Спосіб одержання кополіестеретерів двоосновних природних a-амінокислот

Реферат: Спосіб одержання кополіестеретерів двоосновних природних -амінокислот включає взаємодію двоосновної N-захищеної амінокислоти та поліетердіолу-поліоксіетилену (ПЕГ) з утворенням діестеру та його кополіконденсацію з утворенням кополіестеретеру та наступним видаленням захисних груп трифлуороцтовою кислотою в метилені хлористому. Як N-захищену амінокислоту використовують 2-[(трет-бутоксикарбоніл)аміно]пентандіонову кислоту (Glu(Boc)), взаємодію проводять при мольному співвідношенні Glu(Boc):ПЕГ не менше як 1:2,2, та отримують діестер. Кополіконденсують його за реакцією Стегліха з 2-(алканоїламіно)пентандіоновою кислотою (Glu-R) з одержанням кополіестеретеру. UA 87934 U (12) UA 87934 U UA 87934 U 5 10 15 20 25 30 35 Корисна модель належить до галузі хімії високомолекулярних сполук, а саме до способу одержання кополіестеретерів альтернатної будови з ліпофільними та гідрофільними фрагментами, що забезпечує їх амфіфільність, які відрізняються наявністю первинних аміногруп. Завдяки використанню похідних природних двоосновних α-амінокислот глутамінової/аспарагінової та поліетердіолів оксіетиленового ряду, як мономерних ланок для синтезу, отримані кополіестеретери є біосумісними і біодеградабельними. Такі полімери можуть бути використані при створенні нових типів засобів для інженерії тканин, а також для створення нових полімерних систем транспорту ліків з можливістю ковалентного приєднання по первинній аміногрупі молекул спейсорів, маркерів та діючої речовини ліків. Відомий спосіб [Won C.Y. Novel biodegradable copolymers containing pendant amine functional groups based on aspartic acid and poly(ethyleneglycol) / C.Y. Won, C.C. Chu, J.D. Lee // Polymer.1998. - №39(25). - P.6677-6681.] одержання кополіестеретерів природних двоосновних аамінокислот та поліетердіолів (ПЕГ). На першій стадії проводили поліконденсацію ангідриду Nкарбоксибензил-захищеної аспарагінової кислоти з ПЕГ при 403 К в присутності nтолуолсульфокислоти, як каталізатора. При цьому отримували низькомолекулярні кополіестеретери. Поліконденсацією в розплаві цих низькомолекулярних кополіестеретерів при 433 К в присутності тетраїзопропоксититану, як каталізатора, отримували високомолекулярні кополіестеретери і після видалення захисної групи каталітичним гідрогенолізом на паладієвому каталізаторі отримували кополіестеретери з первинною аміногрупою. До недоліків способу можна віднести проведення синтезу при високій температурі, що не дає можливості використовувати складні мономери з естерним зв'язком у структурі молекули через можливість конкуруючого протікання реакцій неконтрольованої переестерифікації. Крім того, за цим способом нема можливості регулювати колоїдно-хімічні властивості отриманих кополіестеретерів, оскільки вони не містять фрагментів ліпофільної природи - після видалення захисної групи, отриманий кополіестеретер є водорозчинним і не має амфіфільних властивостей. Найбільш близьким до запропонованого є спосіб одержання кополіестеретерів двоосновних природних α-амінокислот, що включає взаємодію двоосновної N-захищеної амінокислоти та поліетердіолу-поліоксіетилену (ПЕГ) з утворенням діестеру та його кополіконденсацію з утворенням кополіестеретеру та наступним видаленням захисних груп трифлуороцтовою кислотою в метилені хлористому. Отриманий кополіестер з первинними аміногрупами був випробуваний для зв'язування ДНК та доставки генів [Caracciolo P. C. Novel bioresorbable cationic polyester for gene delivery / P. С Caracciolo, F. Parra, G.A. Abraham [et. al.] // IX Simposio Argentino de Polimeros (SAP'2011), 15-18 denoviembre, 2011. Abstract Book.-2011.-P. 63.]. Але за цим способом взаємодією N-захищеної піроглутамінової кислоти з поліетердіолом при мольному співвідношенні кислота:ПЕГ як 2:0,8, отримували діестер, який містить два фрагменти N-захищеної глутамінової кислоти (Glu(Boc)), що визначає кінцеві карбоксильні групи діестеру формули: O O HO (CH2) O O O k n NH O O CH3 (CH2) O OH k NH O O CH3 CH3 CH3 CH3 40 45 CH3 , де k=2, n=4. Кополіконденсацією діестеру як комономер з поліетердіолом - (ПЕГ200) та після видалення Вос-захисної групи отримували кополіестеретер, який містить первинну аміногрупу, але є водорозчинним і не має амфіфільних властивостей. Крім того, невисокі виходи кополіестеретеру, низька молярна маса та складна очистка не дозволяє за цим способом конструювати кополіестеретери складної архітектури з заданими властивостями. В основу корисної моделі поставлена задача - створити спосіб одержання кополіестеретерів двоосновних природних α-амінокислот, в якому використання нової двоосновної N-захищеної амінокислоти з поліетердіолом (ПЕГ), що забезпечив би утворення діестеру з кінцевими 1 UA 87934 U гідроксильними групами та його кополіконденсацію за новим механізмом з одержанням кополіестеретеру формули O O (CH2) O HN O O k n O (CH2) O H2N n k O O R m , де k=1 або 2; n=2-25, C R= (CH2) j CH3 , O j=1-16, 5 10 15 з первинними аміногрупами та заданою альтернантною структурою складної будови і визначеними колоїдно-хімічними властивостями. Поставлена задача вирішується тим, що у способі одержання кополіестеретерів двоосновних природних α-амінокислот, що включає взаємодію двоосновної N-захищеної амінокислоти та поліетердіолу -поліоксіетилену (ПЕГ) з утворенням діестеру та його кополіконденсацію з утворенням кополіестеретеру та наступним видаленням захисних груп трифлуороцтовою кислотою в метилені хлористому, згідно з корисною моделлю, як N-захищену амінокислоту використовують 2-[(трет-бутоксикарбоніл)аміно]пентандіонову кислоту Glu(Boc), взаємодію проводять при мольному співвідношенні Glu(Вос):ПЕГ не менше як 1:2,2, діестер отримують з кінцевими гідроксильними групами формули O H O O O (CH2) n k O O n CH3 NH O O H CH3 , CH3 де k=1 або 2; n=2-25, (1) і кополіконденсують його за реакцією Стегліха з 2-(алканоїламіно)пентандіоновою кислотою (Glu-R) з одержанням кополіестеретеру 20 O O (CH2) O HN O O k O n (CH2) O H2N R k n O O , m де k=1 або 2; n=2-25, R= C (CH2) j CH3 , O j=1-16 , (2) 2 UA 87934 U 5 10 15 20 25 30 35 з первинними аміногрупами. Такий спосіб при мольному співвідношенні комономерів, близький до еквімольного (GluR:діестер=1:1,05), забезпечує отримання кополіестеретерів альтернантної будови, в яких кожна елементарна ланка складається з фрагменту N-захищеної амінокислоти Glu(Boc), у якому після видалення захисної групи утворюється первинна аміногрупа, фрагменту Nалканоїлзахищеної двоосновної α-амінокислоти GluR (кількість атомів вуглецю у алкільному фрагменті R=248) з ліпофільними властивостями і гідрофільного фрагменту поліетердіолу (ПЕГ). Наявність у структурі макромолекули гідрофільних та ліпофільних фрагментів, що чергуються забезпечує амфіфільні властивості синтезованих кополіестеретерів та дозволяє зміною молярної ваги поліетердіолу та величиною алкільного замісника у ліпофільному комономері регулювати їх колоїдно-хімічні властивості. Лабільний естерний з'язок, що зв'язує фрагменти у кополіестеретері забезпечує його здатність до біодеградації, а аміногрупа дозволяє ковалентне приєднання молекул спейсорів, діючої лікарської речовини, фрагментів специфічної взаємодії для створення нових систем транспорту лікарських препаратів в живому організмі, а також в інженерії тканин. Для одержання кополіестеретерів природних двоосновних α-амінокислот були використані: N-захищені природні двоосновні амінокислоти 2-[(третбутокси-карбоніл)аміно]пентандіонова кислота (Glu-Boc) (Aldrich); 2-(алканоїламіно)пентадіонові кислоти (Glu-R), такі як 2(гептадеканоїл-аміно)пентандіонова кислота (Glu-St), 2-(додеканоїламіно)пентандіонова кислота (Glu-L) (Aldrich). Перед використанням сушили у вакуумі над фосфорним ангідридом до постійної ваги. Трифлуороцтова кислота (TFA) (Aldrich). Використовували без додаткового очищення. Поліетердіоли (ПЕГ) молярної ваги 100, 600, 1000 г/моль (Aldrich). Для очищення від домішок води до відповідного поліетердіолу (ПЕГ) додавали бензол та відганяли азеотропну суміш бензол-вода. Залишки бензолу видаляли у вакуумі до постійної ваги. N, N'-дициклогексилкарбодіімід (ДЦК) (Aldrich); 4-Диметиламінопіридин (ДМАП), 99 % (Alfa Aesar). Використовували без додаткового очищення. Метилен хлористий, бензол очищали за відомими методиками [Вайсберг А., Проскауэр Э., Риддис Д. и др. Органические растворители. - М.: Иностранная литература.-1976. -с. 285-286, 389] Структуру отриманих мономерів та полімерів підтверджували ПМР спектроскопією. Молекулярну масу визначали гельпроникною хроматографією (GPC). Кількість первинних аміногруп визначали потенціометричним титруванням. Суть корисної моделі пояснюється прикладами. Приклад 1. Синтез діестеру 2-[(трет-бутоксикарбоніл)аміно]-пентандіонової кислоти (GluBoc) та діетиленгліколю (ПЕГ-100) (ПЕГ-100-Glu-Boc-ПЕГ-100) проводили згідно з загальною реакцією O O O (CH2) HO k CH3 H3C O OH + 2 HO NH O H n O 2DCC DMAP H - 2DCU O (CH2) O CH3 n H3C O H3C H3C k O O O H n NH O , де n=2-25, k=1 або 2. 40 45 50 У двогорлий реактор об'ємом 250 мл, обладнаний крапельною лійкою та насадкою ДінаСтарка зі зворотним холодильником, вносили 0,06 моль (15,1 г) 99,5 % GluBoc, 0,3 моль (31,8г) ПЕГ-100 і 70мл метилену хлористого. Реакційну суміш нагрівали до 318 К і через насадку ДінаСтарка відбирали 30 мл азеотропної суміші для видалення води. Після охолодження до 278-280 К при перемішуванні повільно прикапували розчин дициклогексилкарбодііміду 0,13 моль (27 г) в 25 мл метилену хлористого та розчин 4-диметиламінопіридину 0,02 моль (2,44 г) в 15 мл метилену хлористого. Реакційну суміш перемішували при температурі 288 К протягом 2-3 год., піднімали температуру до 308 К і витримували ще 3 години. По завершенні, реакційну масу фільтрували, а фільтрат упарювали. Висушений неочищений продукт розчиняли в 150-200 мл бензолу і промивали 5 разів по 30-40 мл насиченим розчином NaCl, підкисленим хлороводневою кислотою до рН 2,5-3. Промитий від непрореагованого ПЕГ-100 бензольний розчин упарювали до об'єму 100 мл. Діестер з бензольного розчину екстрагували водою 5-6 разів об'ємом по 100 мл. Водні витяжки об'єднували і упарювали при 313 К. Сухий залишок 3 UA 87934 U 5 10 розчиняли в ацетоні, фільтрували від залишків солей і фільтрат упарювали. Отримували діестер ПЕГ-100 2-[(трет-бутоксикарбоніл)аміно] пентандіонової кислоти (ПЕГ-100-Glu-Boc-ПЕГ100) формули (1) при n=2 в кількості 22,6 г. Вихід 88 %. Приклад 2. Здійснювали аналогічно прикладу 1, але як діол використовували поліетердіол з молярною масою 600 г/моль (ПЕГ-600). Отримували діестер ПЕГ-600 в кількості 73,7 г 2-[(третбутоксикарбоніл)аміно]пентандіонової кислоти ПЕГ-600-Glu-Вос-ПЕГ-600 формули (1) при n=1314. Вихід 85 %. Приклад 3. Здійснювали аналогічно прикладу 1, але як діол використовували поліетердіол з молярною масою 1000 г/моль (ПЕГ-1000). Отримали 110,4 г діестеру ПЕГ-1000 2-[(третбутоксикарбоніл)-аміно]пентандіонової кислоти ПЕГ-1000-Glu-Boc-ПЕГ-1000 формули (1) при п=22-23. Вихід 82 %. Структуру отриманого діестеру підтверджували Н-ЯМР спектроскопією: O O J I HO CH2 G O CH2 C CH2 B CH2 D C CH n G C O CH2 CH2 OH n NH E J I E O C O C H3C A CH3 CH3 CH2 Таблиця 1 Віднесення сигналів протонів Н1-NMR-спектру в дейтероацетоні діестеру 2-[(трет-бутоксикарбоніл)аміно]пентандіонової кислоти та ПЕГ 100 А 1,41 с Фрагмент мономеру O C (H3C)3 8,96 9 Glu 1,00 1 Glu 2,02 2 Glu, Glu HC NH C к-сть протонів у фрагменті Воc Віднесення Інтеграл 2,01 2 PEG, PEG Позн. Зсув Тип 3,98 4 PEG PEG PEG 84,23 3,88 2,11 88 4 2 O CH2 В 4,6 С 1,92,0 CH NH м O C шм 2,42 G 4,24,3 м м ш O CH2 CH O C NH CH2 O C O м 3,65 3.2 3.5 CH2 CH NH CH2 C м D O O O O C Е І J O O CH2 CH2 C O O CH2 O (CH2 CH2)n O CH2 O (CH2 CH2)n O CH2 CH2 OH O (CH2 CH2)n O CH2 CH2 OH 4 UA 87934 U Продовження таблиці 1 CH2 6,36,5 К 5 CH NH ш O C O Glu 1 Хороше узгодження між кількостями протонів, що відповідають формулі (1) та визначеними інтегралами їх сигналів у спектрі підтверджує структуру отриманого продукту. Приклад 4. Синтез кополіестеретеру здійснювали кополіконденсацією синтезованого діестеру (приклад 1) ПЕГ-ЮО-Оіи-Вос-ПЕГ-ЮО (гідрофільний фрагмент) та 2-(гептадеканоїламіно)пентадіоновою кислотою (Glu-St) (ліпофільний фрагмент) як мономерів згідно з наступною загальною реакцією: O O H O O (CH2) n O O k + H O n NH O H3C CH2 HO O DCC, DMAP CH3 O OH NH -DCU R1 CH3 O O O O O (CH2) n O k NH O O O NH R1 O H3C O CH2 n , m CH3 CH3 де k=1 або 2; n=2-25, C (CH2) CH3 , R1= j O j=1-16. 10 15 20 В двогорлий реактор об'ємом 50 мл, обладнаний крапельною лійкою та зворотним холодильником з хлоркальцієвою трубкою, вносили 0,005 моль (2,068 г) Glu-St та 0,0055 моль діестеру діетиленгліколю 2-[(трет-бутоксикарбоніл)аміно]пентандіонової кислоти ПЕГ-100-GluBoc-ПЕГ-100 формули 1 при n=2 (2,32 г) і 15 мл метилену хлористого. Реакційну масу охолоджували до 278-280 К і в реактор повільно протягом 45 хв прикапували розчин дициклогексилкарбодііміду 0,0055 моль (1,13 г) в 5 мл метилену хлористого та розчин 4диметиламінопіридину 5,5-10"4 моль (0,067 г) в 1 мл метилену хлористого. Реакційну суміш витримували при 288 К протягом 3 год., потім 3 години при 308 К. Реакційну масу охолоджували і фільтрували, а фільтрат упарювали. Для очищення висушений залишок розчиняли в бензолі, створюючи  10 %-й розчин і промивали насиченим розчином NaCl. Після упарювання бензолу та сушіння над фосфорним ангідридом у вакуумі отримували 3,35 г кополіестеретеру формули (3). Вихід 76,3 %. 5 UA 87934 U O O C O O O O O C C O O O HN O NH C O (CH2) CH3 CH3 O O C CH3 m CH3 5 (3) Для видалення третбутилоксикарбонільної (Вос-) захисної групи зі складу полімеру 2 г сухого поліестеретеру розчиняли у 10 мл 50 %-го розчину трифлуороцтової кислоти в метилені хлористому. Розчин перемішували протягом 2 год. і упарювали розчинник у вакуумі. Висушений поліестеретер розчиняли в метилені хлористому і осаджували в гексан. Переосадження повторювали двічі. Продукт сушили до постійної ваги і отримували кополіестеретер з первинною аміногрупою у вигляді солі трифлуороцтової кислоти - [ПЕГ-100-Glu-NH2+(TFA-)ПЕГ-100-Glu-St]m. Одержували 1,72 г кополіестеретеру формули (4). Вихід 85 %. 10 O O C CH2 CH2 CH C O ( CH2 CH2 NH C H2 C O O C O O) n CH2 CH2 C CH O + F CH2 CH2 O) n NH3 O F O ( CH2 m O F CH3 15 20 25 (4) Приклад 5. Здійснювали аналогічно прикладу 4, але як діол використовували діестер на основі поліетердіолу ПЕГ-600 та 2-[(трет-бутоксикарбоніл)аміно]пентандіонової кислоти ПЕГ600-FluВос-ПЕГ600 формули (4 при n=12-13). Отримували 8,3 г кополіестеретеру. Вихід 70 %. Приклад 6. Здійснювали аналогічно прикладу 4, але як діол використовували діестерну основу поліетердіолу ПЕГ-1000 та 2-[(трет-бутоксикарбоніл)аміно] пентандіонової кислоти ПЕГ1000Glu-Boc-ПЕГ1000 формули (4 при n=22-23), а як дикислоти 2-[додеканоїламіно]-пентандіонову. Отримували 9,51 г кополіестеретеру. Вихід 68 %. Для вивільнення аміногрупи з її сольової форми (приклади 4-6) кополіестеретер розчиняли в хлороформі насичували осушеним аміаком і після відділення аміачної солі трифлуороцтової кислоти фільтруванням, упарення фільтрату та сушіння у вакуумі до постійної маси практично кількісно одержували кополіестеретери з первинною аміногрупою. O O G E J O C CH2 CH2 CH C K NH D H2C C O O ( CH2 CH2 O) G E J CH2 CH2 CH H (I) O C H (I) C K1 n NH2 O ( CH2 CH2 O ) n O m CH2 F B CH3 A (5) 6 UA 87934 U Таблиця 2 Віднесення сигналів протонів H1-NMR-спектра в дейтероацетоні кополіестеретеру 2[додеканоїламіно]пентандіонової кислоти (GluL) та ПЕГ1000 з первинною аміногрупою, елементарна ланка якого відповідає формулі (5) Віднесення Зсув Тип А 0,87 т H3C CH2 CH2 Lauroyl 1,00 3 В 1,24 м H3C (CH2)8 CH2 Lauroyl 5,3 16 С 1,41 с Boc 0,2 0 Lauroyl 0.70 2 Glu, Glu 1,41 4 Lauroyl 0.68 2 Glu, Glu 1.40 4 PEG 31,8 96 PEG 2,69 8 Glu 0,69 2 (H3C)3C O Фрагмент Інтеграл Кількісткість протонів у фрагменті Позн. N H C O D 1,61 м (CH2)7 CH2 CH2 NH C O O Е 1,9-2,0 C шм O (CH2)7 F 2,20 CH2 O C O C CH2 CH2 м CH NH CH2 NH O O G 2,42 м Н 3,65 м C 4,2-4,3 CH2 O CH2 O І CH O CH2 (CH2 C NH CH2 O CH2)n CH2 O O O CH2 C м O CH2 J 4,6 CH2 К 6,5-6,8 6,8-7,0 ш O O CH C NH ш CH2 К1 C NH м CH O CH C O + NH3 7 1 Glu O Glu 1 O UA 87934 U Таблиця 3 Характеристики поліестеретерів, отриманих у прикладах 4-6 № Прикладу 5 6 5 Вміст аміногруп % -OH 2,2 12050 78 -OH 0,89 10500 22 -OH 0,6 7500 12 [ПЕГ-100-Glu-NH2-ПЕГ-100Glu-St]m [ПЕГ-600-Glu-NH2-ПЕГ-600Glu-St]m [ПЕГ-1000-Glu-NH2-ПЕГ1000-Glu-L]m 4 Молярна маса Ступінь поліестеретеру поліконденсації (GPC), г/моль Кінцеві групи Поліестеретер (ф-ла 5) Вміст аміногруп встановлений потенціометричним титруванням становить від 2,2 % у кополіестеретері, отриманому в прикладі 4 до 0,6 % у поліестеретері, отриманому у прикладі 6, що добре узгоджується з їх вмістом у кожній елементарній ланці кополіестеретеру формула (2). ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 Спосіб одержання кополіестеретерів двоосновних природних -амінокислот, що включає взаємодію двоосновної N-захищеної амінокислоти та поліетердіолу-поліоксіетилену (ПЕГ) з утворенням діестеру та його кополіконденсацію з утворенням кополіестеретеру та наступним видаленням захисних труп трифлуороцтовою кислотою в метилені хлористому, який відрізняється тим, що як N-захищену амінокислоту використовують 2-[(третбутоксикарбоніл)аміно]пентандіонову кислоту (Glu(Boc)), взаємодію проводять при мольному співвідношенні Glu(Boc):ПЕГ не менше як 1:2,2, діестер отримують з кінцевими гідроксильними групами формули O H O O O (CH2) n k O O n CH3 NH O H CH3 O , CH3 де k=1 або 2; n=2-25, і кополіконденсують його за реакцією Стегліха з 2-(алканоїламіно)пентандіоновою кислотою (Glu-R) з одержанням кополіестеретеру O O (CH2) O HN O O k O n (CH2) O H2N k n O O R m , де k=1 або 2; n=2-25, R= C (CH2) j CH3 , O 20 j=1-16, з первинними аміногрупами. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 8