Спосіб одержання кополіестерів природних двоосновних a-амінокислот та поліетерів гліколів

Реферат: Спосіб одержання кополіестерів природних двоосновних α-амінокислот та поліетерів гліколів включає взаємодію двоосновної N-захищеної α-амінокислоти та поліетеру гліколю в присутності активатора карбоксильних груп дициклогексилкарбодііміду та каталізатора Ν,Ν'диметиламінопіридину. Попередньо до N-захищеної α-амінокислоти та поліетеру гліколю додають флуоресцеїн. Взаємодію проводять при мольному співвідношенні амінокислота:поліетер гліколь:флуоресцеїн, 1: 0,95  103 : 0,02  0,1 до одержання кополіестеру з , флуоресцентними хромофорними групами в структурі макромолекули формули: O O O O k O O O O O O NH NH R O R O n m UA 98749 U (12) UA 98749 U O де R= (CH2)p CH3 p=1-16 k=5-20 n=6-15 m=1-3 . UA 98749 U 5 10 15 20 25 30 Корисна модель належить до хімії високомолекулярних сполук, а саме одержання кополіестерів, які можуть бути використані для створення нових полімерних систем транспорту ліків з можливістю візуалізації їх накопичення в певних зонах організму. Це дозволяє проводити оцінку ефективності дії лікарських засобів та створювати нові тераностичні системи адресної доставки ліків. Відомий спосіб одержання кополіестерів природних двоосновних амінокислот та поліетерів гліколів, що включає взаємодію N-захищеної двоосновної амінокислоти та поліетеру гліколю (ПЕГ) в присутності активатора карбоксильних груп Ν,Ν-дициклогексилкарбодііміду. Властивості нових полімерів - їх біодеградабельність, не токсичність продуктів деградації та утворення у водних розчинах стійних дисперсій з частинками 50200 нм робить їх цікавими об'єктами з точки зору використання в якості мікро- та нанорозмірних полімерних носіїв для іммобілізації біологічно активних речовин та їх адресної доставки в різні клітини-мішені. (Патент на винахід № 106270 UA, МПК C08G63/12; 63/685; 77/46; 63/66; 63/668, Амфіфільні блоккополімери N-похідних природних двоосновних амінокислот та поліетерів гліколів, Варваренко С.М., Воронов А.С., Самарик В.Я., Носова Н.Г., Тарнавчик І.Т., Пузько Н., Дронь І.М., Тарас Р.С., Воронов С.Α., заявл. 24.09.2012. № а201211041, опубл. Бюл. № 15, 11.02.2014.) Але спосіб одержання кополіестерів є двостадійним, а відсутність у складі амфіфільного кополіестеру хромофорних груп не дає можливості виявляти спектральними методами зони накопичення його наночастинок в певних зонах організму, при їх використанні як засобів транспорту ліків. В основу корисної моделі поставлено задачу - створити спосіб одержання кополіестерів природних двоосновних α-амінокислот та поліетерів гліколіз, в якому використання флуоресцеїну забезпечило би утворення в одну стадію кополіестеру з ковалентно приєднаними флуоресцентними хромофорними групами, що дає можливість візуалізувати зони накопичення його наночастинок в певних зонах організму, при їх використанні як засобів транспорту ліків. Поставлена задача вирішується тим, що в способі одержання кополіестерів природних двоосновних α-амінокислот та поліетерів гліколів в присутності активатора карбоксильних груп дициклогексилкарбодііміду та каталізатора Ν,Ν'-диметиламінопіридину, згідно з корисною моделлю, до N-захищеної амінокислоти та поліетеру гліколю додають флуоресцеїн, а взаємодію проводять при мольному співвідношенні амінокислота: поліетер гліколь: , флуоресцеїн 1: 0,95  103 : 0,02  0,1 до одержання кополіестеру з флуоресцентними хромофорними групами в структурі макромолекули формули: O O O O k O O O O O O NH NH R O R O m n O де R= (CH2)p CH3 p=1-16 k=5-20 n=6-15 m=1-3 35 40 Молекула флуоресцеїну у неводному середовищі може знаходиться у таутомерних формах, які включають наявність двох гідроксильних груп, що дозволяє розглядати його як мономер при кополіконденсації з двоосновною N-захищеною амінокислотою. Включення флуоресцентної хромофорної групи у структуру макромолекули забезпечує здатність до емісії електронів у вигляді спектра випромінювання, що дає можливість контролю за локалізацією кополіестеру в тканинах організму. Ковалентне зв'язування флуоресцентної хромофорної групи з полімером унеможливлює автономну міграцію флуоресцеїну, як це може мати місце при використанні його в молекулярній формі. 1 UA 98749 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для одержання кополіестерів природних двоосновних α-амінокислот та поліетерів гліколів були використані: - N-захищені природні двоосновні амінокислоти 2-(алканоіламіно)-пентадіонові кислоти (GluR): 2-(гептадеканоїламіно)пентандіонова кислота (Glu-St), 2-(додеканоїламіно)-пентандіонова кислота (Glu-L) (Aldrich). Перед використанням їх сушили у вакуумі над фосфорним ангідридом до постійної ваги. - Поліетери гліколів ПЕГ-400, ПЕГ-600, ПЕГ-1000 і ПЕГ-1200 молярної маси 400, 600, 1000, 1200 г/моль відповідно (Aldrich). - Ν,Ν'-дициклогексилкарбодіімід (ДЦК) (Aldrich); 4-Диметиламінопіридин (ДМАП), 99 % (Alfa Aesar). Використовували без додаткового очищення. - Бензол очищали за відомими методиками [Вайсберг Α., Проскауэр Э., Риддис Д. и др. Органические растворители. - М.: Иностранная литература, 1976. - С. 285-286, 389] - Флуоресцеїн (Aldrich) Утворення кополіестерів з флуоресцентною хромофорною групою підтверджували тонкошаровою хроматографією їх структуру підтверджували 1Н ЯМР спектроскопією при застосуванні приладів Thermo Scientific Nicolet 8700 та JEOL's ECA Series Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer. Молекулярну масу визначали гель-проникною хроматографією у тетрагідрофурані з використанням модуля Waters Alliance 2690 з рефрактометром Wyatt Optilab DSP, багатокутовим лазерним фотометром Dawn (Wyatt) і колонками Waters Styragel HR 3-4. Спектральні характеристики полімеру визначали спектрофлуориметрично у воді, етанолі, октанолі та конденсованій фазі за допомогою спектрофлуориметра CM 2203. Хоча протонні спектри нових кополіестерів недостатньо інформативні внаслідок перекривання сигналів великої кількості ароматичних протонів у хромофорному фрагменті, але порівняльна оцінка загальної інтегральної інтенсивності протонів ароматичних фрагментів хромофорної групи і протонів α-СН груп 2-(алканоїламіно)пентадіонові кислоти у кополіестері дозволяє оцінити співвідношення вмісту флуоресцентної хромофорної групи і ланок амінокислоти. Мас-спектри полімеру не містять піків молекулярних іонів, а фрагментація макромолекул підтверджує їх склад. Розміри частинок дисперсної фази синтезованих кополіестерів у водних середовищах визначали на приладі Malvern autosizer 4700, поверхневий натяг визначали по методу відриву кільця (тензіометр Du Nouy). Приклади конкретного виконання Приклад 1. Одержання кополіестеру на основі 2-(гептадеканоїламіно)пентадіонової кислоти (Glu-St), поліетеру гліколю (ПЕГ-400) та флуоресцеїну при їх мольному співвідношенні як 1,00: 1,03:0,02. В реактор об'ємом 25 мл завантажували 1 ммоль N-захищеної глутамінової кислоти (Glu-St), 1,03 ммоль діолу та 0,02 ммоль флуоресцеїну, заливали 15 мл бензолу і через насадку ДінаСтарка відбирали 5 мл азеотропної суміші. Після цього реакційну масу охолоджували до 7 °C, додавали 10 мл попередньо осушеного бензолу і при перемішуванні послідовно вводили попередньо приготовлені розчини 2,1 ммоль ДЦК в 5 мл бензолу та 0,15 ммоль ДМАП в 2 мл бензолу. Після додавання всіх реагентів, температуру реакційної маси піднімали до 15 °C і утримували протягом 3-х годин, після чого прогрівали ще 3 години при 35 °C. Далі реакційну масу фільтрували від дициклогексилсечовини, яка виділилася у вигляді осаду і фільтрат упарювали. Для очистки кополіестеру від залишків мономерів, каталізатора та непрореагованого ДЦК, готували його 10 % розчини у бензолі, тричі промивали 15 %-ним розчином NaCl у 0,1Ν НСl, потім 15 %-ним розчином NaCl у воді до нейтрального рН, сушили над сульфатом магнію, фільтрували і упарювали. Отримали кополіестер у вигляді аморфної речовини світло-жовтого кольору в кількості 0,67 гр., що складає 82 % від розрахункового. Відсутність у продукті неприщепленого флуоресцеїну підтверджували тонкошаровою хроматографією (Пластинки ALUGRAM® SIL G/UV254, елюент - суміш хлороформу та ацетону у співвідношенні 1 до 3 по об'єму, Rf кополіест=0,415, a Rf флуоресцеїну = 0,566). Молекулярна маса (середньо-чисельна) кополіестеру становила 12300. У спектрах флуоресценції спостерігали максимум випромінювання при λмакс=524 нм (для флуоресцеїну λмакс=512 нм). Одержаний кополіестер понижує поверхневий натяг води до 37 мН/м, на ізотермах поверхневого натягу у воді спостерігається два перегини: перший - при критичній концентрації міцелоутворення ККМ1=0,016 % та другий перегин при перебудові унітарних міцел у більш складні надмолекулярні міцелярні структури ККМ2=0,21 %. Водні розчини кополіестеру є самостабілізованими дисперсіями кополіестеру з гідродинамічним діаметром частинок 120-350 нм (за даними Malvern autosizer 4700). Дані про умови одержання та характеристики отриманих поліестерів наведено в таблиці. 2 UA 98749 U 5 Приклад 2-4. Одержання кополіестерів на основі 2-(гептадеканоїламіно)пентадіонової кислоти (Glu-St), поліетерів гліколів (ПЕГ-600, ПЕГ-1000, ПЕГ-1200) та флуоресцеїну здійснювали аналогічно. Співвідношення мономерів та характеристики одержаних кополіестерів наведені в таблиці. Приклад 5. Одержання кополіестерів на основі 2-(додеканоїламіно)-пентадіонової кислоти (Glu-L), поліетеру гліколю (ПЕГ-600) та флуоресцеїну здійснюються аналогічно. Співвідношення мономерів та характеристики одержаних кополіестерів наведені в таблиці. Таблиця Умови одержання та характеристики отриманих кополіестерів Співвідношення мономерів, мольні ЧасАмінотка № кисамінолота кислоти 1 Glu-St 2 Glu-St 1 1 3 Glu-St 1 4 Glu-St 5 Glu-L 1 1 ПЕГ PEG400 PEG600 PEG 1000 PEG1200 PEG600 ЧастМолеЧас- ка Ви- кулятка флуохід % рна ПЕГ ресмаса цеїну Вміст флуоресцентної хромофорної групи, % мольн. Максимум випромінювання в 1-октаККМ1 % ККМ2 % нолі*, λмакс, нм, (збудження λ=360 нм) 529 0,016 0,21 528 0,014 0,16 Максимальне пониження поверхневого натягу, Мн/м 1,00 1,03 0,05 0,02 82 81 12300 9500 1,2 1,0 37 39 1,03 0,02 75 7200 0,7 530 0,009 0,11 40 1,01 0.95 0.04 0.1 74 80 4800 10500 0,5 0.98 530 528 0,01 0,008 0,22 0,10 52 42 *- максимум поглинання флуоресцеїну в 1-октанолі складає λмакс=517 нм 10 15 Одержані кополіестери завдяки чергуванню у макромолекулі ліпофільних і гідрофільних блоків проявляють себе як поверхнево-активні речовини - понижають поверхневий натяг на межі вода-повітря та солюбілізують нерозчинні в воді речовини і завдяки здатності до флуоресценції можуть бути використані для створення нових тераностичних систем адресної доставки та візуалізації ліків. Дані про умови одержання та характеристики отриманих поліестерів наведено в таблиці. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб одержання кополіестерів природних двоосновних α-амінокислот та поліетерів гліколів, що включає взаємодію двоосновної N-захищеної α-амінокислоти та поліетеру гліколю в присутності активатора карбоксильних груп дициклогексилкарбодііміду та каталізатора Ν,Ν'диметиламінопіридину, який відрізняється тим, що попередньо до N-захищеної α-амінокислоти та поліетеру гліколю додають флуоресцеїн, а взаємодію проводять при мольному співвідношенні амінокислота:поліетер гліколь:флуоресцеїн, 1: 0,95  103 : 0,02  0,1 до одержання , кополіестеру з флуоресцентними хромофорними групами в структурі макромолекули формули: 3 UA 98749 U O O O O O O O O k O O NH NH R O R O m n O де R= (CH2)p CH3 p=1-16 k=5-20 n=6-15 m=1-3 . Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4