт дорівнює 3, для IГТ - 2 і для IЦТ - 1- Тобто токсичні ефекти (сублетальні і летальні для організму) оцінюють як найбільш істотні, далі знаходяться генотоксичні ефекти (порушення структурної організації генетичного апарата клітки) і до найменш значимих відносять цитотоксичні ефекти (порушення або зміни в життєдіяльності кліток). У таблиці 3 приведений приклад розрахунку рангів. Технологія, що має найменший сумарний ранг за всіма трьома рівнями, визнається найбільше біологічно безпечною ("еталонною"). Наприклад, за даними Таблиці 3 такою технологією є номер 3. У випадку рівності рангів у двох або більш технологій можна провести підсумовування значень окремих індексів. Приклад реалізації способу, що заявляється Об'єктом наших досліджень була аскорбінова кислота (вітамін С), як водорозчинний вітамін вона представляє найбільш зручну форму для аналізу на гідробіонтах. Аскорбінова кислота для введення в організм людини виготовляється у вигляді таблеток і розчину для ін'єкцій. Для аналізу вибрали препарати аскорбінової кислоти вітчизняного і закордонного виробництва, а саме: - AT "Київський вітамінний завод", м. Київ; (тест № 1); - ВАТ "Концерн STIROL", м. Горлівка; (тест № 2); - ДАК "Укрмедпром" ДП "Біостимулятор", м. Одеса; (тест № 3); - Лабораторія UPSA, Франція, (тест № 4). Використовували таблетки по 500мг вітаміну С (аскорбінова кислота) виробництва AT "Київський вітамінний завод", м. Київ; таблетки по 1000мг вітаміну С виробництва Лабораторії UPSA, Франція; таблетки по 25мг вітаміну С виробництва концерну «Стірол», м. Горлівка; ампули по 2мл 5%-го розчину вітаміну для ін'єкцій, виробництва "Біостимулятор", м. Одеса. Всього досліджували 4 водні розчини вітаміну С. В якості контролю і рідини для розведення в експериментах використана вода з артезіанської свердловини (ст. м. "Нивки", м. Київ). Розчини вітамінів готували на контрольній воді в концентрації 60мг/л, саме така кількість вітаміну С є середньо-добовою дозою для організму людини (рекомендації з фармакологічного довіднику). Таблетки аскорбінової кислоти попередньо розтирали в фарфоровій ступці, порошок зважували і відповідну кількість розчиняли в контрольній воді (з артезіанської свердловини), після чого розчини фільтрували. У відповідності зі стандартною методикою біотестування водних проб досліджувані розчини тестували всіма нижче описаними методами з використанням рослин (цибулі), безхребетних (гідра і церіодафнія) та хребетних (риба - карась) тварин. Біотест з цибулею Як тест-організм використовується звичайна цибуля Allium cera. Сутність цього тесту заключається в гальмуванні росту корінців у випадку впливу токсичних речовин. Під час аналізу 10 маленьких очищених цибулин пророщують в пробірках, наповнених досліджуваним розчином. Експерименти виконували при кімнатній температурі, в захищеному від прямого сонячного світла місці. Період росту в 72 години прийнятий в якості стандартного. Ступінь токсичності визначали вимірюванням довжини корінців за допомогою лінійки (для кожної проби використовують по 10 цибулин). Для кожної серії визначають та порівнюють середні величини довжини і ваги корінців. Біотест з гідрою Тест-організм - представник безхребетних гідра Hydra attenuata. Суть методу: проводять оперативний (24 і 48 годинний) аналіз сублетальних та летальних ефектів у гідробіонтів. Оцінюють морфологічні зміни в тілі прісноводної гідри, а також її смертність внаслідок впливу токсичних речовин. Біотест з церіодафнією Метод визначення гострої та хронічної токсичності хімічних речовин, води та стічних вод із використанням дафній встановлює ІСО 10706. Тест-організми - церіодафнія Ceriodaphnia affinis (жіночі особини) - вирощують в акваріумах. Дафнії віком не менше 24 години (бо їх чутливість до отруйних речовин залежить саме від віку) для експерименту відбираються фільтрацією через систему сит. Після висадки близько 20 дафній в кожен досліджуваний розчин (рН розчину = 69, температура 20°С) через 24 і 48 год. реєструють кількість особин та їх нащадків, що вижили в експерименті, отримані дані порівнюють з показниками для контрольних розчинів. Біотест на рибах Можливе використання як відомих видів акваріумних риб, так і риб - об'єктів аквакультури. Частина 1 ІСО 7346 встановлює статистичний метод визначення гострої летальної токсичності речовин, розчинних у воді в певних умовах, для видів прісноводних риб. В наших дослідженнях застосовували молодих особин риб - гуппі Poecillia reticulatus. Після приготування дослідних і контрольного розчинів і доведення їх до температури 23°С, в кожен варіант садили по 10 риб. Тварин культивували протягом 96 годин. Токсичність водного зразка' визначали за кількістю особин, що вижили. Таким чином визначають середні летальні концентрації (LC50). Метод дослідження ядерцевої активності клітин рослин та тварин (ядерцевий біомаркер) для визначення цитотоксичності Протягом дослідження під світловим мікроскопом (із загальним збільшенням 1500х) визначають наступні показники: кількість ядерець в клітині, розмір поодинокого ядерця, а також відсоток гетероморфних парних ядерець (ГПЯ). Дані параметри є найбільш чуттєвими та інформативними, що доведено нашими попередніми дослідженнями. Для кожної проби підраховують кількість ядерець в 1500-1800 клітинах та визначають їх розмір у 200 клітинах при максимальному збільшенні світлового мікроскопа. На заключному етапі проводиться порівняння результатів в контрольних та дослідних варіантах, їх статистична обробка. Мікроядерний аналіз на рослинних і тваринних клітинах для визначення генотоксичності Цитологічні препарати аналізують під світловим мікроскопом (із загальним збільшенням 1500х). При мікроядерному аналізі з кожного препарату підраховували близько 3 тисяч клітин, визначали мітотичний індекс, підраховували кількість клітин з мікроядрами, клітин з подвійними ядрами та відмічали кількість клітин з іншими патологіями мітозу, якщо такі зустрічались. На заключному етапі досліджень проводили аналіз та статистичну обробку результатів за допомогою стандартного пакету програм Excel (для Windows 98) та STATISTICA '99 Edition Version 5.5 (StatSoft. Inc., 19841999). Результати проведених тестів відображені в таблиці 4. Отже, відповідно до отриманих результатів, найбільше біологічно безпечною («еталонною») технологією виробництва лікарського препарату «Вітамін С» визнана технологія Одеського підприємства «Біостимулятор» (тест № 3). Ця технологія представляє собою виробництво ампульної (як розчин) форми препарату. Серед таблетованих форм випуску вітаміну С найбільш безпечною була технологія лабораторії UPSA (Франція) (тест № 4). Таблиця 1 Показники якості кінцевого продукту (лікарського препарату) за біологічними критеріями Токсикологічні показники (індекс загальної Цитотоксичні показники (індекс токсичності - IОТ) цитотоксичності -IЦТ) - Токсичність для рослинних тест-організмів - Цитотоксичність для - Токсичність для безхребетних тестрослинних клітин організмів - Цитотоксичність для - Токсичність для хребетних тест-організмів тваринних клітин Показники токсичності: Показники цитотоксичності: зміни довжини і ваги корінців рослин, ядерцевий биомаркер і сублетальні і летальні ефекти у тварин мітотичний індекс Генотоксичні показники (індекс генотоксичності -IГТ) - Генотоксичність для рослинних клітин - Генотоксичність для тваринних клітин Показники генотоксичності: частота клітин з мікроядрами і подвійними ядрами Таблиця 2 Оцінка технологій виробництва лікарських препаратів за допомогою методів біотестування IОТ IЦТ Ядерцевий біомаркер (число і розмір Токсичний ефект на рослинах, ядерець, ГПЯ) на рослинних клітинах + % + Токсичний ефект на Ядерцевий біомаркер (число і розмір безхребетних, % + Токсичний ядерець, ГПЯ) на тваринних клітинах + ефект на хребетних,% Мітотичний індекс IГТ Мікроядерний тест і частота ядерних порушень на рослинних клітинах + Мікроядерний тест і частота ядерних порушень на тваринних клітинах Таблиця 3 Розраху нок рангів для трьох технологій в иробництв а одного й того ж лікарського преп арату Технологія I ОТ №1 №2 №3 65%38% 15% Ранг Кое фіцієнт 3 2 1 3 3 3 Оцінка Оцінка I ГТ Ранг Кое фіцієнт І ЦТ токсичності геното ксичності 9 5% 1 2 2 74% 6 23% 3 2 6 27% 3 16% 2 2 4 45% Ранг Кое фіцієнт 3 1 2 1 1 1 Оцінка цитотоксичності 3 1 2 Су марна оцінка 9+2+3 =14 6+6+1 =13 3+4+2 =9 Таблиця 4 Оцінка 4 технологій в иробни цтв а лікарського препар ату «Вітамін С» Технологія I ОТ №1 №2 №3 №4 55% 37% 13% 44% Ранг Кое фіцієнт 4 2 1 3 3 3 3 3 Оцінка токсичності 12 6 3 9 I ГТ 5% 10% 22% 8% Ранг Кое фіцієнт 1 3 4 2 2 2 2 2 Оцінка геното ксичності 2 6 8 4 I ЦТ 151%* 187% 149% 130% Ранг Кое фіцієнт 3 4 2 1 1 1 1 1 Оцінка Су марна цитотоксичності оцінка 3 12+2+3=1 7 4 6+6+4 =16 2 3+8+2 =13 1 9+4+1 =14 * - сума цитотоксичних ефектів, отриманих на клітинах трьох тест-організмів (рослин, безхребетних і хребетних тварин)