Спосіб діагностики ендогенної інтоксикації тварин олігоефірами в експерименті

Реферат: UA 96039 U UA 96039 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до експериментальної медицини, і може бути використана для діагностики проявів ендогенної інтоксикації (ЕІ). З розвитком хімії, хімічної промисловості та фармації збільшилася кількість чужорідних речовин, що застосовуються в різних галузях народного господарства. Багато з цих сполук виявилися токсичними і небезпечними для людини і навколишнього середовища. В певних умовах, особливо на виробництві, вони можуть бути причиною розвитку гострих та хронічних отруєнь. Деякі ксенобіотики, що виробляються хімічною промисловістю, здатні завдавати непоправної шкоди флорі і фауні. Підприємства хімії органічного синтезу стали одним з найпотужніших джерел забруднення навколишнього середовища за останні 20-30 років. Так, виробництва поліоксипропіленполіолів, які випускають великий обсяг і асортимент різних марок олігоетерів, впроваджують десятки нових синтезованих речовин, що використовуються для одержання пластмас, еластичних і блокових поліуретанів, термопластів, пінопластів, епоксидних смол, лаків, емалей та ін., які несуть потенційну і реальну загрозу здоров'ю населення та робітників, зайнятих на їх виробництві. Відомий спосіб діагностики ендогенної інтоксикації, який здійснюють шляхом визначення молекул середньої маси у сироватці крові тварин [Попов А.Н. Эндотоксемия при экспериментальной ахолии / А.Н. Попов, М.М. Минненбаев // БЭБ иМ. - 1997. - Т. 1. - С. 101102]. В основі даного способу діагностики ЕІ лежить визначення в сироватці крові тварин (модель експериментальної ахолії) комплексу показників: вмісту МСМ, креатиніну, білірубіну та кількості лейкоцитів периферійної крові. Визначення МСМ проводили наступним чином: сироватку крові обробляли 10 % розчином ТХО (співвідношення компонентів 1:0,5), суміш центрифугували при 3000 об/хв., до 0,5 нм надосадової рідини додавали 4,5 мл дистильованої води та проводили вимірювання оптичної щільності при довжини хвилі 254 нм. Недоліки метода: 1. Спосіб розроблений для виявлення ознак ЕІ в умовах моделі гострого стану (ахолія виведення жовчі) для якого характерна наявність запального процесу, про що свідчить суттєве підвищення кількості лейкоцитів периферійної крові; 2. Не досліджуються системи детоксикації, які суттєво впливають на розвиток ЕІ. Відомий спосіб встановлення тяжкості і результату отруєння ксенобютиками. [Красовский Г.Н., Жуков В.И., Бондаренко Л.А. Применение метода БХЛ в санитарно-токсикологических исследованиях // Гигисан. - 1989. - № 11. - С. 35-39]. У гострому досліді на білих щурах і мишах визначали інтенсивність надслабкого світіння внутрішніх органів і тканин при пероральному введенні простих поліефірів у летальних і сублетальних дозах. Досліджували БХЛ органів і сироватки крові тварин у динаміці через 1, 3, 6, 9, 12 годин (середній час загибелі тварин ЕТ5о=12 год.). Інтенсивність БХЛ індукували 3 % перекисом водню. По інтенсивності світіння і характеру кривої судили про тяжкість і результат отруєння ксенобіотиками. Цей спосіб вибраний нами як прототип, як найбільш близьке технічне рішення. Недоліками цього способу є те, що він не дозволяє визначати зміни трофотропної та ерготропної функції клітин. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу діагностики ендогенної інтоксикації тварин олігоефірами в експерименті, в якому за рахунок зміни досліджуваних показників, досягається визначення змін трофотропної та ерготропної функцій клітин за рахунок показників змін метаболізму клітин або гепатоцитів. Поставлена задача вирішується в способі діагностики ендогенної інтоксикації тварин олігоефірами в експерименті, що включає затравлення експериментальних тварин дозами летальними і сублетальними, вимір інтенсивності посиленої Н 2О2 біохемолюмінісценції (БХЛ) сироватки крові через визначені проміжки часу протягом інтервалу часу, побудову по експериментальних даних динамічних кривих БХЛ, порівняння значень інтенсивності БХЛ зі значеннями інтенсивності контрольної групи тварин, згідно з корисною моделлю, додатково проводять дослідження функціонального стану мітохондрій гепатоцитів в процесі розвитку структурно-метаболічного пошкодження тканини печінки, викликаного введенням токсичної дози олігоефірів 1/10 LD50, визначають швидкість споживання кисню в безакцепторному середовищі (V4), швидкість споживання кисню в присутності акцептора (V3), швидкість споживання кисню після вичерпання додається АДФ (V4), а також розраховують коефіцієнт фосфорилування відношення АДФ/О2, дихальний коефіцієнт (ДК) Ларді, а саме відношення швидкості поглинання кисню у стані V3 до швидкості поглинання кисню у стані V4 (до введення в комірку АДФ); АТФ P активність гідролазних реакцій як відношення V4/V4 , що характеризує швидкість регенерації АДФ після його фосфорилування, як субстрат окиснення використовують сукцинат, падіння величин дихального коефіцієнта і коефіцієнта фосфорилування дають підставу судити про 1 UA 96039 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 роз'єднання дихання та окисного фосфорилування на фоні пригнічення продукції АТФ, що свідчить про ендогенну інтоксикацію. Падіння величин дихального коефіцієнта і коефіцієнта фосфорилування дають підставу судити про роз'єднання дихання та окисного фосфорилування на фоні пригнічення продукції АТФ, що пов'язано з порушенням фізико-хімічних та структурно-метаболічних властивостей мітохондріальних мембран. Спосіб, що заявляється, здійснюють таким чином. В роботі була використана нова група олігоефірів на основі окису етилену і пропілену марок Л-501-2-100 (ацеталі монометилового ефіру поліоксіетиленгліколя), Л-1601-2-50"Б" (бутилаліловий ефір поліоксипропіленоксіетиленгліколю) і Л-1601-2-50"Р" (ацеталімонобутилового ефіру поліоксипропіленоксіетиленгліколю) з регламентованими фізикохімічними властивостями. Вибір даної групи олігоефірів був обґрунтований відсутністю в науковій літературі даних про механізми їх біологічної дії і необхідністю розробки прогностичної характеристики потенційної небезпеки цих сполук для людини і теплокровних тварин. На підставі оцінки параметрів гострої токсичності дані сполуки належать до помірно- і малотоксичних сполук, мають кумулятивних властивостей. Програма досліджень передбачає проведення підгострого токсикологічного експерименту на статевозрілих білих щурах популяції Вістар масою 180-200 гр. згідно з умовами експерименту, тваринам протягом 45 діб щоденно вранці, до годівлі, перорально за допомогою металевого зонда внутрішньошлунково вводили водні розчини олігоефірів у дозах 1/10; 1/100; 1/1000 LD50 (9 груп з n=10 тварин). Контрольна група тварин (n=10) отримувала еквівалентні обсяги питної води. У токсикологічному експерименті було використано 100 білих щурів при дотриманні вимог біоетики та принципів "Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей" (Страсбург, 1986). По закінченні підгострого досвіду на першому етапі оцінюють стан енергетичного та вуглеводнофосфорного обміну. Для цього були проведені дослідження функціонального стану мітохондрій гепатоцитів в процесі розвитку структурно-метаболічного пошкодження тканини печінки, викликаного введенням токсичної дози олігоефірів 1/10 LD50. Оцінку метаболічного стану мітохондрій проводили полярографічним методом [Мешкова Н.П., Северин С.Е. Практикум по биохимии. М.: МГУ, 1979. 428 с.], визначають швидкість споживання кисню в безакцепторному середовищі (V4), швидкість споживання кисню в присутності акцептора (V3), швидкість споживання кисню після вичерпання додається АДФ (V4), а також розраховують коефіцієнт фосфорилування - відношення АДФ/О2, схоже за своїм значенням з коефіцієнтом Р/О і характеризує спряженість процесів окислення та фосфорилування в дихальному ланцюзі; дихальний коефіцієнт (ДК) Ларді, тобто відношення швидкості поглинання кисню у стані V 3 до швидкості поглинання кисню у стані V4 (до введення в комірку АДФ); АТФ - активність P гідролазних реакцій як відношення V4/V4 , характеризує швидкість регенерації АДФ після його фосфорилування. Як субстрат окиснення використовували сукцинат. Загальноприйнятими методами [Мешкова Н.П., Северин С.Е. Практикум по биохимии. М.: 2+ 2+ МГУ, 1979. 428 с.] у печінці визначають Мg , Са - активовану АТФ-азу мітохондрій гепатоцитів, гексокиназу, фосфофруктокиназу, альдолазу, глюкозо-6-фосфатдегідрогеназу (Г-6ФДГ), лактатдегідрогеназу (ЛДГ), креатинфосфокіназу (КФК). Виявлено порівняно з контролем інгібування дихання мітохондрій після додавання сукцинату (у метаболічному стані V4), АДФ (V3) і разобщителя - 2,4 - динітрофенолу (V4P). Ці процеси супроводжуються зменшенням величини дихального коефіцієнта і коефіцієнта фосфорилування. Було встановлено зниження дихання мітохондрій у метаболічному стані V4 на P -38,8 %; 34,52 % і 37,16 %; V3-51,16 %; 48,7 % і 50,10 %; V4 -57,3 %; 56,12 % і 49,77 %, відповідно під впливом Л-501-2-100, Л-1601-2-50"Б" і Л-1601-2-50"Р" по зрівнянню з показниками в інтактній групі. При цьому відзначалося зниження величини дихального коефіцієнта на 19,10 %; 20,24 % і 20,53 %, коефіцієнта фосфорилування - 58,75 %;53,85 % і 61,54 %, відповідно у групі тварин, токсифікованих Л-501-2-100, Л-1601-2-50"Б" і Л-1601-2-50"Р". 2+ 2+ Активність мітохондріальної Са і Mg - залежної АТФ-ази також суттєво послаблювалася під 2+ впливом досліджуваних олігоефірів. Так, активність Mg - АТФ-ази знижена на 50,51 %; 48,10 % 2+ і 37,55 %; Са - залежної АТФ-ази - 53,53 %; 49,30 % і 37,5 %. Схожа динаміка була властива і + для Н - АТФ-ази, активність цього ензиму знижувалася відповідно на 55,8 %; 53,02 % і 59,17 %. Результати дослідження метаболічного стану мітохондрій гепатоцитів щурів, що піддавалися впливу ксенобіотиків у дозі 1/10 LD50, представлені в табл. 2 UA 96039 U Таблиця Метаболічний стан мітохондрій гепатоцитів щурів в умовах підгострого досліду під впливом олігоефірів в дозі 1/10 LD50 Група спостереження, М±m Л-501-2-100 Л-1601-2-50"Б" Л-1601-2-50"Р" Контроль n=10 n=10 n=10 n=10 Показники Дихання мітохондрій після додавання сукцинату (V4), нмоль O2/хв·мг білка Дихання після додавання АДФ (V3), нмоль O2/хв·мг білка Дихання після додавання P роз'єднувача 2,4-ДНФ (V4 ), нмоль O2/хв·мг білка Дихальний коефіцієнт, ДК=V3/V4, відн. од. Коефіцієнт фосфорилування, АДФ/О2 2+ Mg -ATO-aзa (мкмоль Рн/мг білка-1 ч) 2+ Са - АТФ-аза (мкмоль Рн/мг білка-1 ч) Н+ - АТФ-аза (мкмоль Рн/мг білка-1 ч) 1,83±0,16 1,12±0,05* 1,18±0,07* 1,15±0,06* 6,35±0,57 3,14±0,18* 3,26±0,22* 3,17±0,25* 7,68±0,73 3,28±0,24* 3,37±0,33* 3,19±0,28* 3,46±0,36 2,80±0,12* 2,76±0,20* 2,75±0,15* 2,86±0,25 1,180,05* 1,32±0,07* 1,10±0,04* 84,32±6,10 41,73±3,44* 43,80±2,96* 39,76±3,52* 69,84±4,53 32,46±2,75* 35,42±2,58* 43,62±3,78* 77,54±5,83 34,27±2,56* 36,43±3,25* 31,66±3,15* Примітка:* - розбіжності з контролем достовірні, р