Спосіб кількісного визначення білків

Спосіб кількісного визначення білків, що передбачає приготування проби для аналізу, взаємодію її з розчинами хлориду тербію і органічного реагенту при заданому рН, опромінювання утвореної системи УФ-світлом та вимірювання інтенсивності люмінесценції реакційного розчину при  еміс = 545 нм, який відрізняється тим, що як органічний реагент використовують розчин 6-[(1гідроксі-3-оксо-6,7-дигідро-3Н,5Н-піридо[3,2,1ij]хінолін-2-карбоніл)-аміно]-гексанової кислоти при рН 7,5-8,0, а опромінювання проводять УФ-світлом при  збудж= 300 нм. Винахід належить до аналітичної хімії, зокрема до люмінесцентного визначення біологічноактивних речовин - білків (бичачий сироватковий альбумін - БСА, сироватковий альбумін людини САЛ, імуноглобулін G - IgG). Лантанідні комплекси широко вживають як люмінесцентні зонди для визначення органічних сполук (зокрема лікарських препаратів), нуклеїнових кислот та в імунофлуоресцентному аналізі. Люмінесценція у цих комплексах є результатом ефективної внутрішньомолекулярної передачі енергії від органічної частини молекули до іону лантаніду. Основними вимогами до комплексних сполук лантанідів для їх вживання як зондів в біоаналізі є: високий квантовий вихід, висока кінетична стабільність, добра розчинність у воді при оптимальних фізіологічних значеннях рН. Ефективність застосування таких комплексів як аналітичних форм в біоаналітичній хімії обумовлена їх вузькими емісійними смугами, можливістю усунення впливу біологічної матриці на аналітичний сигнал. Білки, необхідні складові всіх живих організмів, відіграють важливу роль у процесах життєдіяльності, тому їх вивчення та визначення є актуальним. При опромінюванні світлом білки проявляють власну люмінесценцію. У зв'язку з низькою ефективністю збудження, інтенсивність такої люмінесценції незначна, що не дозволяє використовувати її для високочутливого визначення. Тому актуальна задача підвищення чутливості визначення білків завдяки застосуванню люмінесцентних зондів (іонів металів, органічних барвників, комплексів металів), люмінесценція котрих значно змінюється при взаємодії з білками (збільшується або гаситься). Відомий спосіб, який полягає у збільшенні інтенсивності люмінесценції (Ілюм) комплексу європію з доксицикліном (ДЦ) в лужному буферному розчині (рН = 10,2) при додаванні сироваткового альбуміну людини (див. Jiang С., Luo L. Spectrofluorimetric determination of human serum albumin using a doxycycline - europium probe // Anal. Chim. Acta. - 2004. - V. 506. - P. 171-175.). Спосіб передбачає додавання компонентів у наступній 3+ -6 послідовності: іонів Еu (1,6х10 моль/л); ДЦ -6 (1,6х10 моль/л ); САЛ (0,0-9,2 мкг/мл) та амонійного буферного розчину (рН = 10,2). Далі цю суміш залишають на 40 хвилин і потім реєструють Ілюм (19) UA (11) 96085 (13) C2 (21) a201008102 (22) 29.06.2010 (24) 26.09.2011 (46) 26.09.2011, Бюл.№ 18, 2011 р. (72) ЛЕОНЕНКО ІННА ІГОРІВНА, АЛЕКСАНДРОВ ДАР'Я ІГОРІВНА, ЄГОРОВА АЛЛА ВОЛОДИМИРІВНА, УКРАЇНЕЦЬ ІГОР ВАСИЛЬОВИЧ, АНТОНОВИЧ ВАЛЕРІЙ ПАВЛОВИЧ (73) ФІЗИКО-ХІМІЧНИЙ ІНСТИТУТ ІМ. О.В. БОГАТСЬКОГО НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ (56) Wu X., Zheng J., Guo Ch.Y., Yang J., Ding H., Zh. Hu, Li Chao. Determination of albumins by its quenching effect on the fluorescence of Tb3+-oxolinic acid complex in presence of sodium dodecyl sulphate // J. Luminescence. - 2007. - V. 126. - P. 171 - 176 Kutyrev A., Kappe T. Methanetricarboxylates as key reagents for the simple preparation of heteroarylcarboxamides with potential biological 3 при  збудж.= 385 нм та  еміс = 612 нм, межа виявлення 64,0 нг/мл. Недоліками даного способу є: залежність люмінесцентного сигналу від часу реагування компонентів системи, що свідчить про недостатню стійкість комплексу, у зв'язку з чим визначення Ілюм необхідно вести при фіксованому часі (40 хвилин), а також використання сильно лужного середовища (рН=10,2), що не є пригодним для біооб'єктів, для яких необхідне фізіологічне значення рН. Найбільш близьким є спосіб люмінесцентного визначення сироваткового альбуміну людини (див. Wu X., Zheng J., Guo Ch.Y., Yang J., Ding H., Zh. Hu, Li Chao. Determination of albumins by its 3+ quenching effect on the fluorescence of Tb -oxolinic acid complex in presence of sodium dodecyl sulphate // J. Luminescence. - 2007. - V. 126. - P. 171-176), в -6 якому до розчину хлориду тербію (6x10 моль/л) -5 додають розчин оксолінової кислоти (OK) (1x10 моль/л), САЛ (0,1-10,0 мкг/мл), додецилсульфат -4 натрію (4x10 моль/л), ацетатно-аміачний буферний розчин рН=6,0, перемішують, залишають на 25 хвилин, записують люмінесценцію при  збудж. = 360 нм та  еміс = 545 нм. Інтенсивність люмінесценції комплексу тербію з ОК зменшується у 3 рази в присутності 10 мкг/мл САЛ (це максимальна концентрація з інтервалу лінійності), але тільки у присутності додецилсульфату натрію, котрий теж значно гасить люмінесценцію комплексу (у 2 рази). Межа виявлення САЛ в цьому способі декларована авторами на рівні 25 нг/мл. Цей спосіб визначення білків застосовує гасіння люмінесценції зонду (комплексу тербію з ОК) в присутності додецилсульфату натрію при додаванні білків. Даний спосіб вибрано прототипом: Прототип та спосіб, що заявляється, мають такі спільні ознаки: - приготування проби; - взаємодію білка з розчином комплексу хлориду тербію з відповідним органічним реагентом при заданому рН водного середовища; - опромінювання утвореної потрійної системи УФ-світлом; - вимірювання інтенсивності люмінесценції розчину при  еміс = 545 нм. Але спосіб за прототипом вимагає використання міцелярного середовища, яке створюють додаванням поверхневоактивної речовини (ПАР) - додецилсульфату натрію (який теж є гасником Ілюм зонду), що призводить до ускладнення системи, а також до необхідності залишати аналізований розчин на 25 хвилин для одержання максимального сигналу (Ілюм). В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб кількісного визначення білків за ефектом гасіння люмінесценції комплексної сполуки тербію, в якому шляхом використання нового органічного реагенту забезпечується просте та швидке визначення білків. Поставлена задача вирішена в способі визначення білків, що передбачає приготування проби для аналізу, взаємодію її з розчинами хлориду тербію і органічного реагенту при заданому рН, опромінювання утвореної системи УФ-світлом та вимірювання інтенсивності люмінесценції, тим, що 96085 4 як органічний реагент використовують 6-[(1гідрокси-3-оксо-6,7-дигідро-ЗН,5Н-піридо[3,2,1ij]хінолін-2-карбоніл)-аміно]-гексанову кислоту (L) при рН 7,5-8,0, а опромінювання проводять УФ світлом при  збудж = 300 нм. Новим у винаході, що заявляється, є наявність наступних ознак : - як органічний ліганд використовують 6-[(1гідроксі-3-оксо-6,7-дигідро-3Н,5Н-піридо[3,2,1іj]хінолін-2-карбоніл)-аміно]-гексанову кислоту; - опромінювання утвореної системи Тb(III)-Lбілок УФ-світлом з  збудж=300 нм. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю суттєвих ознак, що заявляються, і технічним результатом, що досягається, полягає в наступному: - високий квантовий вихід (Q = 0,31) водного розчину комплексної сполуки тербію з наведеним органічним лігандом дозволяє зменшити кількість реагентів та уникнути використання міцелярного середовища; - зменшити час визначення білків. Визначення стало можливим завдяки використанню нового люмінесцентного зонду - комплексу тербію з новим лігандом 6-[(1-гідроксі-3-оксо-6,7дигідро-3Н,5Н-піридо[3,2,1-ij]хінолін-2-карбоніл)аміно]-гексановою кислотою (див. Kutyrev A., Kappe T. Methanetricarboxylates as key reagents for the simple preparation of heteroarylcarboxamides with potential biological activity. Part 1. Reaction of methanetricarboxylates with indoline and 1,2,3,4tetrahydroquinoline // J. Heterocycl. Chem. 1997, V. 34, № 3, P. 969-972). Це можна пояснити наступним. Органічний ліганд належить до похідних 2оксо-4-гідрокси-хінолінкарбонової кислоти і має таку структурну формулу: OH O OH N H N O O . Обробка стандартного розчину солі тербію водним розчином реагенту також, як і у випадку прототипу, посилює люмінесценцію тербію, але без використання ПАР. Цей реагент має в ультрафіолетовій області спектру смуги поглинання з високими молярними коефіцієнтами екстинкції (  334 = . -1. -1 . -1. -1 5100 л моль см ;  293 = 19900 л моль см ;  236 . -1. -1 = 49200 л моль см ), що обумовлює ефективне поглинання енергії збудження. Ця енергія переда-1 ється з триплетного рівня ліганду (ЕT = 22000 см ) 5 -1 на енергетичний рівень Tb (E D4 = 20500см ), що призводить до значного зростання Ілюм тербію. Взаємодія білків з люмінесцентним зондом комплексом Тb(ІІІ)-L відбувається при рН 4,0-11,0, максимум люмінесценції спостерігається при рН 7,5-8,0 (див. Фіг.1, де наведено залежність інтенсивності люмінесценції (відносних одиниць - відн. од.) системи Tb-L-БСА від рН розчину (СTb(III) = CL= -6 1 х 10 моль/л; Сбса = 5 мкг/мл)). У запропонованому способі для утворення оптимального рН се 5 96085 редовища використовується 40 % уротропіновий розчин (рН=8,0). Максимальний ефект гасіння спостерігається при співвідношенні Tb : L = 1:1, оптимальна конце3+ -6 нтрація іонів Тb та реагенту становить 1x10 моль/л (див. Фіг.2, де наведено залежність інтенсивності люмінесценції (відн. од.) системи Тb(III)-LБСА від концентрацій L (а) та Тb(ІІІ) (б) (СБСА = 20 мкг/мл)). Необхідний час для реагування компонентів системи Тb(III)-L-БСА та досягнення оптимального аналітичного сигналу становить 5 хвилин. Далі інтенсивність люмінесценції залишається постійною протягом 2 годин (див. Фіг.3, де наведено залежність інтенсивності люмінесценції (відн. од.) системи Тb(III)-L-БСА від часу реагування -6 компонентів (СTb = CL = 110 моль/л; СБСА = 20 мкг/мл)). Гасіння Ілюм тербію в комплексі Тb(III)-Lбілок спостерігається при опромінюванні утвореного комплексу УФ-світлом з  збудж = 300 нм (див. Фіг.4, де наведено спектри люмінесценції комплексу Tb(III)-L в присутності різних концентрацій БСА -6 (а), САЧ (б), IgG (в) (СTb = CL = 1 10 моль/л; СБілка= 0,1-70,0 мкг/мл)). Інтенсивність люмінесценції тербію в системах Тb(III)-L-білок пропорційна в інтервалі концентрацій БСА - 0,1-40,0 мкг/мл; САЛ - 0,1-40,0 мкг/мл; IgG - 0,1-70,0 мкг/мл (див. Фіг.5, де наведено градуювальні графіки у координатах Штерна-Фольмера для визначення БСА (а), САЧ -6 (б), IgG (в) (СTb = CL = 1 10 моль/л)). Також встановлено, що при додаванні різних концентрацій білків час життя збудженого стану іонів тербію не змінюється. Для прикладу наведені криві загасання люмінесценції комплексу Tb(III)-L у присутності різних концентрацій БСА (див. Фіг.6, де наведено криві загасання люмінесценції ком-6 плексу Tb(III)-L (СTb = CL = 1 10 моль/л) у присутності різних концентрацій БСА (мкг/мл): 1 - 0; 2 0,5; 3 - 1,0; 4 - 2,0; 5 - 5,0). Висунуто припущення щодо змішаного механізму гасіння: статичного, пов'язаного з утворенням систем Тb(III)-L-білок, та динамічного, обумовленого зіткненням молекул зонду та гасників у збудженому стані. При цьому спостерігається характерна в таких випадках особливість графіку Штерна 6 Фольмера - відхилення вгору та вгнутість по відношенню до осі у (див. Lakowicz J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York:Plenum, 1986). Приклад. Визначення проводили на модельних розчинах шляхом введення відомої кількості білків. Кількісне визначення білків проводили за градуювальним графіком. Градуювальний графік будують наступним чином: у мірні колби місткістю 10 мл вносять по 0,01; 0,05; 0,10; 0,20; 0,30; 0,40; 0,50; 0,60; 0,70; 0,80; 0,90; 1,00; 1,20; 1,30; 1,50; 1,80; 2,00; 2,50; 3,00; 3,50; 4,00; 5,00; 6,00; 6,50; 7,00 мл робочого розчину БСА (САЛ, IgG) (100 мкг/мл) (5 паралельних -5 вимірів). В кожну колбу додають по 1,0 мл 1х10 -5 моль/л розчину хлориду тербію, 1,0 мл 1 х 10 моль/л розчину L, 0,4 мл 40 %-ного розчину уротропіну. Доводять водою до 10,0 мл та перемішують. Паралельно готують розчин контрольної проби, який містить усі компоненти, крім білків. Через 5 хв. вимірюють інтенсивність люмінесценції за  еміс = 545 нм (  збудж = 300 нм) у кожній точці (І) та інтенсивність люмінесценції контрольної проби (І0). За допомогою одержаних результатів будують градуювальний графік залежності І0/І від концентрації білків (мкг/мл) у координатах ШтернаФольмера (див. Фіг. 4, а,б,в) в інтервалі концентрацій білків 0,1-70,0 мкг/мл. Методика У мірні колби місткістю 10 мл вносять по 1,0 мл робочих розчинів хлоридів калію, натрію, каль-4 цію та глюкози (1х10 моль/л); по 0,5 мл робочого . -4 розчину L-аланіну (1 10 моль/л), додають по 0,5; 2,0; 5,0 мл робочого розчину БСА (САЛ, IgG) (100 мкг/мл) (5 паралельних вимірів). Далі додають усі реактиви та проводять вимірювання як у випадку градуювального графіка. Результати визначення білків в модельних розчинах представлено в таблиці. Таблиця Результати визначення білків методом "введено - знайдено" (n=5; Р=0,95) Білок Сторонні речовини + САЛ IgG n+ 2+ Na , K , Са , глюкоза, L-аланін + + 2+ Na , K , Са , глюкоза, L-аланін + + 2+ Na , K , Са , глюкоза, L-аланін БСА СMе + -5 -5 =1х10 моль/л; СГлюкоза = 1х10 моль/л; -6 CL-Аланін = 5 х10 моль/л Точність і правильність визначення білків у розчинах перевірені методом "введено - знайдено". При n=5; Р=0,95 відносне стандартне відхилення (sr) складає 0,019-0,049. Введено білка, мкг/мл 5,0 20,0 5,0 50,0 5,0 20,0 Знайдено білка, мкг/мл 5,2±0,3 19,4±0,5 4,9±0,3 50,6±1,4 5,2±0,3 20,6±0,5 Sr 0,048 0,022 0,046 0,023 0,049 0,019 Таким чином, спосіб, що заявляється, дозволяє забезпечити достатню чутливість та збіжність визначення білків та прискорити проведення аналізу у 4-5 разів. 7 96085 8 9 96085 10 11 Комп’ютерна верстка А. Крулевський 96085 Підписне 12 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601