Спосіб кількісного визначення біотину

Реферат: Спосіб кількісного визначення біотину включає підготовку проби досліджуваного зразка шляхом додавання надлишку окисника в присутності кислоти, з подальшим відновленням на ртутному мікроелектроді розчину утвореного похідного біотину. Як окисник використовують калій гідрогенпероксомоносульфат в присутності 0,25 моль/л розчину фосфатної кислоти, а полярографування утвореного продукту здійснюють одразу після додавання окисника без попереднього руйнування його залишку. UA 98814 U (54) СПОСІБ КІЛЬКІСНОГО ВИЗНАЧЕННЯ БІОТИНУ UA 98814 U UA 98814 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до аналітичної та фармацевтичної хімії, а саме способу кількісного визначення d(+)-Біотину (або Вітаміну Н, гексагідро-2-1Н-тієно[3,4-d]-імідазол-4пентанової кислоти, в подальшому біотин) методом полярографії, і може бути використана у практиці центральних заводських лабораторій хімічних та фармацевтичних підприємств, лабораторій з контролю якості лікарських засобів, хіміко-токсикологічних лабораторій та аптечних установ. Як відомо, біотин є полярографічно неактивною сполукою. Тому всі відомі способи полярографічного визначення біотину є непрямим - ґрунтуються на визначенні електрохімічної активності реагентів з якими взаємодіє біотин або зводяться до визначення добутих наперед його електрохімічно активних похідних. Відомий спосіб кількісного визначення біотину на фоні 0,1 моль/л розчину калій хлориду за каталітичною хвилею виділення водню у далекій катодній ділянці обумовленою дисоціацією карбоксильної групи (потенціал півхвилі на фоні 0,1 моль/л розчину калій хлориду Е1/2 = - 1,65 В (відносно насиченого каломельного електроду (НКЕ)). Висоти хвиль пропорційні концентрації . -3 біотину в інтервалі (2-20) 10 моль/л [Щевятнин В.А., Солунина И.А., Михно С.Д. Применение полярографического метода для анализа биотина и некоторых полупродуктов его синтеза // Химико-фармацевт. журнал.-1972. - Т. 6, № 8. - С. 35-38.]. Проте цей спосіб не вибірковий, оскільки хвилі виділення водню є нехарактерними для біотину. Крім того, вони відносно погано відтворюються, що обумовлює низьку чутливість та точність (ненадійність) способу. Найбільш близьким аналогом є спосіб кількісного визначення біотину в розчинах методом полярографії, заснованим на попередньому добуванні за допомогою калій нітриту в присутності сульфатної кислоти нітрозопохідного біотину, руйнуванні надлишку нітрозуючого реагенту додаванням натрій ацетату та наступному відновленні утвореного нітрозопохідного біотину на ртутному мікроелектроді на фоні 0,5 моль/л розчину натрій ацетату, потенціал півхвилі Е1/2 = 0,83 В (відносно НКЕ) [Davidek Jiri. Polzrographische Bestimmung von Biotin/ Die Naturwissenschaffen. - 1961. - Jg. 48, № 10. - S. 403.]. Спосіб дозволяє здійснювати визначення . -5 біотину в розчинах, починаючи від концентрації 1 10 моль/л з відносною помилкою 3-4 %. Однак, він трудомісткий внаслідок довготривалого одержання нітрозопохідного біотину та необхідності руйнування залишку нітрозуючого реагенту, тому час, необхідний для здійснення аналізу однієї проби, становить не менше 40-45 хв, що робить спосіб непридатним для рутинних аналізів. В основу корисної моделі поставлено задачу створення простого та експресного способу полярографічного визначення біотину з використанням калій гідрогенпероксомоносульфату як окисника в умовах оптимального рН середовища. Поставлена задача вирішується таким чином, що у способі кількісного визначення біотину, що включає підготовку проби досліджуваного зразка шляхом додавання окисника в присутності кислоти з подальшим полярографуванням розчину утвореного деривату, згідно з корисною моделлю, як окисник використовують калій гідрогенпероксомоносульфат в кількості 1 до 1,11,5-разового молярного співвідношення до 1 моль біотину (10-50 % молярного надлишку) по відношенню до аналіту в присутності 0,25 моль/л розчину фосфатної кислоти для створення необхідного рН середовища в межах 1,4-1,5, а полярографування здійснюють одразу після додавання окисника без попереднього руйнування його залишку за кімнатної температури, потенціал півхвилі Е1/2 = - 1,05….-1,1 В (НКЕ). Експериментально встановлено, що оптимальним для кількісного оксидування біотину калій гідрогенпероксомоносульфатом у відповідний сульфоксид є рН 1,4-1,5. Час кількісного виходу продукту - сульфоксиду біотину - практично миттєвий (час спостереження 1 хв). У межах від 1,1 до 1,5 молярного співвідношення до 1 моль біотину (10-50 % молярного надлишку) калій гідрогенпероксомоносульфату полярографічні характеристики відновлення сульфоксиду біотину не змінюються впродовж 30 хв. Однак, бажано, щоб концентрація калій -4 гідрогенпероксомоносульфату у розчині не перевищувала 10 моль/л, оскільки через відновлення KHSO5 (анодна ділянка полярограми) збільшується залишковий струм і дещо спотворюється фонова лінія полярограми (її катодна ділянка). На полярограмі хвиля відновлення сульфоксиду біотину зі збільшенням рН зміщується у катодну ділянку і при рН>3 хвиля повністю зливається з такою відновлення фонового електроліту. Процес відновлення в умовах полярографування повністю необоротний: на анодній гілці полярограми взагалі відсутня хвиля. При рН 1,4 (розчин 0,25 моль/л фосфатної кислоти) на полярограмі пік простежувався при - 1,05……-1,1 (відносно НКЕ.) залежно від концентрації деполяризатора і був найвищим. За умов достатньо великого надлишку окисника (100 %) впродовж 7-10 хв у нейтральному або лужному середовищі (рН 7) спостерігається подальше окиснення утвореного сульфоксиду 1 UA 98814 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 біотину до відповідного сульфонового похідного, який за умов полярографування в кислому середовищі (рН 1,4) є електрохімічно інертним (відсутність хвилі). Сукупність ознак заявленого способу є новою, невідомою з джерел інформації. Заявлений спосіб дозволяє швидко та просто визначати біотин, а відтак скоротити час виконання аналізу, принаймні у 2-3 рази (час здійснення аналізу становить 15-20 хв проти 40-45 хв у аалозі). Спосіб здійснюють таким чином. Готують розчин проби досліджуваного зразка біотину шляхом розчинення точної наважки у етанолі, до якої додають 2,5 моль/л розчин фосфатної . -3 кислоти та 2 10 моль/л розчину калій гідрогенпероксомоносульфату (виходячи з 10-50 % молярного надлишку) і доводили об'єм до 25 мл двічі дистильованою водою і переносили в електролізер, видаляли кисень впродовж 10 хв та полярографували від - 0,5 до - 1,5 В (НКЕ). Вимірювали граничне значення величини дифузійного струму отриманої хвилі (Е1/2 = - 1,05….1,1 В (НКЕ). Вміст біотину розраховують за наперед отриманим градуювальним графіком. Побудова градуювалъного графіка. У мірні колби на 25 мл послідовно вносять від 0,25 мл до . -3 1,25 мл 2,0 10 моль/л (25,0 мг/50 мл) розчину РСЗ біотину, додають у кожну по 2,5 мл 2,5 М . -3 фосфатної кислоти та 1,15 мл 2 10 моль/л розчину калій гідрогенпероксомоносульфату. Доводять до позначки двічі дистильованою водою, переносять в електролізер, видаляють кисень впродовж 10 хв та полярографують. За даними граничних значень величин дифузійного струму будують концентраційну залежність Iгр, у мкА, від с, моль/л та методом найменших квадратів знаходять рівняння лінії Тренда (Iгр =bс + а). Невідому концентрацію біотину в аналізованому розчині, у моль/л, знаходять за формулою: Iгр.  a c . b Корисна модель ілюструється прикладами. Приклад 1. Визначення біотину у спиртовому розчині або водному розчині питної соди 0,001 моль/л невідомої концентрації. У мірну колбу на 25 мл вносять 1,00 мл випробуваного розчину біотину невідомої . -3 концентрації*, додають 2,5 мл 2,5 М фосфатної кислоти і 1,15 мл 2 10 моль/л розчину калій гідрогенпероксомоносульфату, доводять до позначки двічі дистильованою водою, переносять в електролізер, видаляють кисень впродовж 10 хв та полярографують від - 0,5 до - 1,5 В (НКЕ). Вимірюють граничне значення величини дифузійного струму отриманої полярографічної хвилі (Е1/2 = -1,05….-1,1 В (НКЕ). Вміст біотину розраховують за наперед отриманим градуювальним графіком. * Примітка. Виготовлення модельного розчину біотину (0,50 мг/мл). Наважку субстанції біотину, яка містила 0,0500 г основної речовини розчиняли у 100 мл етанолу або 0,001 моль/л водному розчині питної соди при 20 С. Побудова градуювального графіка. У мірні колби на 25 мл послідовно вносять 0,25 мл, 0,50 . -3 мл, 0,75 мл, 1,00 мл та 1,25 мл 2,0 10 моль/л (25,0 мг/50 мл) розчину РСЗ біотину, додають у . -3 кожну по 2,5 мл 2,5 моль/л фосфатної кислоти та 1,15 мл 2 10 моль/л розчину калій гідрогенпероксомоносульфату. Доводять до позначки двічі дистильованою водою, переносять в електролізер, видаляють кисень впродовж 10 хв та полярографують. За даними граничних значень величин дифузійного струму будують концентраційну залежність I гр у мкА від с, моль/л та методом найменших квадратів знаходять рівняння лінії Тренда (I гр = bс + а). І = 4 (1,15±0,195)х10 с + (0,63±0,13). Невідому концентрацію біотину в аналізованому розчині, у моль/л кінцевого об'єму, знаходять за формулою: Iгр.  a cк  . b Результати кількісного визначення біотину у модельних розчинах наведені в таблиці 1. 2 UA 98814 U Таблиця 1 І Результати визначення біотину у модельних розчинах (n=5, Р = 0,95) Концентрація біотину у кінцевому об'ємі с, 10 (моль/л) 6,14* 8,19** -5 Знайдено ( x  x  10 5 ) 6,17±0,26 8,13±0,28 % ± RSD  (%) 102,7±3,4 101,6±2,7 0,49 1,65 Примітки. *Вміст визначено за стандартною методикою [Бр. Ф 2009] (μ).   ( x  )  100 % /  ; ** аналізували модельний розчин біотину, виготовлений на 0,001 моль/л розчині питної соди. 5 10 15 20 25 30 Приклад 2. Спосіб кількісного визначення біотину у таблетках по 5 мг Волвіт® (Kusum Healthcare Pvt. Ltd, India). Робочий дослід здійснюють таким чином. Наважку порошку, розтертих 5 таблеток розчиняють у 50 мл етанолу, фільтрують на фільтрі з синьою стрічкою. Відбирають 1,00 мл розчину у мірну колбу на 25 мл, додають 2,5 мл 2,5 М . -3 фосфатної кислоти і 1,15 мл 2 10 моль/л розчину калій гідрогенпероксомоносульфату, доводять до позначки двічі дистильованою водою, переносять в електролізер, видаляють кисень впродовж 10 хв та полярографують від - 0,5 до - 1,5 В (НКЕ). Вимірюють граничне значення величини дифузійного струму отриманої полярографічної хвилі (Е1/2 = - 1,05….-1,1 В (НКЕ). Вміст біотину розраховують за наперед отриманим градуювальним графіком. Побудова градуювального графіка. У мірні колби на 25 мл послідовно вносять 0,25 мл, 0,50 . -3 мл, 0,75 мл, 1,00 мл та 1,25 мл 2,0 10 моль/л (25,0 мг/50 мл) розчину РСЗ біотину, додають у . -3 кожну по 2,5 мл 2,5 моль/л фосфатної кислоти та 1,15 мл 2 10 моль/л розчину калій гідрогенпероксомоносульфату. Доводять до позначки двічі дистильованою водою, переносять в електролізер, видаляють кисень впродовж 10 хв та полярографують. За даними граничних значень величин дифузійного струму будують концентраційну залежність I гр у мкА від с, моль/л та методом найменших квадратів знаходять рівняння лінії Тренда (I гр = bс + а). І = 4 (1,15±0,195)х10 с + (0,63±0,13). Невідому концентрацію біотину в аналізованому розчині у моль/л знаходять за формулою: Iгр.  a c . b Вміст біотину, у мг до однієї таблетки, розраховують за формулою: Iгр.  a ( )  1000  244,31 25  50  m b m . 1000  mн  100 , де, mн - маса наважки досліджуваного зразка таблеток біотину, г; m - усереднена маса таблетки, г; 244,31 г/моль - молярна маса біотину; 25, 50 - об'єми мірних колб, мл; 1,00 - аліквотний об'єм випробуваного розчину, взятий на аналіз, мл; а i b - коефіцієнти градуювального графіка (вільний член та нахил); 1000, 1000 - коефіцієнти перерахунку маси біотину в мг та об'єму розчину до 1 мл відповідно. Результати кількісного визначення біотину, у мг до однієї таблетки, в таблетках по 5 мг за способом корисної моделі наведені в таблиці 2. 3 UA 98814 U Таблиця 2 Результати визначення біотину в таблетках по 5 мг Волвіт® (Kusum Healthcare Pvt. Ltd, India) (n=5, P=0,95) Вміст біотину (мг/ табл.) 10% 5,0 (100,29 % )*  10% Знайдено, мг x  x % ± RSD  (%) 5,08±0,18 101,6±2,7 1,3 Примітки:  * - задекларовано у сертифікаті, знайдено за стандартною фармакопейною методикою;   ( x  )  100 % /  5 Аналіз даних таблиць 1, 2 та регресійного аналізу (табл. 3) свідчить про те, що заявлений спосіб за метрологічними характеристиками відповідає вимогам Державної фармакопеї України щодо валідаційних показників правильності (  < RSD) та збіжності (3 RSD