Спосіб моделювання трафаретної рани на тлі предіабету у щурів

Реферат: UA 97335 U UA 97335 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини та фармації, а саме до експериментального моделювання ранового процесу, зокрема трафаретної рани на тлі предіабету у лабораторних тварин. Як відомо, на рановий процес впливають багато чинників. Так наявність супутніх розладів, зокрема метаболічних порушень, пов'язаних зі станом предіабету, призводить до пригнічення репаративної регенерації та зниження швидкості загоєння. Це створює медико-соціальну, проблему викликану тривалою втратою працездатності та високим рівнем ускладнень при виникненні травматичних уражень у даної групи пацієнтів. Стрімке зростання захворюваності на цукровий діабет та супутні метаболічні порушення створює необхідність дослідження перебігу ранового процесу на фоні даної патології та потребує розробки нових експериментальних моделей. Широко використовується модель трафаретної рани на тлі інсулінорезистентності при введенні розчину фруктози [8]. Недоліком даної моделі є тривалість відтворення, яка складає 40 днів, та однонаправленість впливу на ланки патологічного процесу. Серед зарубіжних джерел [5, 7, 8] часто зустрічається модель ускладненого загоєння рани викликана введенням дексаметазону за день та в процесі лікування площинної рани. Проте використання дексаметазону в процесі експерименту утруднює об'єктивну оцінку ранозагоювальної активності досліджуваних препаратів. Як найближчий аналог вибрано модель повношарової площинної рани на тлі цукрового діабету, викликаного введенням алоксану або стрептозотоцину [6, 9]. До недоліків даного методу слід віднести високу вартість субстанцій та відтворення цукрового діабету І типу, який зустрічається лише у 5-10 % хворих на діабет. У зв'язку з вищевикладеним, в основу корисної моделі поставлено задачу розширення арсеналу способів моделювання ранового процесу з ускладненим перебігом. Поставлена задача вирішується таким чином, що спосіб моделювання трафаретної рани на тлі предіабету передбачає внутрішньом'язове введення 0,125 мг/кг дексаметазону та пероральне введення 20 % фруктози у питній воді щоденно протягом 14 днів з послідуючим відтворенням трафаретної рани шляхом вирізання на попередньо депільованій поверхні у наркотизованих щурів ділянки шкіри розміром 2×2 см (4 см). Протягом всього експерименту щури отримують стандартний раціон віварію. Замість питної води готують 20 % розчин фруктози та забезпечують тваринам вільний доступ до поїлки. Щодня протягом двох тижнів (14 діб) тваринам внутрішньом'язово вводять дексаметазон із розрахунку 0,125 мг/кг. Повношарові рани відтворюють на депільованій ділянці шкіри у наркотизованих тварин. Для цього тварин фіксують, за допомогою хірургічних ножиць вирізають ділянку шкіри 2 розміром 22 см (4 см ). Корисна модель ілюструється прикладами. Приклад 1. Дослідження морфогенезу повношарових вирізаних ран шкіри у фізіологічно здорових щурів та щурів з попередньо змодельованим діабетогенним станом. Стан ранового дефекту у всіх щурів досліджували на 6-й та 12-й день після відтворення рани. Всі зразки для подальшого світлооптичного дослідження фіксували у 10 % розчині формаліну, зневоднювали у спиртах зростаючої міцності, заливали у целоїдин-парафін. Зрізи фарбували гематоксиліном та еозином, пікрофуксином за Ван Гізон для виявлення колагенових волокон [3]. Огляд мікропрепаратів проводили під мікроскопами Micros 400 та Granum. Мікрофотографування мікроскопічних зображень здійснено цифровим фотоапаратом Nicon Col Pix 4500, цифровою відеокамерою Granum ДСΜ 310. Фотознімки обробляли на комп'ютері Pentium 2,4GHz за допомогою програм Nicon View 5 та Toup View. При загоєнні повношарових шкірних ран у щурів з попередньо змодельованим діабетогенним станом спостерігали затримку запальної стадії загоєння. Так, на 6-й день спостереження при загоєнні ран у фізіологічно здорових щурів фібриноїдно-некротичний шар у поверхневих шарах дефекту був доволі щільний, з обмеженою кількістю лейкоцитарних клітин. Молода новоутворена грануляційна тканина у донних зонах також вже достатньо очистилася від нейтрофільних лейкоцитів. Запальна реакція у межових з дефектом ділянках шкіри згасала. А у щурів з попередньо змодельованим діабетогенним станом той же фібриноїдно-некротичний шар був виразно розріджений, насичений поліморфно-ядерними лейкоцитами, осередки грануляцій також містили багато лейкоцитів, у межових зі здоровою шкірою ділянках спостерігали екзоцитоз епітеліального пласту, виразне запалення та деструкцію дерми. Все це призводило до сповільнення швидкості формування та дозрівання грануляційної тканини на 12й день спостереження у цих тварин порівняно з фізіологічно здоровими щурами. 1 UA 97335 U 5 10 15 20 25 Приклад 2. Морфологічне дослідження стану деяких внутрішніх органів щурів після комбінованого введення 0,125 мг/кг дексаметазону та 20 % розчину фруктози. Об'єктом дослідження стали підшлункова залоза (хвостова частина, найбільш насичена панкреатичними острівцями, розміщена у товщі шлунково-селезінкової зв'язки), печінка, серцевий м'яз та нирки щурів, яким давали 20 % розчин фруктози та вводили 0,125 мг/кг дексаметозону. Контролем слугували аналогічні органи інтактних щурів. Зразки органів фіксували у 10 % розчині формаліну, зневоднювали у спиртах зростаючої міцності, заливали у целоїдин-парафін. Зрізи фарбували гематоксиліном та еозином. На зрізах підшлункової залози підраховували загальну кількість панкреатичних острівців у препараті, численність різних за розміром острівців: великих (містили більше 60 β-клітин), середніх (містили 21-60 β-клітин) та дрібних (містили 5-20 β-клітин). Окремі зразки печінки фіксували у розчині Буена, після стандартної обробки отримані зрізи фарбували на глікоген (становили ШІК-реакцію за МакМанусом). Крім того, фіксовані у 10 % розчині формаліну зразки печінки різали на мікротомі, що заморожує, зрізи фарбували Суданом IV для виявлення нейтрального жиру [3]. Перегляд мікропрепаратів проводили під мікроскопом Granum. Мікрофотографування мікроскопічних зображень здійснено цифровою відеокамерою Granum ДСМ 310. Фотознімки обробляли на комп'ютері Pentium 2,4GHz за допомогою програми Toup View. Після введення фруктози та дексаметазону у щурів середня загальна кількість панкреатичних острівців у часточках підшлункової залози становила 24,33, при цьому, частка великих за розміром острівців зменшилася у 4,4 рази, середніх - у 1,47 рази, а частка дрібних острівців зросла у 2,67 рази (табл. 1). Серед дрібних острівців доволі багато зовсім дрібних містили всього 2-3 β-клітини. Простежена різного ступеня спустошеність ряду островків βклітинами. У великих та середніх за розміром острівцях вона носила гніздовий, а у дрібних більш дифузний характер. Крім того, деякі β-клітини гіпертрофовані. Таблиця 1 Розподіл панкреатичних острівців за розміром у підшлунковій залозі щурів. Група експерименту Інтактний контроль Контрольна патологія 30 35 40 45 50 Загальна кількість 20 24,3 Панкреатичні острівці З них великі середні 5,0 (25 %) 10,5 (53,12 %) 1,33 (5,65 %) 8,66 (35,97 %) дрібні 4,5 (21,87) 14,33 (58,38 %) В печінці тварин після введення фруктози та дексаметазону загальна гістоархітектоніка паренхіми в цілому не змінена. В той же час радіальна спрямованість тяжів гепатоцитів затушована, більшість гепатоцитів мали оптично пусту цитоплазму, яка або не фарбувалася, або дуже слабко фарбувалася еозином. Відмічено доволі виразний анізонуклеоз - варіювання ядер за розміром. При постановці ШІК-реакції знайдено значне зменшення насиченості глікогеном цитоплазми клітин, а фарбування Суданом IV виявило наявність жиру у їх цитоплазмі. Тривале комбіноване введення фруктози та дексаметазону не викликало помітних на світлооптичному рівні змін у стані міокарду та нирок щурів. Таким чином, проведене мікроскопічне дослідження показало, що введення фруктози та дексаметазону за запропонованою схемою викликає у щурів зміни у стані підшлункової залози та печінки. У підшлунковій залозі виявлені ознаки певної пригніченості інсулярного апарату. Насамперед це проявляється у появі значної кількості дрібних та зменшення великих та середніх панкреатичних острівців. Очевидно, що для досягнення нормального рівня функціонування ендокринної залози при такому стані частина β-клітин працює в посиленому режимі. Через деякий час наступає виснаження таких β-клітин і, згодом, їх загибель. Морфологічно це проявляється у гіпертрофії, дистрофії, різному ступеню спустошеності острівців. А так як сумарні можливості β-клітин знижені, то розвивається так званий діабетогенний стан [4]. У печінці після введення фруктози та дексаметазону зміни проявлялися в основному у пригніченні глікогенутворюючої функції, накопиченню жиру у клітинах печінкової паренхіми. Міокард та нирки тварин практично не зазнавали помітних на світлооптичному рівні змін. Приклад 3. 2 UA 97335 U 5 Дослідження швидкості загоєння ран у тварин з природною регенерацією та на тлі предіабету. Дослідження проводили на безпородних щурах масою 250-320 г. Тварин було розподілено на дві групи по 5 тварин в кожній: 1-а група - фізіологічно здорові тварини; 2-агрупа - тварини, яким протягом 2 тижнів вводили дексаметазон та фруктозу за запропонованою схемою. Повношарові рани відтворювали за загальноприйнятою методикою [2]. Процес загоєння оцінювали на 3, 5, 7, 9 та 12 добу за допомогою планіметричних показників, що включали в 2 себе: площу рани (S, мм ) та ступінь загоєння рани (%), який розраховували за формулою [1]: Ступінь загоєння  10 П очаткова площа рани - Пл оща рани відповідно ї доби  100 % П очаткова площа рани . Результати дослідження планіметричних показників у експериментальних групах наведені в таблиці 2. Таблиця 2 Динаміка планіметричних показників на моделі шкірних ран у щурів на тлі предіабету (n=5). Доба спостереження Показник 2 3-а доба 5-а доба 7-а доба 9-а доба 12-а доба 15 20 25 30 S, мм Ступінь загоєння, % 2 S, мм Ступінь загоєння, % 2 S, мм Ступінь загоєння, % 2 S, мм Ступінь загоєння, % 2 S, мм Ступінь загоєння, % Група досліду КП (природна регенерація) КП (на тлі предіабету) 3,06±0,057 3,31±0,154 23,5 17,25 2,622±0,04 2,988±0,09* 34,45 25,3 2,19±0,075 2,616±0,121* 45,25 34,6 1,792±0,065 1,99±0,151 55,2 50,25 1,232±0,066 1,48±0,17 69,2 63 Примітки: * - достовірно відносно природної регенерації (р0,05); n - кількість тварин у групі; КΠ - контрольна патологія Порівняння ступеня загоєння ран в групі тварин з природною регенерацією та на тлі предіабету показало, що на 3-й, 5-й, 7-й, 9-й та 12-й день експерименту в групі тварин з ускладненим перебігом ранового процесу ступінь загоєння був, відповідно, на 6,25 %; 9,15 %; 10,65 %; 4,95 % та 6,2 % менше порівняно з групою тварин без діабетогенного стану. Достовірні відхилення були зафіксовані на 5-й та 7-й день досліду (табл.1) (р0,05). Таким чином, дослідження швидкості загоєння ран впродовж усього періоду спостереження показало пригнічення репаративних процесів у групі тварин, яким вводили 0,125 мг/кг дексаметазону та 20 % фруктози порівняно з групою фізіологічно здорових тварин. Приклад 4. Дослідження біохімічних показників крові у тварин з площинними ранами на тлі предіабету порівняно з інтактною групою. Вивчення біохімічних показників показало достовірне підвищення протягом всього досліду рівнів глюкози, глікозилованого гемоглобіну, загальних ліпідів, холестерину та тригліцеридів в крові експериментальних тварин порівняно з групою інтактних тварин (табл. 3) (р