Спосіб визначення мутагенної активності питної води і культуральне середовище для його реалізації

1. Спосіб визначення мутагенної активності питної води, що полягає у визначенні мутагенів і промутагенів, та включає використання тест 2 (19) 1 3 Винахід відноситься до області екології навколишнього середовища, зокрема, до методів біотестування водних середовищ і може бути використаний для визначення якості водного середовища, а саме мутагенної активності водних зразків на рівні клітини. Спосіб визначення мутагенної активності води оснований на оцінці впливу питної води на культуру клітин, зокрема - лімфоцитів периферичної крові. Відома оцінка мутагенної активності хімічних речовин, яка проводиться із використанням батареї короткострокових тестів [Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ: ВОЗ, Женева. - 1989. - 212 с.] [1]. Відомий тест з використанням мікроорганізмів, зокрема, тест Еймса, суть якого полягає в використанні двох основних компонентів: реєструючого (набір індикаторних штамів) та активуючого (постмітохондріальний супернатант гомогенату печінки щурів -фракції S-9 та ко-фактори) [1, ст. 26-37]. Відомі також цигогенетичні методи для оцінки мутагенності хімічних речовин [1, ст. 62-86], наприклад, метод обліку хромосомних аберацій в соматичних клітинах людини та тварин in vitro (культура клітин) та in vivo (кістковий мозок мишей) - про мутагенний ефект роблять висновки за частотою аберацій хромосом, що перевищують спонтанний рівень в нормі. Також для визначення мутагенної активності використовують вивчення сестринських хроматидних обмінів, принцип яких заключається у дії на клітини таким чином, щоб дві сестринські хроматиди відрізнялись одна від одної. Це достягається введенням в культуру клітин, яка зростає 5-бромдезоксиуридинк (БДУ) з подальшим забарвленням - це один із додаткових методів оцінки генетичної активності хімічних сполук. Як випливає із суті відомих способів визначення мутагенності, останні використовуються, в основному, для дослідження мутагенної активності хімічних речовин, а не для питної води. Найбільш близьким аналогом до винаходу за технічною суттю і результатом, що досягається, є спосіб визначення мутагенної активності води в тесті Еймса [Дуган A.M. Суммарная мутагенная активность вод из артезианских скважин и смешанного водопровода г. Киева // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології: Зб. Наук. Праць. - Київ, Луганськ. - 1998. - Вип. 9. с. 18-21.] [2]. Тест Еймса використовується для скринінгу, коли потрібно дуже швидко проаналізувати велику кількість проб. Суть методу полягає в реєстрації здатності досліджуваної речовини та її метаболітів індукувати генні мутації від ауксотрофності до прототрофності по гістидину у індикаторних штамів S. typhimurium (тест-об'єкт), які несуть his--мутації і не здатні синтезувати гістидин. З метою аналізу можливих промутагенів досліджувану воду піддають процесу біотрансформації за допомогою ферментів мікросомального окислення, що містяться в мітохондріальному супернатанті гомогенату печінки щурів - фракції S-9. Для цього бактерії S. typhimurium інкубують разом з досліджуваною водою, а також мікросомальною активуючою 93964 4 сумішшю - S-9 mix (фракція S-9 + Ко-фактори: НАДФ і глюкозо-6-фосфат). Мутагенний ефект визначається за кількістю ревертантних колоній. Основним недоліком відомого способу визначення мутагенної активності води [2] є те, що бактерії можуть дати відповідь на лише одне питання: чи може тестуєма речовина - вода - викликати мутації у бактерій, як тест-об'єкту, в присутності чи/або при відсутності екзогенної метаболічної системи, отриманої від ссавців (фракції S9); тобто, є обмеженість можливостей визначення мутагенної активності, яка має відношення тільки до мікроорганізмів. Екстраполяція отриманих даних на людину неможлива в зв'язку з тим, що людський організм є складною системою. Таким чином, отримані дані характеризуються малою інформативністю відносно мутагенної активності питної води, яка діє на людський організм. В основу винаходу поставлено завдання розробити спосіб визначення мутагенної активності питної води та склад культурального середовища з використанням нового тест-об'єкту та нового порядку введення інгредієнтів культурального середовища, що забезпечило б розширення інформативних даних щодо мутагенної активності води з високою точністю. Для вирішення поставленої задачі запропоновано спосіб визначення мутагенної активності питної води, що полягає у визначенні мутагенів і промутагенів з використанням тест-об'єкту, в якому, згідно з винаходом, як тест-об'єкт використовують культуру лімфоцитів периферичної крові людини, для визначення мутагенів в тест-об'єкт вводять досліджувану пробу води і культивують протягом 24 годин, центрифугують, в отриманий осад вводять 0,56-% розчин хлориду калію, підігрітий до 37 °С, центрифугують, в осад вводять суміш крижаної оцтової кислоти та етилового спирту (КОіЕС) при об'ємному співвідношенні 1:3, відповідно, витримують при температурі 5-8 °С протягом 1 години, центрифугують, в осад повторно вводять суміш (КОіЕС), витримують при температурі 5-8 °С протягом 24 годин, центрифугують, в осад знову вводять суміш (КОіЕС), витримують при температурі 5-8 °С протягом 24 годин, центрифугують, отриманий осад по каплям переносять на два предметних скельця, охолоджених до (-15) + (-18) °С, випалюють суміш (КОіЕС), витримують 24 години при кімнатній температурі, забарвлюють 2,5 % розчином барвника Гімза і в отриманому препараті підраховують мітотичний індекс та визначають мутагенність води за цитогенетичними показниками, а для отримання промутагенів використовують тестоб'єкт з попередньо введеною сумішшю кофакторів та фракції гомогенату печінки щурів S-9, в отриманому препараті знов підраховують мітотичний індекс та визначають мутагенність води за цитогенетичними показниками. Задача вирішується і складом культурального середовища для отримання культури лімфоцитів периферичної крові людини як тест-об'єкту щодо визначення мутагенної активності питної води, що включає венозну кров, гепарин, натрієву сіль пеніциліну, мітоген і поживне середовище, в якому, згідно з винаходом, культуральне середовище 5 93964 6 додатково містить колхіцин, як мітоген - фітогемаКолхіцин 4,0 глютинін (ФГА-Р), як поживне середовище - RPMIФГА 25,0 1640, і компоненти беруть в наступній кількості, RPMI-1640 56,0 розрахованій на 100 мл культурального середоВміст кожної пробірки розподіляли по двом вища, мл: скляним флаконам (4 мл), які герметично перекриВенозна кров 12±0,5 вали гумовими корками та інкубували в термостаті Гепарин 1,25-1,75 при +37°С протягом 28 годин. Пеніциліну натрієва сіль 1,12-1,35 Визначення мутагенів. Колхіцин 2,0-4,0 Брали два флакони з культуральним середоФГА 23,7-26,2 вищем і вносили по 0,1 мл досліджуваної води. RPMI-1640 решта Культивували 24 години при температурі 37°С. Заявником вперше запропоновано спосіб виПісля інкубації вміст кожного флакона переносили значення мутагенної активності питної води, сутв центрифужну пробірку. Центрифугування провотєві ознаки якого, що надані у формулі винаходу дили упродовж 5 хвилин при 1000 об/хв. Надосад (п.1), дозволяють визначати у воді як мутагени, так видаляли, залишивши шар в 0,5 мл над поверхі промутагени. Висока результативність способу нею осаду. Гіпотонічну обробку проводили 0,56 % досягається використанням запропонованого вперозчином КС1 протягом 5 хвилин при +37°С. Прорше тест-об'єкту - культури лімфоцитів периферибірки знову центрифугували, надосад видаляли, як чної крові людини, а також складом культуральноописано вище. Фіксацію осаду проводили свіже го розчину для одержання тест-об'єкту. приготованим фіксатором об'ємом 4 мл, що місЗапропонований спосіб характеризується постить суміш крижаної оцтової кислоти і охолоджелідовністю дій та параметрами їх виконання, що ного до +4°С етанолу при об'ємному співвіднодозволяє визначати поряд з широко застосовувашенні 1:3, відповідно. Пробірку витримували в ними цитогенетичними показниками - частота мехолодильнику при температурі +4°С протягом 1 тафаз з абераціями, так і додаткові показники години. Процедуру фіксації, яка описана вище, кількість анеуплоїдних клітин, які характеризують повторювали ще двічі, при цьому час витримуванможливий канцерогенний ризик для людського ня пробірок в холодильнику для другої і третьої організму, та наявність чи відсутність мультиабефіксації становив 24 години. рантних клітин, що показують вплив на систему Після третьої фіксації пробірки центрифугуварепарації (відновлення) організму. ли, видаляли надосад, як описано вище. ОдержаПриклад виконання за винаходом. ний після фіксації осад по каплям переносили на Визначали мутагенну активність питної води два заморожені (при -15°С) предметні скельця. марки «Софія Київська», що полягає у визначенні Фіксатор випалювали в полум'ї спиртівки. Препамутагенів та промутагенів. рати забарвлювали 2,5 % розчином барвника ГімПопередньо готували культуральне середоза. вище для отримання культури лімфоцитів периЕксперименти супроводжували негативним феричної крові людини. Використовували культуру (чиста культура лімфоцитів периферичної крові) і лімфоцитів, отриману від практично здорового позитивним контролями. У позитивному контрольдонора - жінки 42 років, яка не приймала медичних ному варіанті в експерименті без метаболічної препаратів та не досліджувалась упродовж року активації в культуральне середовище на 28 годині рентгенологічно. Кров відбирали одноразовим інкубації вносили Мітоміцин-С в концентрації 10,0 шприцом з ліктьової вени, розливали по 1 мл в дві мкг/мл. Всі робочі розчини готували безпосередстерильні гепаринізовані (5 Од. в 0,1 мл фізіологіньо перед внесенням в культуральне середовище. чного розчина - 0,9 % NaCl) центрифужні пробірки. Мітотичний індекс (МІ - %), що є показником До пробірок з кров'ю в стерильних умовах посліцитотоксичності проби, підраховували на 1000 довно додавали 0,1 мл розчину колхіцину в концеклітин згідно з формулою: МІ=n/1000×100, де n нтрації 0,04 мкг/мл і 20 Од. натрієвої солі пеніцилікількість метафаз на 1000 мітозів. ну (в 0,1 мл фізіологічного розчину). Потім в Мітотичний індекс визначали і у пробі, і у негапробірки до об'єму 8 мл додавали готове поживне тивному контролі. У пробі питної води Софія Київсередовище - RPMI 1640 (Sigma). Як мітоген викоська у варіанті експерименту без метаболічної ристовували фітогемаглютінін-Р ФГА-Р (Sigma) в активації (визначення мутагенів) - мітотичний інкількості 20 мкг/мл культурального середовища. декс становив 32,0 %, в контролі - 34,0 %, тобто Одержали культуральне середовище з наступним цитотоксичність в пробі питної води Софія Київсьвмістом компонентів, розрахованим на 100 мл сека не спостерігалась, тому що показники мітотичредовища, мл: ного індексу в пробі і контролі достовірно не відріВенозна кров 12,5 знялись між собою. Гепарин 1,25 Далі під мікроскопом проводили визначення Пеніциліну натрієва сіль 1,25 цитогенетичних показників (табл. 1). 7 93964 8 Таблиця 1 Цитогенетичні показники в культурі лімфоцитів периферичної крові при вивчення дії прямих мутагенів (варіант експерименту без метаболічної активації) Проба Контроль негативний Контроль позитивний Софія Київська Мітотичний індекс (МІ), % Середня частота, М±m, % метафаз з анеуплоїдних клітин абераціями 34,0±1,4 1,50±0,86 11,50±2,21 Не визначається 15,00±3,401 22,00±4,101 Мультиаберантні клітини, кількість 32,0±1,3 1 5,50±1,61 4 15,50±2,56 Примітка: 1 - Р≤0,05 Далі під мікроскопом вивчались цитогенетичні показники: частота аберацій хромосом, кількість анеуплоїдних та мультиаберантних клітин. При дії на культуру лімфоцитів питної води Софія Київська спостерігалось достовірне підвищення частоти аберацій хромосом - 5,5 % проти 1,5 % в негативному контролі. При дії МітоміцинуС (позитивний контроль) було встановлено достовірне (Р