Спосіб діагностики ендогенної інтоксикації

Реферат: Спосіб діагностики ендогенної інтоксикації шляхом використання Т-лімфоцитів включає додавання рідкого біологічного середовища у розведену суспензію Т-лімфоцитів. Після підраховують кількість розеткоутворюючих клітин та визначають наявність ендогенної інтоксикації. UA 71656 U (12) UA 71656 U UA 71656 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до експериментальної медицини і присвячена діагностиці проявів ендогенної інтоксикації (ЕІ) при хронічних процесах. ЕІ - це неспецифічний синдром, який погіршує перебіг патологічних процесів внаслідок накопичення у концентраціях значно більших за фізіологічні, токсичних продуктів метаболізму на тлі пригнічення функціонального стану систем ендогенної детоксикації. У зв'язку з цим, важливою являється розробка інформативних засобів діагностики проявів ЕІ. Найбільш відомі методи виявлення проявів ЕІ при тяжких станах (сепсис, опіки, травми, інфекційні хвороби тощо). Але, в останній час, доведено, що прояви ЕІ визначаються i при хронічних станах (захворювання суглобів, артеріальна гіпертензія, хронічний психо-емоційний стрес тощо), що потребує застосування інформативних методів діагностики, розроблених з врахуванням особливостей патогенезу хронічних процесів. Основні засоби діагностики ЕІ базуються на визначенні у сироватці або плазмі крові гуморальних речовин - молекул середньої маси (МСМ), сечовини, білірубіну, продуктів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ), ферментів протеолізу тощо, накопичення яких в концентраціях, що перевищують фізіологічні, супроводжуються токсичним ефектом. У першу чергу це відноситься до їх пошкоджуючої дії на клітинні мембрани та порушення функціонального стану клітин. Разом з цим, наявність прямих доказів пошкоджуючої дії токсичних метаболітів на функціональний стан різних клітин організму недостатня, та потребує вивчення прямої дії цих речовин на функціональний стан клітин організму. У зв'язку з цим, приваблюють увагу методи біотестування в основі яких лежить дослідження впливу біологічної рідини, одержаної від хворих або тварин з ознаками ЕІ (сироватка крові, плазма крові, сеча) на функціональну активність різних клітин в дослідах in vitro. Існує спосіб діагностики ЕІ [1], основу якого складає визначення впливу токсичних речовин сечі на рухомість сперматозоїдів бика. Слід підкреслити, що ця тест-система широко використовується для оцінки токсичної (пірогенної) дії різних медичних виробів та лікарських засобів. В основі способу лежить дослідження активності рухомості сперматозоїдів в залежності від часу дії токсичних метаболітів, що знаходяться у сечі. Спосіб виконується наступним чином. Сечу розводять глюкозоцитратним середовищем (глюкоза - 4 г, цитрат натрію 1 1 г, дистильована вода - 100 мл) у співвідношенні 1:2. До розведеної сечі додають тест-систему - суспензію сперматозоїдів бика у вигляді заморожених гранул. Токсичну дію сечі оцінують по її обмежуючому впливу на рухомість сперматозоїдів. Інтенсивність рухомості сперматозоїдів (S) оцінюють на аналізаторі токсичності АТ-04; результати порівнюють з даними контролю (гранули сперматозоїдів + глюкозоцитратне середовище) з подальшим розрахунком індексу токсичності сечі Іm. Іm - співвідношення Sдосліду/Sконтролю. Чим нижче значення Іm, тим вище токсичність сечі яка досліджувалась. На підставі одержаних даних роблять висновки, що цей тест відображає рівень ЕІ у хворих на алергічні захворювання та може бути застосовано як контроль за ефективністю терапії. Але спосіб потребує наявності у лабораторії стандартної суспензії заморожених гранул сперматозоїдів бика; апарату за контролем рухомості сперматозоїдів - аналізатор токсичності АТ-04. Використання як контроль системи глюкозоцитратного розчину - сперматозоїдів бика, недостатньо для коректної оцінки результатів. Більш адекватним є використання для контролю сечі здорової людини, що дасть можливість об'єктивно довести токсичну дію сечі хворих. Відомий спосіб діагностики ЕІ [2] заснований на визначенні властивості еритроцитів периферійної крові абсорбувати продукти метаболізму, що накопичуються в крові хворих. Спосіб виконують шляхом додавання до 1 мл еритроцитарної маси зразка крові, що досліджується, розчину вітального барвника і після процедури інкубації та центрифугування визначається оптична щільність розчину. Абсорбційна здатність еритроцитів наростає залежно від тяжкості процесу. Так, найбільший відсоток поглинання барвника виявлений у щурів з моделлю калового перитоніту (64,1±5,0 % при нормі 45,2±5,1 %, р0,5). Разом з тим метод має ряд суттєвих недоліків: 1. Метод інформативний тільки при його використанні в умовах тяжких проявів ЕІ, та не підходить для встановлення проявів ЕІ в умовах хронічних процесів; 2. Спосіб рекомендовано для застосування як експрес-метод, у зв'язку з чим не доведена доцільність його використання як контролю за ефективністю лікування; 3. Метод відображає тільки інтенсивність накопичення токсичних продуктів і не відображає стан систем детоксикації (антиоксидантна система (АОС), імунна система, фільтраційна здатність нирок). 1 UA 71656 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Найбільш близьким до заявленого способу є спосіб діагностики запропонований для визначення ЕІ у хворих із черепно-мозковими травмами [3]. В основі способу лежить визначення МСМ та кількості Т-лімфоцитів у периферійній крові хворих. Визначення МСМ виконували загальноприйнятим методом, а кількість Т-лімфоцитів та їх субпопуляцій (Т-хелпери, Т-супресори) за методом розеткоутворення з еритроцитами барану. Встановлено зв'язок між важкістю стану хворих, рівнем МСМ - основного маркера ЕІ та загальною кількістю Т-лімфоцитів та співвідношенням субпопуляції Т-лiмфоцитів (Т-хелпери/Тсупресори). Найбільше підвищення вмісту МСМ та зниження кількості Т-лімфоцитів, зсуви у співвідношенні Т-х/Т-с спостерігалось у хворих з більш тяжким перебігом захворювання. Застосування таких показників, як визначення МСМ та показників стану Т-системи лімфоцитів дозволяє одержувати уявлення про вираженість проявів ЕІ та механізми формування вторинної імунодепресії, яка розвивається у хворих з черепно-мозковою травмою. Але цей спосіб має ряд недоліків: 1) Він відображає тільки факт зниження Т-лімфоцитів у крові відповідно до тяжкості патологічного процесу, але не дає відповіді за рахунок яких речовин порушується функціональна активність Т-лімфоцитів, що фіксується у тесті розеткоутворення; 2) Для виконання процедури метода необхідно отримати у хворих значний обсяг крові для виділення суспензії Т-лімфоцитів та їх субпопуляцiй, та проведення процедури розеткоутворення у динаміці, на кожному етапі лікування, що обумовлює великий обсяг роботи. В основу корисної моделі поставлена задача визначення впливу токсичних речовин, що знаходяться у крові хворих та обумовлюють прояви ЕІ, in vitro використовуючи для цього суспензію Т-лімфоцитів (бiотестування), що дозволить значно спростити спосіб та підвищити його інформативність. Поставлена задача вирішується тим, що в способі діагностики ЕІ, згідно з корисною моделлю, у виділену з крові здорових тварин суспензію Т-лімфоцитів додають рідке біологічне середовище (наприклад сироватку крові) та після підрахування кількості розеткоутворюючих клітин - по пригніченій функції лімфоцитів визначають наявність ЕІ. Суть способу полягає у тому, що визначають вплив токсичної речовини сироватки крові на функціональний стан Т-клітин по їх здібності утворювати розетки з еритроцитами барану (розеткоутворювання). Токсичні речовини, що знаходяться у сироватці крові щурів з ЕІ, можуть блокувати рецептори Т-лiмфоцитів і значно зменшувати їх здатність утворювати розетки, тобто блокують функціональну активність цих клітин. Спосіб виконується наступним чином. Виділену з периферійної крові здорових (інтактних) щурів традиційним методом суспензію Т-лімфоцитiв розводять до стандартної концентрації 6 3 2×10 клітин в 1,0 см розчину. 3 3 До 0,1 см суспензії лімфоцитів додають 0,1 см сироватки дослідних тварин розведеної фізіологічним розчином 1:10 та інкубують протягом 30 хв. при 37 °C. Після експозиції додають 3 0,1 см 0,5 % зависі гетерогенних еритроцитів барана, інкубують 5 хв. при 37 °C потім центрифугують 5 хв. при 1500 об/хв. та інкубують протягом 60 хв. при 4 °C для припинення 3 реакції. У кожну пробірку додають 0,02 см фіксатора та залишають на 10 хв. при кімнатній 3 температурі. У пробірки додають по 7 см дистильованої води та центрифугують 5 хв. при 1500 об/хв. Осад ресуспензують та роблять мазки, які після висихання, фарбують барвникомфіксатором Май-Грюнвальда з подальшою мікроскопією, з підрахунком розеткоутворюючих клітин на 200 лімфоцитів. Спосіб апробовано на моделі емоційно-іммобілізацiйного хронічного стресу (ЕІХС). На основі верифікованих показників ЕІ - МСМ, визначення вмісту циркулюючих імунних комплексів (ЦІК), величин лейкоцитарного індексу інтоксикації (ЛII), активності ПОЛ [4], було підтверджено наявність прояв ЕІ на протязі розвитку патологічного процесу в умовах цієї моделі. Одночасно, визначався вплив сироватки крові, одержаної на15-ту та 30-ту добу моделювання на функціональну активність (розеткоутворювання) Т-лiмфоцитів інтактних тварин. Приклад: Дослідження проведені на моделі хронічного стресу ЕІХС у щурів, яку відтворювали шляхом розміщення тварин по 3 години на добу в окремих клiтках-пеналах, протягом 30 діб. Як це наведено у таблиці 1 на 15-ту добу формування ЕІХС у щурів суттєво підвищується вміст МСМ254, вміст ЦІК, величина ЛII, та активність ПОЛ, що свідчить про наявність ЕІ. У таблиці 1 наведенні показники маркерів ЕІ на різних етапах розвитку процесу. 2 UA 71656 U Таблиця 1 Показники МСМ 254, у.ед МСМ 280, ум. од ЦІК, мг/мл ЛII, ум.од. ПОЛ (МДА), нмоль/(хв.·мг) Інтактні щури 0,34±0,02 0,22±0,01 5,7±0,2 0,080±0,010 15-та доба ЕІХС 0,57±0,01 0,26±0,01 6,97±0,23 0,106±0,014 Р