Спосіб кількісного визначення білків

Спосіб кількісного визначення білків, що включає приготування проби для аналізу, взаємо 3 Wu X., Zheng J., Guo Ch.Y., Yang J., Ding H., Zh. Hu, Li Chao. Determination of albumins by its quenching effect on the fluorescence of Tb3+-oxolinic acid complex in presence of sodium dodecyl sulphate // J. Luminescence. - 2007. - V. 126. - P. 171-176), в якому до розчину хлориду тербію ( 6  10 6 моль/л) додають розчин оксолінової кислоти (OK) ( 1 10 5 моль/л), САЛ (0,1-10,0 мкг/мл), додецилсульфат натрію ( 4  10 4 моль/л), ацетатно-аміачний буферний розчин рН=6.0, перемішують, залишають на 25 хвилин, записують люмінесценцію при  збудж  360 нм та  еміс  545 нм. Інтенсивність люмінесценції комплексу тербію з ОК зменшується у 3 рази в присутності 10 мкг/мл САЛ (це максимальна концентрація з інтервалу лінійності), але тільки у присутності додецилсульфату натрію, котрий теж значно гасить люмінесценцію комплексу (у 2 рази). Межа виявлення САЛ в цьому способі декларована авторами на рівні 25 нг/мл. Цей спосіб визначення білків застосовує гасіння люмінесценції зонду (комплексу тербію з ОК) в присутності додецилсульфату натрію при додаванні білків. Даний спосіб обрано прототипом: Прототип та спосіб, що заявляється, мають такі спільні ознаки: - приготування проби; - взаємодію білка з розчином комплексу хлориду тербію з відповідним органічним реагентом при заданому рН водного середовища; - опромінювання утвореної потрійної системи УФ світлом; - вимірювання інтенсивності люмінесценції розчину при  еміс  545 нм. Але спосіб за прототипом вимагає використання міцелярного середовища, яке створюють додаванням поверхнево-активної речовини (ПАР) - додецилсульфату натрію (який теж є гасником Iлюм зонду), що призводить до ускладнення системи, а також до необхідності залишати аналізуємий розчин на 25 хвилин для одержання максимального сигналу І люм  . В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб кількісного визначення білків за ефектом гасіння люмінесценції комплексної сполуки тербію, в якому шляхом використання нового органічного реагенту забезпечується просте та швидке визначення білків. Поставлена задача вирішена в способі визначення білків, що передбачає приготування проби для аналізу, взаємодію її з розчинами хлориду тербію і органічного реагенту при заданому рН, опромінювання утвореної системи УФ-світлом та вимірювання інтенсивності люмінесценції, тим, що як органічний реагент використовують 6-[(1гідроксі-3-оксо-6,7-дигідро-3Н,5Н-піридо[3,2,1ij]хінолін-2-карбоніл)-аміно]-гексанову кислоту (L) при рН 7,5-8,0, а опромінювання проводять УФ світлом при  збудж  300 нм. Новим у корисній моделі, що заявляється, є наявність наступних ознак: 57591 4 - як органічний ліганд використовують 6-[(1гідроксі-3-оксо-6,7-дигідро-3Н,5Н-піридо[3,2,1ij]хінолін-2-карбоніл)-аміно]-гексанову кислоту; - опромінювання утвореної системи Тb(III)-Lбілок УФ-світлом з  збудж  300 нм. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю суттєвих ознак, що заявляються, і технічним результатом, що досягається, полягає в наступному: - високий квантовий вихід (Q = 0,31) водного розчину комплексної сполуки тербію з наведеним органічним лігандом дозволяє зменшити кількість реагентів та уникнути використання міцелярного середовища; - зменшити час визначення білків. Визначення стало можливим завдяки використанню нового люмінесцентного зонду - комплексу тербію з новим лігандом 6-[(1-гідрокси-3-оксо-6,7дигідро-3Н,5Н-піридо[3,2,1-іj]хінолін-2-карбоніл)аміно]-гексановою кислотою (див. Kutyrev A., Kappe T. Methanetricarboxylates as key reagents for the simple preparation of heteroarylcarboxamides with potential biological activity. Part 1. Reaction of methanetricarboxylates with indoline and 1,2,3,4tetrahydroquinoline // J. Heterocycl. Chem. 1997, V. 34, № 3, P. 969-972). Це можна пояснити наступним. Органічний ліганд відноситься до похідних 2оксо-4-гідрокси-хінолінкарбонової кислоти і має таку структурну формулу: OH O OH N H N O O Обробка стандартного розчину солі тербію водним розчином реагенту також, як і у випадку прототипу, посилює люмінесценцію тербію, але без використання ПАР. Цей реагент має в ультрафіолетовій області спектру смуги поглинання з високими молярними коефіцієнтами екстинкції (  334  5100 л  моль 1  см 1 ;  293  19900 л  моль 1  см 1 ;  236  49200 л  моль 1  см 1 ) , що обумовлює ефективне поглинання енергії збудження. Ця енергія передається з триплетного рівня ліганду Е Е Т 5  22000 см 1 D4  на енергетичний рівень Tb3+   20500 см 1 , що призводить до значного зростання Iлюм тербію. Взаємодія білків з люмінесцентним зондом комплексом Tb(III)-L відбувається при рН 4,0-11,0, максимум люмінесценції спостерігається при рН 7,5-8,0 (див. Фіг. 1, де наведено залежність інтенсивності люмінесценції (відносних одиниць - відн.од.) системи Tb-L-БСА від рН розчину ( C Tb III   CL  1 10 6 моль/л; C БСА  5 мкг/мл)). У запропонованому способі для утворення оптимального рН середовища використовується 40 % уротропиновий розчин (рН=8,0). 5 57591 Максимальний ефект гасіння спостерігається при співвідношенні Tb : L = 1:1, оптимальна конце 6 нтрація іонів Тb3+ та реагенту становить 1 10 6 моль/л (див. Фіг. 2, де наведено залежність інтенсивності люмінесценції (відн. од.) системи Тb(III)-LБСА від концентрацій L (а) та Тb(ІІІ) (б) ( C БСА  20 мкг/мл)). Необхідний час для реагування компонентів системи Тb(III)-L-БСА та досягнення оптимального аналітичного сигналу становить 5 хвилин. Далі інтенсивність люмінесценції залишається постійною протягом 2 годин (див. Фіг. 3, де наведено залежність інтенсивності люмінесценції (відн. од.) системи Тb(III)-L-БСА від часу ношенню до осі у (див. Lakowicz J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum, 1986). Приклад. Визначення проводили на модельних розчинах шляхом введення відомої кількості білків. Кількісне визначення білків проводили за градуювальним графіком. Градуювалъний графік будують наступним чином: у мірні колби місткістю 10 мл вносять по 0,01; 0,05; 0,10; 0,20; 0,30; 0,40; 0,50; 0,60; 0,70; 0,80; 0,90; 1,00; 1,20; 1,30; 1,50; 1,80; 2,00; 2,50; 3,00; 3,50; 4,00; 5,00; 6,00; 6,50; 7,00 мл робочого розчину БСА (САЛ, IgG) (100 мкг/мл) (5 паралельних ( C Tb  CL  1 10 6 вимірів). В кожну колбу додають по 1,0 мл 1 10 5 моль/л; C БСА  20 мкг/мл). Гасіння I люм тербію в комплексі Тb(III)-L-білок спостерігається при опромінюванні утвореного комплексу УФ-світлом з  збудж  300 нм (див. Фіг. 4, де наведено спектри люмінесценції комплексу Тb(III)-L в присутності різних концентрацій БСА (а), САЧ (б), IgG (в) моль/л розчину хлориду тербію, 1,0 мл 1 10 5 моль/л розчину L, 0,4 мл 40 %-ного розчину уротропіну. Доводять водою до 10,0 мл та перемішують. Паралельно готують розчин контрольної проби, який містить усі компоненти, крім білків. Через 5 хв. вимірюють інтенсивність люмінесценції за  еміс  545 нм (  збудж  300 нм) у кожній точці (І) реагування компонентів ( C Tb  CL  1 10 6 моль/л; C Білка  0,1  70,0 мкг/мл)). Інтенсивність люмінесценції тербію в системах Тb(III)-L-білок пропорційна в інтервалі концентрацій БСА - 0,1-40,0 мкг/мл; САЛ - 0,1-40,0 мкг/мл; IgG - 0,1-70,0 мкг/мл (див. Фіг. 5, де наведено градуювальні графіки у координатах ШтернаФольмера для визначення БСА (а), САЧ (б), IgG (в) ( C Tb  CL  1 10 6 моль/л)). Також встановлено, що при додаванні різних концентрацій білків час життя збудженого стану іонів тербію не змінюється. Для прикладу наведені криві затухання люмінесценції комплексу Тb(III)-L у присутності різних концентрацій БСА (див. Фіг. 6, де наведено криві затухання люмінесценції комплексу Tb(III)-L ( C Tb  CL  1 10 6 моль/л) у присутності різних концентрацій БСА (мкг/мл):1 - 0; 2 0,5; 3 - 1,0; 4 - 2,0; 5 - 5,0). Висунуто припущення щодо змішаного механізму гасіння: статичного, пов'язаного з утворенням систем Тb(III)-L-білок, та динамічного, обумовленого зіткненням молекул зонду та гасників у збудженому стані. При цьому спостерігається характерна в таких випадках особливість графіку ШтернаФольмера - відхилення вгору та вгнутість по від та інтенсивність люмінесценції контрольної проби I0  . За допомогою одержаних результатів будують градуювальний графік залежності I0 / I від концентрації білків (мкг/мл) у координатах ШтернаФольмера (див. Фіг. 4, а,б,в) в інтервалі концентрацій білків 0,1-70,0 мкг/мл. Методика У мірні колби місткістю 10 мл вносять по 1,0 мл робочих розчинів хлоридів калію, натрію, кальцію та глюкози ( 1 10 4 моль/л); по 0,5 мл робочого розчину L-аланіну ( 1 10 4 моль/л), додають по 0,5; 2,0; 5,0 мл робочого розчину БСА (САЛ, IgG) (100 мкг/мл) (5 паралельних вимірів). Далі додають усі реактиви та проводять вимірювання як у випадку градуювального графіка. Результати визначення білків в модельних розчинах представлено в таблиці. Таблиця Результати визначення білків методом "введено - знайдено" (n=5; Р=0,95) Білок БСА САЛ IgG Сторонні речовини Na+, K+, Са2+, глюкоза, L-аланін Na+, K+, Са2+, глюкоза, L-аланін Na+, K+, Са2+, глюкоза, L-аланін Введено білка, мкг/мл 5,0 20,0 5,0 50,0 5,0 20,0 Знайдено білка, мкг/мі 5,2±0,3 19,4±0,5 4,9±0,3 50,6±1,4 5,2±0,3 20,6±0,5 CMe n  1 10 5 моль/л; CГлюкоза  1 10 5 моль/л; CLАланін  5  10 6 Sr 0,048 0,022 0,046 0,023 0,049 0,019 7 Точність і правильність визначення білків у розчинах перевірені методом "введено - знайдено". При n=5; Р=0,95 відносне стандартне відхилення s r  складає 0,019-0,049. 57591 8 Таким чином, спосіб, що заявляється, дозволяє забезпечити достатню чутливість та збіжність визначення білків та прискорити проведення аналізу у 4-5 разів. 9 57591 10 11 Комп’ютерна верстка Л. Купенко 57591 Підписне 12 Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601