Аптамер для хімази та його застосування

Реферат: Винахід належить до аптамеру, що може зв'язуватися з хімазою, для інгібування активності хімази. Аптамер містить нуклеотидну послідовність, представлену Х1GАUАGАN1N2UААХ2, причому Х1 та Х2 є однаковими чи різними та кожен з них являє собою А чи G, та Ν 1 та Ν2 є UA 107663 C2 (12) UA 107663 C2 однаковими чи різними та кожен з них являє собою A, G, С, U або Т. Також заявлено комплекс, що містить аптамер та функціональну речовину (афінну речовину, речовину для мічення, фермент, середовище для доставки лікарських засобів, лікарський засіб та ін.); лікарський засіб або реагент, що містить аптамер або комплекс; застосування аптамеру для детекції та очищення хімази. UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь винаходу Даний винахід відноситься до аптамеру для хімази, способу його застосування і т.п. Передумови створення винаходу Людська хімаза (EC.3.4.21.39), хімотрипсин-подібна серинова протеаза, зберігається у секреторних гранулах тучних клітин. При зовнішньому стимулюванні, тучні клітини піддають дегрануляції, що призводить до вивільнення людської хімази, поряд з широким різноманіттям медіаторів запалення, поза клітинами. Вивільнена людська хімаза специфічно розпізнає ароматичні амінокислоти, що містяться у білках та пептидах субстрату, наприклад, фенілаланін та тирозин, та розщеплює пептидні зв'язки, прилеглі до амінокислот. Репрезентативним субстратом для людської хімази є ангіотензин I (ANgI). Людська хімаза розщеплює ANgI з одержанням ангіотензина II (ANgII), фактора звуження судин. Хімази ссавців філогенетично класифікують за двома підсімействами: α та β. Примати, включаючи людей, експресують тільки один вид хімази, що належить до α сімейства. У той же час, гризуни експресують як α, так і β сімейства хімази. У мишей, існує множина видів хімаз, з яких протеаза-4 мишачих тучних клітин-4 (mMCP-4), що належить до β сімейства, як вважають, найбільш близькородинна до людської хімази, судячи з її специфічності субстрату та режиму експресії у тканинах. У хом'ячків, хімаза-1 хом'ячків, також член β сімейства, відповідає людській хімазі. У той же час, mMCP-5 та хімаза-2 хом'ячків, що належить до α сімейства, як і людська хімаза, має еластаза-подібну активність та відрізняється від людської хімази у термінах субстратної специфічності. Хімаза дуже пов'язана із активацією трансформуючого фактора росту β (TGF-β). TGF-β існує у латентній формі (латентний-TGF-β) у позаклітинних матрицях навколо епітеліальних клітин та ендотеліальних клітин, та утримується у позаклітинних матрицях через великий латентний TGFβ зв'язуючий білок (LTBP). TGF-β вивільняється з позаклітинних матриць у міру необхідності та активується, та активований TGF-β являє собою цитокін значної важливості для живих організмів, які, як повідомляють, задіяні у клітинній проліферації та диференціації, та у поновленні та регенерації тканин після пошкодження тканин. Згортання його сигналу призводить до початку та прогресії широкого різноманіття захворювань. Вважають, що у цьому процесі, хімаза задіяна у вивільненні латентного TGF-β з позаклітинних матриць та конверсії латентного TGF-β в активний TGF-β. Хімаза, як відомо, пов'язана з широким діапазоном захворювань, включаючи фіброз, серцево-судинні захворювання, запалення, алергічні хвороби та спайки органів. Фіброз являє собою захворювання, що характеризується ненормальним метаболізмом позаклітинних субстратів у легенях, серці, печінці, нирках, шкірі та ін., що призводить до надлишкового осадження білків з'єднувальних тканин. У легеневому фіброзі, наприклад, білки з'єднувальних тканин, такі як колаген, надлишково осаджуються у легенях, призводячи до сильного скорочення легеневих альвеол та наступного респіраторного дистресу. Як було показано, легеневий фіброз призводить до пневмоконіозу, що викликаний дією великої кількості пилу, пневмонії, викликаної лікарськими засобами, що спричинена застосуванням лікарських засобів, таких як засоби проти раку, алергічної пневмонії, легеневого туберкульозу, аутоімунних захворювань, таких як колагенова хвороба, та ін. Проте, досить часто причина невідома. Механізм початку фіброзу на молекулярному рівні не дуже добре вивчений. Загалом, у нормальному стані, проліферація та функції фібробластів добре контрольовані. У випадку серйозного чи стійкого запалення чи ушкодження, проте, механізм відновлення тканини функціонує надлишково, призводячи до ненормальної проліферації фібробластів та надлишкового продукування білків з'єднувальних тканин. TGF-β, як відомо, є фактором, що спричиняє ці явища. Як свідоцтво, що передбачає його задіяність, повідомлялося, що введення анти-TGF-β нейтралізуючого антитіла у тваринній моделі фіброзу спричиняє зменшену експресію колагену та значною мірою пригнічує фіброз. У пацієнтів з ідіопатичним легеневим фіброзом, спостерігаються підвищені рівні TGF-β та збільшена кількість хімаза-позитивних тучних клітин. У той же час, асоціація хімази у фіброзі була продемонстрована за допомогою експериментів з використанням тваринної моделі. У моделі хом'ячків блеоміцин-індукованого легеневого фіброзу, що сприяв активності хімази, підвищена експресія колаген III іРНК, тканинний фіброз та інші явища були значно зменшені за допомогою інгібіторів хімази. Такі ж впливи спостерігали для мишачої моделі блеоміцин-індукованого легеневого фіброзу; ведення інгібіторів хімази пригнічувало активність хімази та зменшувало вміст гідроксипроліну. З цими властивостями, інгібітори хімази можуть бути використані як профілактичні чи терапевтичні лікарські засоби для захворювань, що відносяться до хімази, таких як фіброз. 1 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Інгібітори хімази, що були розроблені, включають низькомолекулярні сполуки, такі як TPC-806, SUN-13834, SUN-C8257, SUN-C8077 та JNJ-10311795 (патентний документ 1). У останні роки, увагу привертало застосування РНК аптамерів для терапевтичних лікарських засобів, діагностичних реагентів та тестових реагентів; деякі РНК аптамери вже були на стадії клінічних досліджень або у практичному застосуванні. У грудні 2004 р., перший у світі РНК аптамерний лікарський засіб, Макуген, був схвалений як терапевтичний лікарський засіб для вікової макулярної дегенерації у США. РНК відноситься до РНК, що специфічно зв'язує молекулу-мішень, таку як білок, та може бути одержаний за допомогою способу SELEX (систематична еволюція лігандів шляхом експоненційного збагачення) (патентні документи 2-4). У способі SELEX РНК, що специфічно зв'язує молекулу-мішень, вибирають з пулу РНК з приблизно 1014 різними нуклеотидними послідовностями. Застосована РНК мала випадкову послідовність з приблизно 40 нуклеотидів, франкованих праймерними послідовностями. Цьому пулу РНК дозволяли змішуватися з молекулою-мішенню та тільки РНК, що була зв'язана з молекулою-мішенню, відділяли за допомогою фільтру та ін. Відділену РНК амплифікували за допомогою RT-ПЛР, та використовували як темплату для наступного раунду. Шляхом повторення цієї операції приблизно 10 разів може бути одержаний РНК аптамер, що специфічно зв'язує молекулу-мішень. Аптамерні лікарські засоби, подібно до лікарських засобів на основі антитіл, можуть націлювати позаклітинні білки. З посиланням на велику кількість наукових статей та інші довідкові матеріали, наявні у громадському доступі, аптамерні лікарські засоби розглядають як такі, що потенційно кращі, ніж лікарські засоби на основі антитіл, у деяких аспектах. Наприклад, аптамери часто проявляють вищу афінність та специфічність для молекул-мішеней, ніж антитіла. Аптамери, малоймовірно, піддають імунному елімінуванню, та повідомляють про низьку ймовірність несприятливих реакційних характеристик антитіл, наприклад, залежної від антитіл клітинно-опосредкованої цитотоксичності (ADCC) та комплемент-залежної цитотоксичності (CDC), при застосуванні аптамерів. З точки зору доставки лікарських засобів аптамери, ймовірно, мігрують у тканини, через їх молекулярний розмір, що становить приблизно одну десяту від розміру антитіл, дозволяючи більше легку доставку лікарського засобу до сайтів-мішеней. Оскільки аптамери одержують шляхом хімічного синтезу, вони дозволяють неселективні хімічні модифікації, та дозволяють заощадити кошти шляхом масового виробництва. Інші переваги аптамерів включають довготривалу стабільність при зберіганні, стійкість до дії тепла та розчинника. У той же час, період напіввиведення аптамерів з кровообігу є загалом більш коротким, ніж у антитіл; проте, ця властивість іноді є перевагою з огляду на токсичність. Ці факти приводять до висновку, що навіть коли мішенню є одна й та сама молекула, аптамерні лікарські засоби потенційно є кращими за лікарські засоби на основі антитіл. [Попередній рівень техніки] [Патентний документ] [Патентний документ 1] USB6500835 [Патентний документ 2] WO91/19813 [Патентний документ 3] WO94/08050 [Патентний документ 4] WO95/07364 [Короткий опис винаходу] [Задачі, що будуть вирішені даним винаходом] Даний винахід направлено на забезпечення аптамеру для хімази та способу його застосування, та ін. [Засоби вирішення задачі] Винахідники даного винаходу провели ретельні дослідження для вирішення описаної вище задачі та у результаті одержали аптамер високої якості для хімази, що привело до здійснення даного винаходу. Відповідно, даний винахід забезпечує таке: [1] Аптамер, що зв'язує хімазу для інгібування активності хімази. [2] Аптамер відповідно до [1], що містить нуклеотидну послідовність, представлену X1GAUAGAN1N2UAAX2 (SEQ ID NO: 21; кожен з X1 та X2, незалежно від того, ідентичні вони чи ні, являє собою А або G, та кожен з N 1 та N2, незалежно від того, ідентичні вони чи ні, являє собою А, G, C, U або T). [3] Аптамер відповідно до [2], що відрізняється тим, що N1N2 являє собою GA, GU, GC, UU, GT або CU. [4] Аптамер відповідно до [2], що відрізняється тим, що X 1 та Х2 обидва являють собою A чи обидва являють собою G. 2 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [5] Аптамер відповідно до [3] чи [4], що відрізняється тим, що щонайменше один з піримідинових нуклеотидів був модифікований чи змінений. [6] Аптамер відповідно до [1], що містить будь-яку з нуклеотидних послідовностей (a), (b) та (c), наведених нижче: (a) аптамер, що містить нуклеотидну послідовність, вибрану з наступних SEQ ID NO: 4-34, 38-57, 59-65 та 69-72 (за умови, що урацил може бути тиміном); (b) аптамером, що містить нуклеотидну послідовність, вибрану з наступних SEQ ID NO: 4-34, 38-57, 59-65 та 69-72 (за умови, що урацил може бути тиміном), що відрізняється тим, що 1-5 нуклеотидів заміщені, делетовані, введені чи додані; та (c) нуклеотидну послідовність, що має ідентичність 70 % чи більше з нуклеотидною послідовністю, вибраною з наступних SEQ ID NO: 4-34, 38-57, 59-65 та 69-72 (за умови, що урацил може бути тиміном). [7] Аптамер відповідно до [6], що відрізняється тим, що щонайменше один з нуклеотиді, що міститься в аптамері, був модифікований чи змінений. [8] Аптамер відповідно до [1], що містить будь-яку з нуклеотидних послідовностей (a"), (b") та (c"), що наведені нижче: (a") нуклеотидну послідовність, вибрану з наступних SEQ ID NO: 56(1)-56(7), 56(9), 56(11), 56(12), 56(15)-56(52), 61(1), 69(1), 69(2), та 72(1)-72(8) (за умови, що урацил може бути тиміном); (b") нуклеотидну послідовність, вибрану з наступних SEQ ID NO: 56(1)-56(7), 56(9), 56(11), 56(12), 56(15)-56(52), 61(1), 69(1), 69(2), та 72(1)-72(8) (за умови, що урацил може бути тиміном), що відрізняється тим, що 1-5 нуклеотидів заміщені, делетовані, введені чи додані; та (c") нуклеотидну послідовність, що має ідентичність 70 % чи більше з нуклеотидною послідовністю, вибраною з наступних SEQ ID NO: 56(1)-56(7), 56(9), 56(11), 56(12), 56(15)-56(52), 61(1), 69(1), 69(2), та 72(1)-72(8) (за умови, що урацил може бути тиміном). [9] Аптамер відповідно до [1], що відрізняється тим, що кожна з гідроксильних груп у 2'положенні відповідних піримідинових нуклеотиді, що містяться в аптамері, незалежно від того, ідентичні вони чи ні, можуть бути замішені атомом або групою, вибраними з групи, що складається з атому водню, атому фтору та метокси-групи. [10] Аптамер відповідно до [1], що відрізняється тим, що кожна з гідроксильних груп у 2'положенні відповідних пуринових нуклеотидів, що містяться в аптамері, незалежно від того, ідентичні вони чи ні, може бути заміщена атомом або групою, вибраними з групи, що складається з атому водню, атому фтору та метокси-групи. [11] Комплекс, що містить будь-який з аптамерів [1] - [10] та функціональну речовину. [12] Комплекс відповідно до [11], що відрізняється тим, що функціональна речовина являє собою афінну речовину, речовину для мічення, фермент, основу для доставки лікарського засобу або лікарський засіб. [13] Лікарський засіб, що містить будь-який з аптамерів [1] - [10] чи комплекс [11] або [12]. [14] Лікарський засіб відповідно до [13], що застосовують для профілактики чи лікування серцево-судинного захворювання чи фіброзу. [15] Діагностичний реагент що містить будь-який з аптамерів [1] - [10] або комплексу [11] або [12]. [16] Зонд для детекції з хімази, що містить будь-який з аптамерів [1] - [10] або комплексу [11] або [12]. [17] Твердофазний носій для очищення хімази, що містить будь-який з аптамерів [1] - [10] або комплексу [11] або [12]. [18] Спосіб детекції хімази, включає застосування будь-якого з аптамерів [1] - [10] або комплексу [11] або [12]. [19] Спосіб очищення хімази, що включає застосування будь-якого з аптамерів [1] - [10] або комплексу [11] або [12]. [Корисний ефект даного винаходу] Аптамер або комплекс за даним винаходом можуть бути корисними як лікарський засіб або реагент, такий, як діагностичний реагент для різних захворювань, спричиненими хімазою, таких як фіброз та серцево-судинні захворювання. Аптамер або комплекс за даним винаходом можуть бути також корисними для очищення та концентрування хімази, та детекції та кількісного визначення хімази. На Фіг. 1 показано вторинну структуру аптамера, показаного за допомогою SEQ ID NO: 4, 5, 12-14, 18 передбаченого програмою MFOLD, що відрізняється тим, що частина, включена у коло, показує спільну послідовність, показану за допомогою SEQ ID NO: 21. 3 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 На Фіг. 2 показано вторинну структуру аптамера, показаного за допомогою SEQ ID NO: 2227, передбаченого програмою MFOLD, що відрізняється тим, що частина, включена у коло, показує спільну послідовність, показану за допомогою SEQ ID NO: 21. На Фіг. 3 показано вторинну структуру аптамера, показаного за допомогою SEQ ID NO: 28-34 передбаченого програмою MFOLD, що відрізняється тим, що частина, включена у коло, показує спільну послідовність, показану за допомогою SEQ ID NO: 21. На Фіг. 4 показано, яким чином аптамери, показані за допомогою SEQ ID NO: 12 та 13, зв'язуються з хімазою, де 40N вказує на РНК пул, що містить випадкову послідовність з 40 нуклеотидів. Як молекула захвату, був іммобілізований кожен з аптамерів або негативний контроль 40N; як аналіт, вприскували людську хімазу. Вимірювання проводили за допомогою Biacore T100 (виготовлений GE Healthcare). На Фіг. 5 показано вторинну структуру аптамеру показані за допомогою SEQ ID NO: 38-40, 43, 48 передбаченого за допомогою програми MFOLD, що відрізняється тим, що частина, включена у коло, показує спільну послідовність, показану за допомогою SEQ ID NO: 21. На Фіг. 6 показано вторинну структуру аптамера, показаного за допомогою SEQ ID NO: 49, 51, 55-57, передбаченого за допомогою програми MFOLD, що відрізняється тим, що частина, включена у коло, показує спільну послідовність, показану за допомогою SEQ ID NO: 21. На Фіг. 7 показано, яким чином аптамери, показані за допомогою SEQ ID NO: 13, 55, та 56, зв'язуються з хімазою, що відрізняється тим, що 40N вказує на РНК пул, що містить випадкову послідовність з 40 нуклеотидів. Хімазу іммобілізували на поверхню чіпу; як аналіт, вприскували кожен з аптамерів чи негативний контроль 40N. Вимірювання проводили за допомогою Biacore T100 (виготовлений GE Healthcare). На Фіг. 8 показані результати детекції за допомогою аналізу Вестерн-блотинг того, яким чином LTBP-1 був розкладений хімазою та яким чином розкладання LTBP-1 було інгібоване аптамерами, переліченими у Таблиці 9. Номери доріжок 1, 8, 9, 23, та 31 вказують на маркери; номери доріжок 6, 21, та 29 показують результати для негативних контролів (без інгібітору); номери доріжок 7, 22, та 30 показують результати для контролів, що не містять хімази. [Кращі варіанти здійснення винаходу] Даний винахід забезпечує аптамер, що має активність зв'язування по відношенню до хімази. Аптамери за даним винаходом здатні інгібувати активність хімази. Аптамер відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, що має афінність зв'язування для конкретної молекули-мішені. Аптамер може також інгібувати активність конкретної молекулимішені шляхом зв'язування конкретної молекули-мішені. Аптамер за даним винаходом має активність зв'язування по відношенню до хімази, та здатний інгібувати активність хімази. Аптамер за даним винаходом може бути РНК, ДНК, модифікованою нуклеїновою кислотою чи їх сумішшю. Аптамер за даним винаходом може також знаходитися у лінійній чи круговій формі. Хімаза, загальновідома серинова протеаза, зберігається у секреторних гранулах тучних клітин. Хімаза значною мірою задіяна у широкому різноманітті біологічних реакцій, опосередкованих тучними клітинами, включаючи, наприклад, продукування біоактивних пептидів та їх розкладання, ремоделінг позаклітинних матриць, мережі з цитокінами та імунність. Аптамер за даним винаходом може проявляти інгібуючу активність проти хімаза, одержаної з будь-якого ссавця. Такі ссавці включають приматів (наприклад, людей, мавп), гризунів (наприклад, мишей, щурів, морських свинок, хом'ячків), та домашні тварини, одомашнені тварини та робочі тварини (наприклад, собак, котів, коней, корів, кіз, овець, свиней), перевагу віддають людям. Амінокислотна послідовність людської хімази показана за допомогою номера доступу AAB26828, та може бути послідовністю, що має одну чи декілька мутованих залишків, їх доменний фрагмент, або їх пептидний фрагмент. Структура людської хімази може бути не тільки мономером, але також димером чи полімером. Аптамер за даним винаходом зв'язує хімазу у фізіологічному сольовому розчині. Незважаючи на відсутність обмежень щодо вибору буферного розчину, перевагу віддають буферним розчинам, що мають значення pH, яке становить приблизно 5,0-10,0, Такі буферні розчини включають, наприклад, розчин A та розчин C, описані нижче (див. Приклади 1 та 2). Аптамер за даним винаходом зв'язує хімазу з міцністю, що детектується одним з тестів, описаних нижче. Міцність зв'язування вимірювали за допомогою Biacore T100 (виготовлений GE Healthcare). У способі вимірювання, аптамер спочатку іммобілізують на сенсорному чіпі, іммобілізована кількість становить приблизно 1000 УО. Вприскують 20 мкл розчину хімази для аналіту, які одержували при 0,2 мкМ, та детектують зв'язування хімази з аптамером. РНК, що містить випадкову нуклеотидну послідовність з 30 чи 40 нуклеотидів, використовують як негативний 4 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 контроль. Якщо хімаза зв'язує аптамер еквівалентно або значно більш ефективно порівняно із контрольною РНК, аптамер розглядають як такий, що здатний зв'язувати хімазу. В іншому способі, хімазу спочатку іммобілізують на сенсорному чіпі, іммобілізована кількість становить приблизно 4000 УО. Вприскують 20 мкл розчину аптамеру для аналіту, одержаного при 0,01 мкг/мл, та детектували зв'язування аптамеру з хімазою. РНК, що містить випадкову нуклеотидну послідовність з 30 чи 40 нуклеотидів, використовують як негативний контроль. Якщо хімаза зв'язує аптамер еквівалентно або значно більш ефективно порівняно із контрольною РНК, аптамер розглядають як такий, що здатний зв'язувати хімазу. Інгібуюча активність проти хімази означає потенціал інгібування по відношенню до будь-якої активності, яку має хімаза. Наприклад, інгібується активність ферменту щодо гідролізу та розщеплення пептидних ланцюгів, що являє собою одну з функцій хімази. Придатні субстрати для ферментної активності не обмежуються білками та біоактивними пептидами, наявними у живих організмах (наприклад, ANgI, латентний TGF-β та ін.), але включають пептиди, що містять часткові амінокислотні послідовності вказаних вище пептидів, кон'юговані з хромогенною речовиною або флуоресцентною речовиною. Хромогенні речовини та флуоресцентні речовини відомі фахівцям у цій галузі. Явища, що відбуваються через реакції розкладання білка чи біоактивного пептиду, включають підвищену експресію колагену I/III, збільшений вміст гідроксипроліну, підвищену експресію IgE та ін.; їх пригнічуючи впливи, також включені в інгібуючу активність проти хімази. Додатково, інгібуюча активність по відношенню до міграції нейтрофілів, моноцитів та еозинофілів до хімази також включена в інгібуючу активність проти хімази. Додатково, пригнічуючі ефекти по відношенню до прогресування вивільнення хімаза-індукованого гістаміну, оцінки кількості тучних клітин, підвищеної проникності судин, фіброзу тканин, запалення, ангіогенезу, судинного інтимального загущення та ін., також включені в інгібуючу активність проти хімази. Субстрат для хімази означає пептид, білок чи інше, що гідролітично розщеплюються під дією хімази. Субстрати для хімази, які, як відомо, існують у живих організмах, включають пептиди та білки, такі як ANgI, латентний TGF-β, фактор стволових клітин (SCF), проколоаген, проколагеназу, фібронектин, проматриксну металопротеазу-1 (pro-MMP-1), pro-MMP-9, тканинний інгібітор матриксної металопротеази-1 (TIMP-1), аполіпопротеїн A-I (apoA-I), apoE, фосфоліпід ний трансферний білок, IL-1β попередник, big-ендотелін-1 (big-ET-1), big-ET-2, активуючий з'єднувальні тканини пептид III, IL-18 попередник, речовину P, вазо активний інтестинальний пептид (VIP), калідін, брадикінін та C3a. У цій заявці, субстрати хімази не обмежені ними, проте включають штучно розроблені модельні пептиди, що містять амінокислотні залишки, що специфічно розпізнаються хімазою, наприклад, Phe та Tyr, а також пептиди, кон'юговані з хромогенною речовиною чи флуоресцентною речовиною. Чи інгібує аптамер ферментну активність хімази, може бути визначено за допомогою, наприклад, трьох аналітичних способів, описаних нижче. Перший спосіб застосовує синтетичний субстрат. Корисним хімазним субстратом є Suc-AlaAla-Pro-Phe-MCA (4-метилкумарил-7-амідна група) (виготовлений Peptide INstitute, INc.), що містить 4-амінокислотний пептид "Ala-Ala-Pro-Phe", стандартний субстрат для хімотрипсинподібних протеаз. Аналіз виконують з використанням планшету на 96 лунок (F16 Black MaXisorp FluoroNuNc, виготовлений NuNc), об'єм реакційної суміші становив 100 мкл, у буферному розчині (розчин C; див. Приклад 2 нижче). Спочатку, кожну нуклеїнову кислоту одержують у розчині C з одержанням 50 мкл розчинів. Після додавання 10 мкл 1 мM субстрату, одержаного у розчині C, планшет встановлюють у мікропланшетний рідер SpectraMaX190 (виготовлений Molecular Devices CorporatioN), та інкубують при 37C протягом 5 хвилин. Окремо, 0,05 мгк хімази (рекомбінантна, виготовлена SIGMA) розводять у розчині C, та 40 мкл цього розведення інкубують при 37C протягом 5 хвилин. Розчин хімази додають до суміші нуклеїнової кислоти та субстрат для початку ферментної реакції. Планшет, що містить реакційну суміш, встановлюють у мікропланшетний рідер SpectraMaX190 (виготовлений Molecular Devices CorporatioN), та досліджують на предмет залежних від часу змін інтенсивності флуоресценції при 37C протягом 5 хвилин (довжина хвилі збудження 380 нм, довжина хвилі детекції 460 нм). Отримують лінійну апроксимацію збільшення флуоресценції AMC (7-аміно-4-метилкумарін), вивільненого із субстрату, активності хімази, та її нахил беруть як початкову швидкість реакції. Для контролю, проби обробляють та аналізують аналогічним чином у двох випадках: застосування пулу нуклеїнових кислот, що містять випадкову послідовність з 30 або 40 нуклеотидів (негативний контроль), та застосування хімостатину, відомого хімотрипсин-подібного інгібітору серинових протеаз (позитивний контроль). Беручи початкову швидкість реакції без нуклеїнової кислоти та інгібітору як 100 % ферментної активності, розраховують швидкість інгібування для кожної 5 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тестової речовини, та визначають концентрацію інгібітору для спричинення 50 % інгібування активності ферменту (IC50). Аптамер, що проявляє більш низьке значення IC50, ніж хімостатин, відомий інгібітор, розглядають як такий, що має відмінну інгібуючу активність. Другий спосіб оцінювання застосовує нативний субстрат. Корисний нативний субстрат для хімази являє собою ангіотензин I. Тут His-Leu, пептидний фрагмент, вивільнений після розкладання ангіотензина I, флуоресцентно дериватизований, та звідти кількісно оцінюють флуоресцентну інтенсивність. В аналізі, ферментну реакцію проводять у 50 мкл розчину C. Спочатку, 0,3-0,75 нг хімази (рекомбінантна, виготовлена SIGMA; чи нативна, виготовлена Calbiochem) розводять у розчині C з одержанням 5 мкл розчину хімази. Кожну нуклеїнову кислоту одержують у розчині C з одержанням 25 мкл розчинів. 5 мкл кожного розведення хімази та 25 мкл кожної нуклеїнової кислоти змішують, та потім суміш інкубують при 37C протягом 5 хвилин. Окремо, 20 мкл 125 мкM ангіотензина I (виготовлений Peptide INstitute, INc.) одержують у розчині C та інкубують при 37C протягом 5 хвилин. Розчин ангіотензина I додають до суміші хімази та нуклеїнової кислоти, та розпочинають ферментну реакцію. Після того, як реакції дозволяють відбуватися при 37C протягом 90 хвилин, 25 мкл охолодженого льодом 30 % розчину трихлороцтової кислоти додають для припинення реакції. Всю суміш центрифугують при 4C, 14000 об./хв. протягом 10 хвилин та 30 мкл одержаного у результаті супернатанта застосовують для наступної реакції для флуоресцентної дериватизації. Після додавання 30 мкл супернатанта до планшету на 96 лунок (Black, виготовлений Costar), 15 мкл 2 % розчина o-фталальдегіду (виготовлений SIGMA) в метанолі та 170 мкл 0,3M розчину NaOH змішують у кожній лунці, та планшет залишають при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Потім, 25 мкл 3M розчину HCl додають для припинення реакції. Планшет встановлюють у мікропланшетний рідер SpectraMaX190 (виготовлений Molecular Devices CorporatioN), та інтенсивність флуоресценції визначають при довжині хвилі збудження 355 нм та довжина хвилі флуоресценції 460 нм. Для контролю, проби обробляють та аналізують аналогічним чином у двох випадках: застосування SEQ ID NO: 58 (негативний контроль) та застосування хімостатину, відомого хімотрипсин-подібного інгібітору серинових протеаз (позитивний контроль). В обох випадках, інтенсивність флуоресценції, одержана при реакційному часі 0 хвилин, слугує холостим визначенням. Беручи інтенсивність флуоресценції, детектовану шляхом додавання рівного об'єму розчину C, замість кожної нуклеїнової кислоти, у хімазній ферментній реакції як 100 %, розраховують швидкість інгібування для кожної тестової речовини, та визначають концентрацію інгібітору, необхідну для спричинення 50 % інгібування ферментної активності (IC50). Аптамер, що проявляє більш низьке значення IC50, ніж хімостатин, відомий інгібітор, розглядають як такий, що має відмінну інгібуючу активність. Третій спосіб оцінки застосовує нативний субстрат, що міститься у супернатантній клітинній культурі. Тут розкладання хімазного субстрату LTBP-1 детектують шляхом аналізу ВестернБлотинг. NHLF клітини (виготовлені CambreX Bio ScieNce) після заморожування швидко відтаюють на водній бані при 37C та потім суспендують у середовищі (10 % ембріональна бичача сироватка/F-12). Після центрифугування при 1200 об./хв. протягом 5 хвилин, одержаний у результаті супернатант видаляють, та клітини повторно суспендують у середовищі. Загальний об'єм 10 мл середовища додають до центрифугованих клітин, та клітинну суспензію переносять до чашки з культуральним середовищем та культивують при 37C у присутності 5 % CO2. Морфологію та проліфераційних статус клітин спостерігають під мікроскопом. Коли клітини стають конфлуентними, середовище замінюють середовищем, що не містить сироватку (0,2 % бичачого сироваткового альбуміну/F-12). Через два дня після заміни, культуральний супернатант збирають, диспергують та зберігають під заморожуванням при -30C. Після диспергування у пробірці 40 мкл NHLF культурального супернатанту, свіжо відталого перед застосуванням, розчин 5 мкл нуклеїнової кислоти розводять розчином C та додають до нього. Для позитивного контролю, хімостатин розводять розчином C, та це розведення додають аналогічним чином. Для негативного контролю, додають розчин C окремо. Потім, 5 мкл 100 нг/мл розведення хімази у розчині E (розчин C+0,1 % бичачого сироваткового альбуміну, 0,05 % азиду натрію) додають. Для контролю, готують пробірку, що не містить хімази. Після перемішування, пробу інкубують при 37C протягом 1 години, та змішували з рівним об'ємом лізисного буфера для електрофорезу для припинення реакції. LTBP-1 у пробі детектують за допомогою процедури Вестерн-Блотинг, описаної нижче. Пробу, змішану з лізисним буфером, кип'ятять протягом 3 хвилин, та 10 мкл пробі піддають електрофорезу на 5-20 % акриламідному гелі. Після завершення електрофорезу пробу переносять на нітроцелюлозний фільтр, після чого фільтр блокують 5 % знятим молоком, 50 мM 6 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Tris-HCl (pH 8,0), та 0,05 % азиду натрію. Фільтр реагує з 2 мкг/мл розведення анти-LTBP-1 моноклонального антитіла у 2 % бичачого сироваткового альбуміну, фосфатного буферного розчину та 0,05 % азиду натрію при кімнатній температурі протягом усієї ночі. Фільтр тричі промивають та інкубують розчином вторинного антитіла (HRP-мічене антимишаче IgG антитіло, розведене у 10000 разів 0,1 % бичачим сироватковим альбуміном/фосфатним буферним розчином) при кімнатній температурі протягом 2 годин. Фільтр промивають 5 раз, та детекцію проводять за допомогою хемілюмінесцентного субстрату. Як визначено відповідно до щільності смуги LTBP-1 та положення (молекулярна маса), смуга лунки без хімази слугує позитивним контролем (+), та смуга лунки негативного контролю слугує для негативного контролю (-). Кожну тестову речовину досліджують на предмет інгібуючої активності шляхом візуального дослідження. Відсутні обмеження щодо аптамеру за даним винаходом, оскільки він зданий зв'язуватися з будь-якою частиною хімази для інгібування її активності. Довжина аптамеру за даним винаходом не обмежена, та зазвичай становить від приблизно 10 до приблизно 200 нуклеотидів, та може становити, наприклад, не більше ніж приблизно 100 нуклеотидів, переважно не більше ніж приблизно 50 нуклеотидів, більш переважно не більше ніж приблизно 40 нуклеотидів, найбільш переважно не більше ніж приблизно 30 нуклеотидів. Коли загальна кількість нуклеотидів є меншою, хімічний синтез та масове продукування будуть більш легкими, та існує основна перевага у термінах вартості. Також вважають, що хімічна модифікація є легкою, стабільність в організмі високою та токсичність є низькою. Кожен з нуклеотидів, що міститься в аптамері за даним винаходом, незалежно від того, ідентичні вони чи різні, може бути нуклеотидом, що містить гідроксильну групу у 2" положенні рибози (наприклад, рибози піримідинового нуклеотиду, рибози пуринового нуклеотиду) (тобто, незаміщений нуклеотид) або нуклеотидом, заміщеним будь-яким атомом чи групою у 2" положенні рибози. Як приклади такого атому чи групи, можна зазначити нуклеотид, заміщений атомом водню, атомом фтору або -O-алкільною групою (наприклад, -O-Me групою), -Oацильною групою (наприклад, -O-COMe групою), або аміногрупою (наприклад, -NH2 групою). Аптамер за даним винаходом має послідовність, представлену X 1GAUAGAN1N2UAAX2 (SEQ ID NO: 21; що відрізняється тим, що кожен з X1 та Х2, незалежно від того, ідентичні вони чи ні, являє собою А чи G, та кожен з N1 та N2, незалежно від того, ідентичні вони чи ні, являє собою А, G, C, U чи T; за умови, що урацил може бути тиміном). Аптамер, що має таку послідовність, сильно зв'язує хімазу для інгібування активності хімази. У наведені вище формулі, обидва X1 та Х2 являють собою переважно A чи G; N1N2 являє собою переважно GA, GU, GC, UU, GT чи CU (за умови, що урацил може бути тиміном). Аптамер за даним винаходом може також бути нуклеотидом, що відрізняється тим, що щонайменше один вид (наприклад, 1, 2, 3 чи 4 види) нуклеотиду містить гідроксильну групу, або зазначені вищу будь-який атом чи групу, наприклад, щонайменше два види (наприклад, 2, 3 чи 4 види) груп, вибраних з групи, що складається з атому водню, атому фтору, гідроксильної групи та метокси-групи, у 2" положення рибози. В аптамері за даним винаходом, усі піримідинові нуклеотиди можуть бути нуклеотидами, заміщеними атомом фтору, або нуклеотидами, заміщеними будь-яким атомом чи групою, зазначеними вище, переважно атомом чи групою, вибраними з атому чи групи, що складаються з атому водню, гідроксильної групи та метокси-групи незалежно від того, ідентичні вони чи ні, у 2" положення рибози. В аптамері за даним винаходом, усі пуринові нуклеотиди можуть бути нуклеотидами, що містять гідроксильну групу, чи нуклеотидами, заміщеними будь-яким атомом чи групою, зазначеними вище, переважно атомом або групою, вибраними з групи, що складається з атому водню, метокси-групи, та атому фтору, незалежно від того, ідентичні вони чи ні, у 2'-положення рибози. Аптамер за даним винаходом може також бути аптамером, що відрізняється тим, що усі нуклеотиди ідентично містять гідроксильну групу, чи будь-який атом або групу, зазначені вище, наприклад, ідентичну групу вибрану з групи, що складається з атому водню, атому фтору, гідроксильної групи та метокси-групи, у 2" положенні рибози. У цій заявці, у цьому описі, припускають, що нуклеотиди, які складають аптамер, є РНК (тобто, як припускають, цукрові групи є рибозою) при описі того, яким чином групи модифіковані у нуклеотидах. Проте, це не означає, що ДНК виключено з нуклеотидів, що складають аптамері, та модифікація РНК має тлумачитися як модифікація ДНК, якщо доцільно. Якщо нуклеотид, що складає аптамер, являє собою ДНК, наприклад, заміщення гідроксильної групи у 2" положенні рибози на X має тлумачитися як заміщення одного атому водню у 2" положенні дезоксирибози на X. 7 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Аптамер за даним винаходом може також бути: (a) аптамером, що містить нуклеотидну послідовність, вибрану з наступних SEQ ID NO:4-34, 38-57, 59-65 та 69-72 (за умови, що урацил може бути тиміном); (b) аптамером, що містить нуклеотидну послідовність, вибрану з наступних SEQ ID NO:4-34, 38-57, 59-65 та 69-72 (за умови, що урацил може бути тиміном), що відрізняється тим, що 1-5 нуклеотидів заміщені, делетовані, введені чи додані; або (c) аптамером, що містить нуклеотидну послідовність, що має ідентичність 70 % чи більше (переважно 80 % чи більше, більш переважно 90 % чи більше, найбільш переважно 95 % чи більше) з нуклеотидною послідовністю, вибраною з наступних SEQ ID NO: 4-34, 38-57, 59-65 та 69-72 (за умови, що урацил може бути тиміном). Аптамер за даним винаходом також включає: (d) кон'югат, вибраний з групи, що складається з кон'югату множини аптамерів (a) вище, кон'югату множини аптамерів (b) вище, кон'югату множини аптамерів (c) вище, та кон'югату множини аптамерів (a), (b) та (c) вище. Не тільки аптамер (a) вище, але також аптамери (b) - (d) здатні зв'язувати хімазу та/або інгібувати активність хімази (ферментну активність хімази та ін.). Аптамер за даним винаходом може також бути: (a") аптамером, що містить нуклеотидну послідовність, вибрану з наступних SEQ ID NO: 56(1)-56(7), 56(9), 56(11), 56(12), 56(15)-56(52), 61(1), 69(1), 69(2) та 72(1)-72(8) (за умови, що урацил може бути тиміном); (b") аптамером, що містить нуклеотидну послідовність, вибрану з наступних SEQ ID NO: 56(1)-56(7), 56(9), 56(11), 56(12), 56(15)-56(52), 61(1), 69(1), 69(2) та 72(1)-72(8) (за умови, що урацил може бути тиміном), що відрізняється тим, що 1-5 нуклеотидів заміщені, делетовані, введені чи додані; або (c") аптамером, що містить нуклеотидну послідовність, що має ідентичність 70 % чи більше з нуклеотидною послідовністю, вибраною з наступних SEQ ID NO: 56(1)-56(7), 56(9), 56(11), 56(12), 56(15)-56(52), 61(1), 69(1), 69(2) та 72(1)-72(8) (за умови, що урацил може бути тиміном). Аптамер за даним винаходом також включає: (d") кон'югат, вибраний з групи, що складається з кон'югату множини аптамерів (a") вище, кон'югату множини аптамерів (b") вище, кон'югату множини аптамерів (c") вище, та кон'югату множини аптамерів (a"), (b") та (c") вище. Додатково, аптамер за даним винаходом також включає: (e) кон'югат, що складається з одного чи більше аптамерів вибраних з групи, що складається з (a), (b) та (c) вище, та одного чи більше аптамерів, вибраних з групи, що складається з (a"), (b") та (c"). Аптамери (a")-(d") та (e) вище також здатні зв'язувати хімазу та/або інгібувати активність хімази (ферментну активність хімази та ін.). У (b) та (b") вище, відсутні обмеження щодо кількості заміщених, делетованих, введені чи доданих нуклеотидів, оскільки аптамер здатний зв'язувати хімазу та/або інгібувати активність хімази (ферментну активність хімази та ін.). Кількість нуклеотидів може становити, наприклад, не більше ніж приблизно 30, переважно не більше ніж приблизно 20, більш переважно не більше ніж приблизно 10, ще більш переважно не більше ніж 5, найбільш переважно 4, 3, 2 чи 1. Щодо (c) та (c") вище, "ідентичність" означає співвідношення (%) ідентичних нуклеотидних залишків та усіх нуклеотидних залишків, що перекриваються, в оптимальному вирівнюванні, де дві нуклеотидні послідовності вирівняні з використанням математичного алгоритму, відомого у цій технічній галузі (переважно, алгоритм враховує введення гепів в одну чи обидві послідовності для найкращого вирівнювання). Ідентичність нуклеотидних послідовностей у даному описі може бути розрахована шляхом, наприклад, вирівнювання двох нуклеотидних послідовностей за допомогою алгоритму розрахунку гомології NCBI BLAST-2 (NatioNal CeNter for BiotechNology INformatioN Basic Local AligNmeNt Search Tool) за таких умов (відкритий геп=5 штрафів; продовження гепу=2 штрафи; X_ скорочення=50; очікуваність=10; фільтрування=ON). У (d), (d") та (e) вище, кон'югація може бути досягнута шляхом тандемного зв'язування. При кон'югації, може бути використаний лінкер. Як лінкер, можуть бути зазначені нуклеотидні ланцюги (наприклад, від 1 до приблизно 20 нуклеотидів) та не-нуклеотидні ланцюги (наприклад, -(CH2)N-лінкер, -(CH2CH2O)N-лінкер, гексаетиленгліколевий лінкер, TEG лінкер, пептид-вмісний лінкер, -S-S- зв'язок-вмісний лінкер, -CONH- зв'язок-вмісний лінкер, -OPO3- зв'язок-вмісний лінкер). Множина, як описана вище множина кон'югатів, не обмежена конкретно, доки вона являє собою два чи більше, та множина може складати, наприклад, 2, 3 чи 4. Кожен з нуклеотидів у (a) - (d), (a") - (d") та (e) вище, незалежно від того, ідентичні вони чи різні, може бути нуклеотидом, що містить гідроксильну групу у 2" положенні рибози або нуклеотид, 8 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 заміщений будь-якими групами (наприклад, атомом водню, атомом фтору чи -O-Me групою) у 2" положення рибози (наприклад, рибози піримідинового нуклеотиду). Аптамер за даним винаходом може відрізнятися тим, що цукровий залишок (наприклад, рибоза) кожного нуклеотиду був модифікований для підвищення хімазної активності зв'язування, стабільності, можливості доставки лікарських засобів та ін. Як приклади сайту для модифікації у цукровому залишку, може бути зазначений такий, що має атом кисню у 2'положенні, 3'-положенні та/або 4'-положенні цукрового залишку, заміщеного іншим атомом, та ін. Як приклади модифікації, можуть бути зазначені фторування, O-алкілування (наприклад, Oметилування, O-етилування), O-арилування, S-алкілування (наприклад, S-метилування, Sетилування), S-арилування та амінування (наприклад, -NH2). Такі зміни у цукровому залишку можуть бути здійснені способом, що відомий як такий (див., наприклад, Sproat et al., (1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; CottoN et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145). Аптамер за даним винаходом може також мати змінену основу нуклеїнової кислоти (наприклад, пуринову чи піримідинову) (наприклад, хімічне заміщення) для підвищення хімазної активності зв'язування та ін. Як приклади таких змін, можуть бути зазначені 5-положення піримідинової зміни, 6- та/або 8-положення пуринової зміни, зміни на поза циклічний амін, заміщення на 4-тіоуридин та зміщення на 5-бром чи 5-йод-урацил. Фосфатна група, що міститься в аптамері за даним винаходом, може бути замінена для надання резистентності до нуклеази та гідролізу. Наприклад, P(O)O група може бути заміщена на P(O)S (тіоат), P(S)S (дитіоат), P(O)NR2 (амідат), P(O)CH3, P(O)BH3, P(O)R, R(O)OR", CO або CH2 (формацеталь) або 3'-амін (-NH-CH2-CH2-) [що відрізняється тим, що кожна ланка R чи R" незалежно являє собою H або заміщений чи незаміщений алкіл (наприклад, метил, етил)]. З'єднувальними групами є, наприклад, -O-, -N- чи -S-, та нуклеотиди можуть зв'язувати прилеглий нуклеотид через такі з'єднувальні групи. Зміни можуть також включати такі, зміни, як кемпінг у 3" та 5". Зміна може бути додатково здійснена шляхом додавання до кінця поліетиленгліколю, амінокислоти, пептиду, інвертованої dT, нуклеїнової кислоти, нуклеозидів, мирістоїолу, літоколік-олеїлу, докозанілу, лауроїлу, стеароїлу, пальмітоїлу, олеоїлу, лінолеоїлу, інших ліпідів, стероїдів, холестерину, кофеїну, вітамінів, пігментів, флуоресцентних речовин, протиракових агентів, токсину, ферментів, радіоактивних речовин, біотину та ін. Такі зміни описані, наприклад, у патентних США 5,660,985 та 5,756,703. Аптамер за даним винаходом може бути синтезований, як описано у цій заявці, та способом, що відомий як такий з рівня техніки. Спосіб синтезу застосовує РНК полімеразу. ДНК, що має описану послідовність, та промоторна послідовність РНК полімерази синтезують хімічно, та, як темплату, транскрибують загальновідомим способом з одержанням бажаної РНК. Аптамер за даним винаходом можу також бути синтезований за допомогою ДНК полімерази. ДНК, що має бажану послідовність, синтезують хімічно та як темплату, ампліфікують способом, загальновідомим як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Її відображають як одноланцюгову загальновідомим способом поліариламідного електрофорезу чи ферментною обробкою. При синтезі модифікованого аптамера, ефективність реакції подовження може бути збільшена за допомогою полімерази, мутованої у конкретному сайті. Аптамер, одержаний таким чином, може бути легко очищений загальновідомим способом. Аптамер може бути синтезований у великій кількості за допомогою способів хімічного синтезу, таких як амідитний спосіб та фосфорамідітний спосіб. Ці синтетичні способи добре відомі, як описано у Nucleic Acid (Vol.2) [1] SyNthesis aNd ANalysis of Nucleic Acid (під редакцією Yukio Sugiura, опубліковано Hirokawa PublishiNg CompaNy) та ін. Практично, застосовують синтезатор, такий, як OligoPilot100 чи OligoProcess (виготовлений GE Healthcare BioscieNce). Аптамер, синтезований таким чином, може бути очищений способом, відомим як такий, наприклад, хроматографією. За умови, що активну групу, так, як аміногрупу, вводять в аптамер протягом процесу хімічного синтезу за допомогою фосфорамідітного способу чи ін., функціональна речовина може бути додана після синтезу. Наприклад, шляхом введення аміногрупи в кінець аптамера, можливо конденсувати поліетиленгліколевий ланцюг, що включає карбоксильну групу. Аптамер зв'язує молекулу-мішень за великою кількістю режимів зв'язування, наприклад, іонних зв'язків, що базуються на негативному заряді фосфатної групи, гідрофобних зв'язків та водневих зв'язків, що базуються на рибозі, та водневих зв'язків та стекінг-взаємодію, заснованих на основах нуклеїнових кислот. Зокрема, іонні зв'язки, що базуються на негативному заряді фосфатної групи, присутні у тій же кількості, що й кількість складових нуклеотидів, є сильними, та зв'язують лізин та аргінін, присутні на поверхні позитивного заряду 9 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 білка. Для цього, основи нуклеїнових кислот, не задіяні у безпосередньому зв'язуванні молекули-мішені, можуть бути заміщені. Зокрема, оскільки ділянка стволової структури вже сформувала пари основ та обернена всередину подвійної спіральної структури, малоймовірно, що основи нуклеїнових кислот безпосередньо зв'язують молекулу-мішень. Тому, навіть якщо пару основ заміщають на іншу пару основ, активність аптамеру часто не зменшується. У структурах, що відрізняються тим, що пари основ не сформовані, таких як петельні структури, за умови, що основа нуклеїнової кислоти не задіяна в безпосередньому зв'язуванні молекулимішені, можливим є заміщення основ. Стосовно модифікацій 2'-положення рибози, функціональна група у 2'-положення рибози нечасто взаємодіє з молекулою-мішенню, але в багатьох випадках, що не має значення, може бути заміщена іншою модифікованою молекулою. Тому, аптамер, якщо функціональна група задіяна у безпосередньому зв'язуванні молекулимішені є заміщеною чи делетованою, часто зберігає її активність. Також важливо, щоб усі тривимірна структура не дуже змінювалася. Аптамер може бути одержаний шляхом застосування способу SELEX або його вдосконаленої версії (наприклад, ElliNgtoN et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al., (1990) ScieNce, 249, 505-510). У способі SELEX, шляхом більш жорсткого призначення критеріїв відбору та збільшення кількості раундів чи застосування конкуруючої речовини, аптамер, що проявляє більш сильний потенціал зв'язування для молекули-мішені, концентрують та вибирають Тому, шляхом регулювання кількості раундів SELEX та/або змінень конкуруючих умов, аптамери з різними силами зв'язування, у деяких випадках можуть бути одержані аптамери з різними режимами зв'язування, та аптамери з такою ж самою силою зв'язування чи режимом зв'язування, але з різною послідовністю основ. Спосіб SELEX включає процес ампліфікації за допомогою ПЛР; шляхом спричинення мутації через використання іонів магнію та ін. у процесі, можливо виконувати SELEX з більш високим різноманіттям. Аптамери, одержані за допомогою SELEX, являють собою нуклеїнові кислоти, що проявляють високу афінність до молекули-мішені, але це не означає інгібування біологічної активності молекули-мішені. Хімаза є основним білком, з яким, як вважають, ймовірно неспецифічно зв'язуються нуклеїнові кислоти, але аптамери, що відрізняються від тих, що сильно зв'язують конкретний сайт хімази, не впливають на активність молекули-мішені. Фактично, РНК що містить випадкову послідовність, яку застосовують як негативний контроль, не інгібувала ферментну активність хімази, незважаючи на те, що слабко зв'язує хімазу. Виходячи з вибраного таким чином активного аптамера, SELEX може бути здійснений для одержання аптамера, що має більш високу активність. Конкретно, після одержання темплати, що відрізняється тим, що аптамер з визначеною послідовністю частково рандомізований чи до темплати додано приблизно 10-30 % випадкових послідовностей, SELEX проводять знову. Аптамер, одержаний за допомогою SELEX, має довжину приблизно 80 нуклеотидів, та його складно одержати як лікарський засіб у тому вигляді, в якому він є. Тому, необхідно повторювати спроби методом спроб та помилок для скорочення аптамеру до довжини приблизно 50 нуклеотидів чи менше, що дозволить легкий хімічний синтез. В залежності від конструкції праймера для аптамера, одержаного за допомогою SELEX, легкість наступної операції мінімізації змінюється. Якщо праймер не сконструйовано успішно, наступна розробка буде неможливою навіть якщо аптамер з активністю відбирають за допомогою SELEX. У даному винаході, одержували аптамер, що зберігав активність навіть з 23 нуклеотидами. Аптамери можна легко модифікувати, оскільки вони дозволяють хімічний синтез. Для аптамерів, шляхом прогнозування вторинної структури за допомогою програми MFOLD, або шляхом прогнозування стеричної структури за допомогою рентгеноструктурного аналізу чи ЯМР аналізу, можливо прогнозувати, деякою мірою, який з нуклеотидів можу бути заміщений чи делетований, та куди вводити новий нуклеотид. Прогнозований аптамер з новою послідовністю може бути легко синтезований хімічно, та може бути визначено, чи зберігає аптамер активність, за допомогою існуючої аналітичної системи. Якщо ділянку, важливу для зв'язування одержаного аптамеру з молекулою-мішенню, ідентифікують шляхом повторення спроб методом спроб та помилок, як описано вище, то активність залишається незмінною у багатьох випадках, навіть якщо нову послідовність додають до обох кінців послідовності. Довжина нової послідовності не обмежена конкретно. Фахівці у цій галузі можуть здійснювати широкий діапазон конструювань чи змін модифікацій, таких як послідовності. Як зазначено вище, аптамери дозволяють здійснювати широкий діапазон конструювань чи змін модифікацій. Даний винахід також забезпечує спосіб одержання аптамера, що дозволяє здійснювати широкий діапазон конструювань аптамера, що містить зазначену послідовність (наприклад, послідовність, що відповідає частині, вибраній з стволових ділянок, внутрішніх 10 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 петельних ділянок, петельних ділянок, ділянок петель шпильки та одноланцюгових ділянок: у цій заявці, скорочено як фіксована послідовність, у міру необхідності). Наприклад, спосіб одержання такого аптамеру включає одержання аптамеру, що містить фіксовану послідовність шляхом застосування одного виду молекули нуклеїнової кислоти чи множини видів молекул нуклеїнових кислот (наприклад, бібліотеки молекул нуклеїнових кислот з різною кількістю для "a" чи "b"), що складається з нуклеотидної послідовності, показаною за допомогою формули: Праймерна послідовність (i) –(N)a–фіксована послідовність –(N)b- Праймерна послідовність (ii) [що відрізняється тим, що (N)a являє собою нуклеотидний ланцюг, що складається з "a" ланок N; (N)b являє собою нуклеотидний ланцюг, що складається з b" ланок N; кожна з ланок N, незалежно від того, ідентичні вони чи різні, являє собою нуклеотид, вибраний з групи, що складається з A, G, C, U та T (переважно, A, G, C та U). Кожна з "a" та "b", незалежно від того, ідентичні вони чи різні, можуть бути будь-якими числами, та можуть становити, наприклад, від 1 до приблизно 100, переважно від 1 до приблизно 50, більш переважно від 1 до приблизно 30, ще більш переважно від 1 до приблизно 20 чи від 1 до приблизно 10, та пари праймерів відповідають праймерним послідовностям (i) та (ii), відповідно. Даний винахід також забезпечує комплекс, що містить аптамер за даним винаходом, та функціональну речовину, зв'язану з ним. Зв'язок між аптамером та функціональною речовиною у комплексі за даним винаходом може бути ковалентним зв'язком або нековалентним зв'язком. Комплекс за даним винаходом може бути комплексом, що відрізняється тим, що аптамер за даним винаходом та одна чи більше (наприклад, 2 чи 3) функціональних речовин того ж самого виду чи різних видів зв'язані разом. Функціональна речовина не обмежена конкретно, оскільки вона заново надає певні функції аптамеру за даним винаходом, чи здатна до змін (наприклад, покращення) певних характеристик, які може мати аптамер за даним винаходом. Як приклади функціональної речовини, можуть бути зазначені білки, пептиди, амінокислоти, ліпіди, цукри, моносахариди, полінуклеотиди та нуклеотиди. Як приклади функціональної речовини, можуть бути зазначені афінні речовини (наприклад, біотин, стрептавідин, полінуклеотиди, що мають афінність для комплементарної послідовності-мішені, антитіла, глутатіон, сефароза, гістидин), речовини для мічення (наприклад, флуоресцентні речовини, люмінесцентні речовини, радіоізотопи), ферменти (наприклад, пероксидаза хрону, лужна фосфатаза), основи для доставки лікарських засобів (наприклад, ліпосома, мікросфери, пептиди, поліетиленгліколі), лікарські засоби (наприклад, які застосовують у рановій терапії, такі як каліхеаміцин та дуокарміцин; аналоги азотистого іприту, такі як циклофосфамід, мельфалан, іфосфамід чи трофосфамід; етиленіміни, такі як тіотепа; нітрозосечовини, такі як кармустин; алкілуючі агенти, такі як темозоломід чи дакарбазин; фолатоподібні антагоністи метаболізму, такі як метотрексат чи ральтітрексед; аналоги пурину, такі як тіогуанін, кладрібін чи флударабін; аналоги піримідину, такі як фторурацил, тегафур чи гемцитабін; алкалоїди барвінку, такі як вінбластин, вінкристин чи вінорельбін та їх аналоги; похідні подофілотоксину, такі як етопозид, таксани, доцетаксель чи паклітаксель; антарцикліни, такі як доксорубіцин, епірубіцин, ідарубіцин та мітоксантрон, та їх аналоги; інші цитотоксичні антибіотики, такі як блеоміцин та мітоміцин; сполуки платини, такі як цисплатин, карбоплатин та оксаліплатин; пентостатін, мільтефозин, естрамустин, топотекан, іринотекан та бікалутамід), та токсини (наприклад, рициновий токсин, ліатоксин та веротоксин). Ці функціональні молекули остаточно видаляють у деяких випадках. Додатково, молекули можуть бути пептидами, які розпізнають та розщеплюють ферментами, такими, як тромбін, матриксна металопротеїназа (MMP), та фактор X, та вони можуть бути полінуклеотидами, що можуть бути розщепленими нуклеазами чи рестрикційними ендонуклеазами. Аптамер або комплекс за даним винаходом можуть бути застосовані як, наприклад, лікарський засіб чи діагностичний реагент, тестовий реагент чи реагенти. Аптамер та комплекс за даним винаходом можуть мати активність інгібування функції хімази. Як зазначено вище, хімаза значною мірою зв'язана з фіброзом та серцево-судинними захворюваннями. Тому, аптамер та комплекс за даним винаходом є корисними як лікарські засоби для лікування чи профілактики захворювань, що супроводжуються фіброзом чи серцевосудинними розладами. Аптамер та комплекс за даним винаходом здатні специфічно зв'язувати хімазу. Тому, аптамер та комплекс за даним винаходом є корисними як зонди для детекції хімази. Проби є корисними для формування зображень хімази in vivo, вимірювань концентрацій хімази у крові, забарвлення тканин, ELISA та ін. Зонди є також корисними як діагностичні реагенти, тестові 11 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 реагенти, аналітичні реагенти та ін. Для захворювань, в яких задіяна хімаза (захворювань, що супроводжуються фіброзом чи серцево-судинними розладами, та ін.). Виходячи зі специфічного зв'язування з хімазою, аптамер та комплекс за даним винаходом можуть бути застосовані для очищення хімази. Аптамер та комплекс за даним винаходом можуть бути застосовані як основи для доставки лікарських засобів. Захворювання, задіяні у фіброзі органу чи тканини, включають легеневий фіброз, простатичну гіперплазію, міокардіальний фіброз, скелетно-мязовий фіброз, мієлофіброз, гістероміому, склеродерму, спайки після хірургічних операцій, рубці після операцій, опікові рубці, гіпертрофічні рубці, келоїди, атопічний дерматит, перітонеальний склероз, астму, цироз печінки, хронічний панкреатит, фіброзний рак шлунку, фіброз печінки, фіброз нирок, фіброзні судинні захворювання, ретиніт, викликаний фіброзним мікроваскулітом як діабетичне ускладнення, невроз, нефропатії, гломерулонефрит, тубулоінтерстеціальний нефрит, спадкові захворювання нирок, артеріосклеортичний периферійний артерит та ін. Серцево-судинні захворювання включають ангіопатії, аневризми аорти, ниркову недостатність, гіпертензію, артеріосклероз, інфаркт міокарда, серцеву гіпертрофію, серцеву недостатність, рестеноз після ангіопатій, викликаний чрезшкірною транслюмінальною коронарною ангіопластикою та ін., діабетичні та недіабетичні нефропатії, розлади периферійного кровообігу та ін. Хімаза має ферментну активність та розщеплює біоактивні речовини, що слугують як субстрати. Приклади відомих на даний час субстратів включають ANgI, латентний TGF-β, SCF, проколаген, проколагеназу, про-MMP-9, IL-1β попередник та ін. Хімаза проявляє біологічну дію, через реакції продукування чи розкладання таких біологічно активних пептидів, включаючи ремоделювання позаклітинного матриксу, мережі з цитокинами, імунітет та вазоконстрикцію. У той же час, хімаза сама по собі активує тучні клітини та сприяє вивільненню гістаміну, та тісно зв'язана із запаленням. Тому, аптамер та комплекс за даним винаходом не обмежені описаними вище субстратами, та можуть бути застосовані як лікарські засоби чи діагностичні реагенти, тестові реагенти та аналітичні реагенти для захворювань, пов'язаних з біологічними функціями, опосередкованими субстратами, прийнятними хімазою, та захворювань, в яких задіяна хімаза сама по собі. Лікарський засіб за даним винаходом може бути складений з фармацевтично прийнятним носієм. Як приклади фармацевтично прийнятного носія, можуть бути зазначені такі ексципієнти, як сахароза, крохмаль, маніт, сорбіт, лактоза, глюкоза, целюлоза, тальк, фосфат кальцію та карбонат кальцію; агенти зв'язування, такі як целюлоза, метилцелюлоза, гідроксилпропілцелюлоза, поліпропілпіролідон, желатин, гуміарабік, поліетиленгліколь, сахароза та крохмаль; агенти розпаду, такі як крохмаль, карбоксиметилцелюлоза, гідроксилпропілкрохмаль, натрій-гліколь-крохмаль, гідрокарбонат натрію, фосфат кальцію, та цитрат кальцію; змащувальні речовини, такі як стеарат магнію, аеросіл, тальк, та натрій лаурилсульфат; смакові добавки, такі як лимонна кислота, ментол, гліциризин-амонійна сіль, гліцин та апельсиновий порошок; консерванти, такі як бензоат натрію, гідросульфіт натрію, метилпарабен та пропілпарабен; стабілізатори, такі як лимонна кислота, цитрат натрію, та оцтова кислота; суспендуючі агенти, такі як метилцелюлоза, полівінілпіролідон та стеарат алюмінію; диспергуючі агенти, такі як поверхнево-активні речовини; розріджувачі, такі як вода, фізіологічний сольовий розчин, та апельсиновий сік; базисні віски, такі як масло какао, поліетиленгліколь, та керосин; та ін., але цей список не обмежений. Відсутні обмеження щодо шляху введення лікарського засобу за даним винаходом, що може бути введений, наприклад, пероральним введенням та парентеральним введенням. Препарати, придатні для перорального введення, являють собою розчин, одержаний шляхом розчинення ефективної кількості ліганда у розріджувачі, такому як вода, фізіологічний сольовий розчин, чи апельсиновий сік; капсули, саше чи таблетки, що містять ефективну кількість ліганда у твердій чи гранульованій формі; суспензію, одержану шляхом суспендування ефективної кількості активного інгредієнта у відповідному диспергаторі; емульсію, одержану шляхом дисперсії та емульгації розчину ефективної кількості активного інгредієнта у відповідному диспергаторі; C10, що сприяє поглинанню водорозчинних речовин, та ін. Лікарський засіб за даним винаходом може бути покритий за допомогою способу, відомого як такий, для маскування смаку, розчинення у кишках, безперервного вивільнення та ін. у міру необхідності. Як приклади агентів покриття для покриття, застосовують гідроксипропілметилцелюлозу, етилцелюлозу, гідроксиметилцелюлозу, гідроксипропілцелюлозу, поліoксиетиленгліколь, Твін 80, плуронік F68, целюлоза ацетатфталат, фталат гідроксипропілметилцелюлози, ацетат сукцинат гідроксиметилцелюлози, ойдрагіт 12 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (виготовлений Rohm, GermaNy, співполімер метакрилової кислоти/акрилової кислоти), пігменти (наприклад, червоний оксид заліза, диоксид титану та ін.) та ін. Лікарський засіб може бути препаратом швидкого вивільнення або препаратом безперервного вивільнення. Як препарати, придатні для парентерального введення (наприклад, внутрішньовенного введення, підшкірного введення, внутрішньом'язового введення, місцевого введення, інтраперітонеального введення, інтраназального введення та ін.), доступні водні та неводні ізотонічні стерильні рідини для вприскування, що можуть містити антиоксидант, буферний розчин, бактеріостатичний агент, ізотонуючий агент та ін. Можуть бути зазначені водні та неводні стерильні суспензії, що можуть містити суспендуючі агенти, солюбілізатор, згущувач, стабілізатор, антисептичний засіб та ін. Препарат можу бути включений у контейнер, такий як ампула або віала, у стандартному лікарському об'ємі або у декількох розділених дозах. Активний інгредієнт та фармацевтично прийнятний носій можуть також бути висушені заморожуванням та зберігатися у стані, що може бути розчинений чи суспендований у відповідній стерильній основі безпосередньо перед застосуванням. Препарати безперервного вивільнення є також прийнятними препаратами. Лікарські форми препаратів безперервного вивільнення включають безперервне вивільнення з носіїв чи контейнерів, включених в організм, таких як штучні кістки, біорозкладані основи чи небіорозкладані губки, контейнери та ін. Пристрої для безперервної чи періодичної, системної чи місцевої доставки ззовні в організм, такі як насоси для лікарських засобів чи насоси осмотичного тиску, також включені до обсягу препаратів безперервного вивільнення. Біорозкладані основи включають ліпосому, катіонну ліпосому, полі(кополімер молочної та гліколевої кислот) (PLGA), атероколаген, желатин, гідроксіапатит, полісахарид сізофіран. Додатково до рідких ін'єкцій, суспензій та препаратів безперервного вивільнення, прийнятними є інгалятори, прийнятні для транслегеневого введення, мазі, прийнятні для підшкірного введення, та ін. У випадку інгалятора, активний інгредієнт у висушеному заморожуванням стані мікронізують та вводять шляхом вдихання за допомогою відповідного пристрою для інгаляцій. Інгалятор можу бути складений, як доцільно, з традиційно застосовними поверхнево-активною речовиною, олією, смаковими добавками, циклодекстрином чи його похідними та ін., у міру необхідності. Інгалятор може бути одержаний відповідно до традиційного способу. Конкретно, інгалятор може бути одержаний шляхом розпилення чи зріджування аптамеру чи комплексу за даним винаходом, його змішування з інгаляційним пропелентом та/або носієм, та наповнення відповідної інгаляційної судини. Коли описані вище аптамер чи комплекс за даним винаходом являють собою порошок, то можу бути застосований стандартний механічний порошковий інгалятор, у випадку рідини, можу бути застосований інгалятор, такий, як небулайзер. У цій заявці як пропелент, який, як традиційно відомо, широко використовують; можуть бути зазначені сполуки серії хлорфторвуглеців, такі як хлорфторвуглець-11, хлорфторвуглець-12, хлорфторвуглець-21, хлорфторвуглець-22, хлорфторвуглець-113, хлорфторвуглець-114, хлорфторвуглець-123, хлорфторвуглець-142c, хлорфторвуглець-134a, хлорфторвуглець-227, хлорфторвуглець-C318, та 1,1,1,2-тетрафторетан, вуглеводні, такі як пропан, ізобутан, та нбутан, етери, такі як діетиловий етер, стиснені гази, такі як газоподібний азот та газоподібний діоксид вуглецю та ін. У цій заявці як приклади поверхнево-активних речовин можуть бути зазначені олеїнова кислота, лецитин, діетиленгліколь діолеат, тетрагідрофлуфурил олеат, етил олеат, ізопропіл мирістат, гліцерил тріолат, гліцерил монолаурат, гліцерил моноолеат, гліцерил моностеарат, гліцерил монолізиноат, цетиловий спирт, стеариловий спирт, поліетиленгліколь 400, цетилпирідиній хлорид, сорбітан тріолеат (торгівельна назва SpaN 85), сорбітан моноолеат (торгівельна назва SpaN 80), сорбітан монолаурат (торгівельна назва SpaN 20), затверджено поліоксоетиленом касторова олія (торгівельна назва HCO-60), оліоксіетилен (20) сорбітан монолаурат (торгівельна назва Твін 20), поліоксоетилен (20) сорбітан моноолеат (торгівельна назва Твін 80), лецитин природного походження (торгівельна назва EPICLON), олеїлполіоксіетиленовий (2) етер (торгівельна назва Brij 92), стеарилполіоксіетиленовий (2)етер (торгівельна назва Brij 72), лаурил поліоксіетиленовий (4) етер (торгівельна назва Brij 30), олеїлполіоксіетиленовий (2) етер (торгівельна назва GeNapol 0-020), блок-кополімер оксіетилену та оксипропілену (торгівельна назва SyNperoNic) та ін. Як приклади олії, можуть бути зазначені кукурудзяна олія, оливкова олія, олія насіння бавовни, соняшникова олія та ін. У випадку мазей, відповідну фармацевтично прийнятну основу (жовтий петролатум, білий петролатум, парафін, пластибейз, силікон, біла мазь, бджолиний віск, лярд, рослинні олії, гідрофільні мазі, гідрофільний петролатум, чищений ланолін, гідролізований ланолін, 13 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 водопоглинаюча мазь, гідрофільний пластибейз, мазь макрогол та ін.) змішують з аптамером за даним винаходом, що являє собою активний інгредієнт, та застосовують як препарат. Дозування лікарський засіб за даним винаходом варіюється в залежності від виду та активності активного інгредієнта, важкості захворювання, видів тварин, які є суб'єктами введення, переносимості лікарських засобів суб'єктом введення, маси тіла, віку, та ін., та стандартна доза, виходячи з кількості активного інгредієнта в день для дорослого, може становити від приблизно 0,0001 до приблизно 100 мг/кг, наприклад, від приблизно 0,0001 до приблизно 10 мг/кг, переважно від приблизно 0,005 до приблизно 1 мг/кг. Даний винахід також забезпечує твердофазний носій, що має аптамер та/або комплекс за даним винаходом, іммобілізований на ньому. Як приклади твердофазного носія, можуть бути зазначені субстрат, смола, планшет (наприклад, планшет на багато лунок), фільтр, картридж, колонка та пористий матеріал. Субстратом може бути субстрат, використаний у ДНК чіпах, білкових чіпах та ін.; наприклад, можуть бути зазначені нікель-PTFE (політетрафторетилен) субстрати, скляні субстрати, апатитові субстрати, силіконові субстрати, глиноземні субстрати та ін., та субстрати, одержані шляхом покриття цих субстратів полімером та ін. Як приклади смоли, можуть бути зазначені агарозні частинки, частинки кремнезему, кополімер акриламіду та N, N'метиленбісакриламіду, частинки дивінілбензолу, перехресно зшиті полістиролом, частинки декстрану, перехресно зшиті епіхлоргідрином, целюлозне волокно, перехресно зшиті полімери арилдекстрану та N, N'- метиленбісакриламіду, монодисперговані синтетичні полімери, монодисперговані гідрофільні полімери, сефароза, Toyopearl та ін., та також включені смоли, одержані шляхом зв'язування різних функціональних груп з цими смолами. Твердофазний носій за даним винаходом може бути корисним при, наприклад, очищенні, детекції та кількісному визначенні хімази. Аптамер та/або комплекс за даним винаходом може бути іммобілізований на твердофазний носій за допомогою способу, відомого як такий. Наприклад, можуть бути зазначені спосіб, що вводить афінну речовину (наприклад, способи, описані вище) або попередньо визначену функціональну групу в аптамер та/або комплекс за даним винаходом, та наступну іммобілізацію аптамер чи комплекс на твердофазному носії через афінну речовину чи попередньо визначену функціональну групу. Даний винахід також забезпечує такі способи. Попередньо визначена функціональна група може бути функціональною групою, що може бути піддана реакції сполучення; наприклад, можуть бути зазначені аміногрупа, тіольна група, гідроксильна група, та карбоксильна група. Даний винахід також забезпечує аптамер, що має таку функціональну групу, введену у нього. Даний винахід також забезпечує спосіб очищення та концентрування хімази. Зокрема, даний винахід надає можливість для відділення хімази від білків інших білків сімейства. Спосіб очищення та концентрування за даним винаходом може включати адсорбцію хімази на твердофазний носій за даним винаходом, та елюювання адсорбованої хімази елюентом. Адсорбцію хімази на твердофазний носій за даним винаходом можна досягати способом, відомим як такий. Наприклад, хімаза-вмісну пробу (наприклад, бактеріальну чи клітинну культуру чи культуральний супернатант, кров) вводять у твердофазний носій за даним винаходом або у композицію, що його містить. Хімаза може бути елюйована за допомогою елюенту, такого, як нейтральний розчин. Відсутнє обмеження щодо нейтрального елюенту, що може мати значення pH яке становить, наприклад, від приблизно 6 до приблизно 9, переважно від приблизно 6,5 до приблизно 8,5, та більш переважно від приблизно 7 до приблизно 8. Нейтральний розчин може також містити, наприклад, сечовину, хелатор (наприклад, ЕДТК), сіль натрію (наприклад, NaCl), сіль калію (наприклад, KCl), сіль магнію (наприклад, MgCl2), поверхнево-активну речовину (наприклад, Твін 20, TritoN, NP40), та гліцерин. Спосіб очищення та концентрування за даним винаходом може додатково включати промивання твердофазного носія за допомогою промивного розчину після адсорбції хімази. Приклади промивних розчинів включають такі, що містять сечовину, хелатор (наприклад, ЕДТК), Tris, кислоту, луг, транспортну РНК, ДНК, поверхнево-активні речовини, такі як Твін 20, солі, такі як NaCl та ін. Спосіб очищення та концентрування за даним винаходом може також додатково включати нагрівання твердофазного носія. Ця стадія дозволяє регенерацію та стерилізацію твердофазного носія. Даний винахід також забезпечує спосіб детекції та кількісного визначення хімази. Зокрема, даний винахід надає можливість детекції та кількісного визначення хімази окремо від білків інших білків сімейства. Спосіб детекції та кількісного визначення за даним винаходом може включати вимірювання хімази шляхом застосування аптамеру за даним винаходом (наприклад, шляхом застосування комплексу та твердофазного носія за даним винаходом). спосіб детекції та кількісного визначення хімази може бути здійснений аналогічним чином як і імунологічний 14 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 спосіб, за виключенням того, що аптамер за даним винаходом застосовують замість антитіла. Тому, шляхом застосування аптамеру за даним винаходом як зонду замість антитіла, можуть бути здійснені детекція та кількісне визначення аналогічно до таких способів, як іммуноферментний аналіз (EIA) (наприклад, безпосередній конкуруючий аналіз ELISA, опосередкований конкуруючий аналіз ELISA, сендвічевий аналіз ELISA), радіоіммунологічний аналіз (RIA), флуоресцентний іммуноаналіз (FIA), метод Вестерн-блотинг, спосіб іммуногістохімічного аналізу та спосіб клітинного сортування. Аптамер за даним винаходом може також бути використаний як молекулярний зонд для PET та ін. Ці способи можуть бути корисними при, наприклад, вимірюванні вмісту хімази у живих організмах чи біологічних пробах, та при діагностиці захворювання, пов'язаного із хімазою. Описи в усіх публікаціях, зазначених у цій заявці, включаючи описи патентів та патентних заявок, включені шляхом посилання у цій заявці до даного винаходу тією мірою, якою усі з них були наведені певним чином. Даний винахід у цій заявці більш детально описано за допомогою наступних Прикладів, які, проте, жодним чином не обмежують обсяг даного винаходу. Приклади Приклад 1: Одержання РНК аптамерів, що специфічно зв'язують хімазу (1) РНК аптамери, що специфічно зв'язують хімазу, одержували за допомогою способу SELEX. SELEX проводили зі вдосконаленнями способу ElliNgtoN et al. (ElliNgtoN aNd Szostak, Nature 346, 818-822, 1990) та способу Tuerk et al. (Tuerk aNd Gold, ScieNce 249, 505-510, 1990). Хімазу (людська шкіра, виготовлена Calbiochem) іммобілізували на NHS-активованому сефарозному 4 Fast Flow (виготовлена GE Healthcare) носії, та використовували як молекулу-мішень. Іммобілізацію хімази на носії здійснювали так, як описано у специфікаціях від GE Healthcare. Іммобілізовану кількість підтверджували шляхом дослідження розчину хімази до іммобілізації та супернатанта відразу після іммобілізації за допомогою SDS-PAGE. У результаті SDS-PAGE, детектували відсутність смуг хімази у супернатанті; було підтверджено, що майже усі застосовані хімази були сполучені. Це означає, що майже 167 пмоль хімази іммобілізували на приблизно 3 мкл смоли. РНК, що використовували у першому раунді (40N), одержували шляхом транскрибування хімічно синтезованої ДНК за допомогою набору транскрипції DuraScribeTM T7 (виготовлений EpiceNtre). РНК, одержана цим способом, має 2'- фтор-заміщене положення рибози піримідинового нуклеотиду. Наступні ДНК довжиною 70 нуклеотидів, що мають праймерну послідовність на кожному кінці 40-нуклеотидної випадкової послідовності, застосовували як ДНК темплату. Застосовані ДНК темплату та праймери одержували за допомогою хімічного синтезу. ДНК темплата: 5'GCGGCCGCTCTTCTATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAA TTCCTACCGT-3" (SEQ ID NO: 1) Прямий праймер: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGACGGTAGGAATTC-3" (SEQ ID NO: 2) Зворотний праймер: 5'-GCGGCCGCTCTTCTATG-3" (SEQ ID NO: 3) Послідовні Ns у ДНК темплаті (SEQ ID NO: 1) являють собою 40 нуклеотиди у будь-яких комбінаціях (40N: кожен N є A, G, C або T), що виробляють ділянку послідовності, унікальну до кожного одержаного аптамеру. Прямий праймер містить промоторну послідовність T7 РНК полімерази. Варіація РНК пулу, що використовують у першому раунді, теоретично становила 1014. Пул РНК додавали до хімаза-іммобілізованого носія, та дозволяли стояти при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Потім, для видалення РНК, не зв'язаного із хімазою, смолу промивали розчином A. Тут, розчин A являв собою змішаний розчин 145 мM хлориду натрію, 5,4 мM хлориду калію, 1,8 мM хлориду кальцію, 0,8 мM хлориду магнію, та 20 мM Tris. РНК, зв'язаний із хімазою, нагрівали при 95C протягом 10 хвилин з додаванням розчину B як елюенту, та відновлювали із супернатанту. Тут, розчин B являв собою суміш 7M сечовини, 3 мM ЕДТК, та 100 мM Tris-HCl (pH 6,6). Відновлену РНК амплифікували за допомогою RT-ПЛР та транскрибували за допомогою набору транскрипції DuraScribeTM T7, та застосовували як пул для наступного раунду. Коли процедура займала 1 раунд, аналогічну операцію здійснювали багато разів. Після завершення SELEX, продукт ПЛР клонували у вектор pGEM-T Easy (виготовлений Promega), та у ньому трансформували штам Escherichia coli DH5α (виготовлений Toyobo). Після екстракції плазміну з однієї колонії, клони основних послідовностей визначали за допомогою ДНК секвенатора (3130Xl GeNetic ANalyzer, виготовлений ABI). Після 8 раундів SELEX, послідовності 44 клонів секвенували; спостерігали конвергентність послідовностей. Послідовності деяких з клонів показані за допомогою SEQ ID NO: 4-20, Серед послідовностей, існувало 6 послідовностей, показаних за допомогою SEQ ID NO: 4, 2 15 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності, показані за допомогою SEQ ID NO: 5, та 1 послідовність, показана за допомогою SEQ ID NO: 6-20, SEQ ID NO: 6 та 8 відрізнялися тільки на одну основу. Послідовності SEQ ID NO: 4, 13, та 14, як було знайдено, містять спільну послідовність, показану за допомогою SEQ ID NO: 21, яка була присутня у 9 з 44 клонів. Вторинні структури цих послідовностей були передбачені за допомогою програми MFOLD (M. Zuker, Nucleic Acids Res. 31(13), 3406-3415, 2003); частини, сформовані частиною спільної послідовності, мали аналогічну структуру петлі. Передбачені вторинні структури аптамерів послідовностей показані за допомогою SEQ ID NO: 4, 5, 12-14, та 18, та наведені на Фіг. 1, де кожна частина сформована за допомогою спільної послідовності, показаної за допомогою SEQ ID NO: 21, включені у коло. Нижче наведені відповідні нуклеотиді послідовності. Якщо не вказано інше, наступні індивідуальні послідовності, наведені у напрямку від 5" до 3", де пуринові основи (A та G) знаходяться у 2'-OH формі, та піримідинові основи (U та C) знаходяться у 2'-фтормодифікованій формі. У послідовностях, кожен з N 1 та N2 вказує на будь-який нуклеотиді з A, G, C, та U, та X1 та X2 являють собою обидва A або обидва G. SEQ ID NO: 4: GGGACGGUAGGAAUUCGUCCAUUCUACAGAUAGAGAUAAAGUAGAAUUUAACAAAACAUAG AAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 5: GGGACGGUAGGAAUUCCCACUUGUCUUUGAGGCAAGAAAUUGUAUUCCGAAGAAGCAUAG AAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 6: GGGACGGUAGGAAUUCUACGGUCUGUGUGAAAUUGAAACACACAAAGAACAAUAGACAUA GAAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 7: GGGACGGUAGGAAUUCACCUUUCCAAUUGUGAAAGAAACACAAAAAGAAAUGACAUCAUAG AAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 8: GGGACGGUAGGAAUUCUACGGUCUGUGUGAAAUUGAAACACACAAAGAACAAUAAACAUAG AAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 9: GGGACGGUAGGAAUUCCCGAAAAGCAACAAGCUUGCUAAAAUGAUUCCGAAAAAACACAUA GAAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 10: GGGACGGUAGGAAUUCCGCCGCCUAAAAAACGACGAUAUUACAGAAACGUCAAAUACAUAG AAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 11: GGGACGGUAGGAAUUCCCGACACGAAAUGUGUGAUUAAUUCCGAACAACAAAGUAACAUA GAAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 12: GGGACGGUAGGAAUUCGCCGUCAACGUUACAUAAUGUAUAUACCAGGGUAACUAAACAUA GAAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 13: GGGACGGUAGGAAUUCCGCAACCAUCCCGUAACUAUGGUUAGAUAGAGUUAAAAACCAUA GAAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 14: GGGACGGUAGGAAUUCUCGUUCCUGACAGCAUUUGAGAUAGAUUUAAACAAACGCACAUA GAAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 15: GGGACGGUAGGAAUUCCCAGAAAAUAAAUUCCGAAGAAAACAACAAUUUUUGCAAACAUAG AAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 16: GGGACGGUAGGAAUUCCCAUGACUGAAAAACGUCAGUAAAAUCCGAAAAUCAUAUCAUAGA AGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 17: GGGACGGUAGGAAUUCCGUUCGCAGAAACGAACUUUUAAAAAAUGUACGUGGGAGCACAU AGAAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 18: GGGACGGUAGGAAUUCGAACGACAAAUUAUAGAACUUCGUUUGACAUUCCACACCACAUA GAAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 19: 16 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 GGGACGGUAGGAAUUCCCACUGCAAUUCAGCAGAAAAAAUUCCGAAAAACACACACCAUAG AAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 20: GGGACGGUAGGAAUUCAAAAUCAGCUGAUUUGUAAUUUUUUUACACAGGCAAAACACAUA GAAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 21: X1GAUAGAN1N2UAAX2 Після описаних вище 8 раундів, SELEX продовжували за аналогічних умов. Після завершення 11-го раунду, секвенували послідовності 93 клонів. Деякі з послідовностей клонів показані за допомогою SEQ ID NO: 22-27. Ряд послідовностей був ідентичним деяким з послідовностей, одержаних після 8 раундів; існувало 22 послідовності, показані за допомогою SEQ ID NO: 4, та 4 послідовності, показані за допомогою SEQ ID NO: 14. Це означає, що спільна послідовність, показана за допомогою SEQ ID NO: 21, була концентрована. Також існувала 1 послідовність, показана за допомогою SEQ ID NO: 5, 3 послідовності, показані за допомогою SEQ ID NO: 22, та 2 послідовності, показані за допомогою SEQ ID NO: 23 та 24. Одна послідовність, показана за допомогою SEQ ID NO: 25-27. SEQ ID NO: 22 та 11, відрізнялася тільки на одну основу. SEQ ID NO: 26 та 4 відрізнялися тільки на одну основу. Спільна послідовність, показана за допомогою SEQ ID NO: 21, була присутня у 35 з 93 клонів. З послідовностей, що знов з'явилися до 11-го раунду, вони показані за допомогою SEQ ID NO: 25 та 26, що містили спільну послідовність, показану за допомогою SEQ ID NO: 21. Передбачені вторинні структури аптамерів послідовностей, показані за допомогою SEQ ID NO: 22-27, наведена на Фіг. 2, де кожна частина сформована спільною послідовністю, показаною за допомогою SEQ ID NO: 21, включені у коло. Усі ці частини мали характеристичну петельну структуру, як наведено на Фіг. 1. Нижче наведені відповідні нуклеотиді послідовності. Якщо не вказано інше, наступні індивідуальні послідовності наведені у напрямку від 5" до 3", де пуринові основи (A та G) знаходяться у 2'-OH формі, та піримідинові основи (U та C) знаходяться у 2'-фтормодифікованій формі. SEQ ID NO: 22: GGGACGGUAGGAAUUCCCGACACAAAAUGUGUGAUUAAUUCCGAACAACAAAGUAACAUAG AAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 23: GGGACGGUAGGAAUUCAUAUGUACUCCGUCCUGACAAAAUGUCAAUGACAAACGUUCAUA GAAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 24: GGGACGGUAGGAAUUCCCUUCAUAGUAGAAUGUUGGUUUCUACAAAAGCGACAAGCAUAG AAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 25: GGGACGGUAGGAAUUCAGCUGACUCCAAUGCACACGUAGAUAGAGUUAAAACGUUGCAUA GAAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 26: GGGACGGUAGGAAUUCGUCGAUUCUACAGAUAGAGAUAAAGUAGAAUUUAACAAAACAUAG AAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 27: GGGACGGUAGGAAUUCCGUCAUCGGUUGCAAAUUGAAAAUACAAAACAAGGACAACCAUA GAAGAGCGGCCGC Після описаних вище 8 раундів SELEX, SELEX продовжували за допомогою хімази (людська шкіра, виготовлений Calbiochem), іммобілізованої на гепариновому сефарозному 6 Fast Flow (виготовлений GE Healthcare) носії, як молекули-мішені. Хімазу у розчині додавали до носія та зберігали при кімнатній температурі протягом 30 хвилин, шляхом цього хімазу іммобілізували на носії. Іммобілізовану кількість перевіряли шляхом дослідження розчину хімази до іммобілізації, та супернатант безпосередньо після іммобілізації за допомогою SDS-PAGE. Результати SDSPAGE детектували відсутність смуги хімази у супернатанті, підтверджуючи, що майже усі з використаних хімаз були іммобілізовані. Було очевидним, що приблизно 100 пмоль хімази іммобілізували на приблизно 3 мкл смоли. Пул в 11-му раунді клонували, та визначали послідовності 79 клонів. Послідовності деяких з цих клонів показані за допомогою SEQ ID NO: 28-34. Існував ряд послідовностей, ідентичних послідовностям, одержаним після зазначених вище 8 раундів; існувало 9 послідовностей, показаних за допомогою SEQ ID NO: 4, та 1 послідовність, показана за допомогою SEQ ID NO: 19. Існував ряд послідовностей, ідентичних одержаним послідовностям після описаних вище 11 17 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 раундів; існувало 2 послідовності, показані за допомогою SEQ ID NO: 27. Додатково, існувало 4 послідовності, показані за допомогою SEQ ID NO: 28, 2 послідовності, показані за допомогою SEQ ID NO: 29, та 1 послідовність, показана за допомогою SEQ ID NO: 30-34. SEQ ID NO: 30 та 31 відрізнялися тільки на одну основу. SEQ ID NO: 32 є послідовністю, одержаною в результаті делеції однієї основи від SEQ ID NO: 31. Спільну послідовність показано за допомогою SEQ ID NO: 21 та вона була присутня у 14 з 79 клонів. Із послідовностей, що знов з'явилися до 11-го раунду, такі, що мали SEQ ID NO: 30-32 та 34, як було знайдено, містили спільну послідовність, показану за допомогою SEQ ID NO: 21. Передбачені вторинні структури аптамерів послідовностей, показані за допомогою SEQ ID NO: 28-34, наведені на Фіг. 3, де кожна частина, сформована спільною послідовністю, показаною за допомогою SEQ ID NO: 21, заключна у коло. Усі ці частини, за виключенням клону, показаного за допомогою SEQ ID NO: 34, мали характеристичну петельну структуру, як наведено на Фіг. 1. Нижче наведені нуклеотиді послідовності, показані за допомогою SEQ ID NO: 28-34, відповідно. Якщо не вказано інше, то наступні індивідуальні послідовності наведені у напрямку від 5" до 3", з пуриновими основами (A та G), що знаходяться у 2'-OH формі, та піримідинові основи (U та C) знаходяться у 2'-фтор-модифікованій формі. SEQ ID NO: 28: GGGACGGUAGGAAUUCAAUUUCUUUCUAUUCUCACCUGAGUAUAUCAGGCACAGUACAUA GAAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 29: GGGACGGUAGGAAUUCACGACCGCCCAAAAAAUGGUGACAUUUUAGAAACACCGAACAUA GAAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 30: GGGACGGUAGGAAUUCGUCCCUCUUGUCUAUUUUGCAGAUAGACUUAAAGCAAACAUAGA AGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 31: GGGACGGUAGGAAUUCGUCCCUCAUGUCUAUUUUGCAGAUAGACUUAAAGCAAACAUAGA AGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 32: GGGACGGUAGGAAUUCGUCCUCAUGUCUAUUUUGCAGAUAGACUUAAAGCAAACAUAGAA GAGCGGCCGC SEQ ID NO: 33: GGGACGGUAGGAAUUCCUGUCUUUUCCCACGCAACAAAUUACAGAGCUUUGCAAAACAUA GAAGAGCGGCCGC SEQ ID NO: 34: GGGACGGUAGGAAUUCUGCCGCAACCCAAUGAAAACGAAGAUAGAGAUAAAUCGAACAUA GAAGAGCGGCCGC Активності зв'язування проти хімази нуклеїнових кислот показані за допомогою SEQ ID NO: 4-20 та 22-34 визначали за допомогою способу поверхневого плазмонного резонансу за допомогою Biacore T100 (виготовлений GE Healthcare). Використаним сенсорним чіпом був SA чіп, на який був іммобілізований стрептавідин. До нього було зв'язано приблизно 1500 УО 16нуклеотидного полі dT з біотином, зв'язаним до його 5" кінця. Лігандну нуклеїнову кислоту, що мала 16-нуклеотидну полі A додавали до його 3" кінця, та іммобілізували до чіпу SA шляхом гібридизації між T та A. 20 мкл кожної нуклеїнової кислоти вприскували при швидкості потоку 20 мкл/хв., та іммобілізували приблизно 1000 УО нуклеїнової кислоти. Вприскували 20 мкл хімази для аналіту, одержаного при 0,2 мкМ. Розчин A застосовували як рухомий буфер. Усі досліджені послідовності, як було знайдено, зв'язують хімазу (Таблиця 1). Проте, пул нуклеїнових кислот (40N), використаний у 1-му раунді, що містив випадкову послідовність з 40 нуклеозидів, слугував як негативний контроль, як також було знайдено, проявляв слабку активність зв'язування проти хімази. Тому, у Таблиці 1, аптамери з активністю зв'язування вище за 40N, представлені за допомогою ++, та аптамери, що мають активність зв'язування, порівняну із 40N, представлені за допомогою +. Сенсограма, де показано, яким чином аптамери, показані за допомогою SEQ ID NO: 12 та 13, зв'язані із хімазою, наведені на Фіг. 4. Незалежно від того, наявна чи відсутня спільна послідовність, показана за допомогою SEQ ID NO: 21, деякі послідовності проявляли активність зв'язування, вищу за 40N, та інші проявляли еквівалентну активність зв'язування, порівняну із 40N. SEQ ID NO: 4, 13, 14, 25, 26, та 30, що містили таку спільну послідовність, проявляли активність зв'язування вищу за 40N, тоді як SEQ ID NO: 31, 32, та 34, що містили ту ж саму спільну послідовність, проявляли еквівалентну активність зв'язування, порівняну із 40N. Було знайдено, що N 1N2, що містилися у 18 UA 107663 C2 послідовності SEQ ID NO: 21, можуть бути GA, GU, UU, або CU, та що X 1 та X2, що містилися у послідовності SEQ ID NO: 21 можуть обидві бути A. Таблиця 1 Активність зв'язування по відношенню до хімази SEQ ID NO: 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Довжина 73 72 73 73 73 74 73 73 73 73 73 73 72 74 73 73 73 73 73 72 73 73 73 73 73 71 71 70 73 73 активність зв'язування за допомогою Biacore ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ ++ ++ ++ + ++ ++ + + + + "++" представляє послідовність, що зв'язує хімазу значною мірою більш сильно, ніж негативний контроль 40N. "+" представляє послідовність, що зв'язує хімазу еквівалентно порівняно із негативним контролем 40N. Тут, 40N представляє пул нуклеїнових кислот, використаний у 1-му раунді, що містить випадкову послідовність з 40 нуклеотидів. 5 10 15 Приклад 2: Одержання РНК аптамерів, що специфічно зв'язують хімазу (2) SELEX здійснювали аналогічно до Прикладу 1, але із застосуванням темплати, в якій випадкова послідовність складалася з 30 нуклеотидів, та праймерна послідовність відрізнялася від використаної у Прикладі 1. Молекулою-мішенню, використаною у SELEX, була хімаза (рекомбінантна, виготовлена SIGMA), іммобілізована на NHS-активованому сефарозному 4 Fast Flow (виготовлений GE Healthcare) носії. Послідовності використаних темплати та праймерів показані нижче. ДНК темплату та праймери синтезували хімічно. ДНК темплата: 5'TCACACTAGCACGCATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATCTGACCTCTCTC CTGCTCCC-3" (SEQ ID NO: 35) Прямий праймер: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGCAGGAGAGAGGTCAGATG-3" (SEQ ID NO: 36) Зворотний праймер: 5'-TCACACTAGCACGCATAGG-3" (SEQ ID NO: 37) 19 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Послідовні Ns у ДНК темплаті (SEQ ID NO: 35) являють собою 30 нуклеотидів у будь-яких комбінаціях (30N: кожен N являє собою A, G, C або T), що виробляють ділянку послідовності, унікальну для кожного одержаного аптамеру. Прямий праймер містить промоторну послідовність T7 РНК полімерази. Варіація застосованого у першому раунді пулу РНК становила теоретично 1014. Пул РНК додавали до носія, на якому було іммобілізовано хімазу, та утримували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин, після чого смолу промивали розчином C для видалення РНК, не зв'язаної з хімазою. Тут розчин C являв собою змішаний розчин 145 мM хлориду натрію, 5,4 мM хлориду калію, 1,8 мM хлориду кальцію, 0,8 мM хлориду магнію, 20 мM Tris (pH 7,6), та 0,05 % Твін 20, РНК зв'язаний з хімазою відновлювали шляхом додавання розчину D як елюенту, та перемішування суміші при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Тут розчин D одержували шляхом додавання 6M гуанідин гідрохлориду до розчину C з одержанням pH 7,6. Елюювання проводили у 3 цикли. Відновлену РНК амплифікували за допомогою RT-ПЛР, та переносили за допомогою набору транскрипції DuraScribeTM T7 для застосування як пулу у наступному раунді. Кожен раунд на цих стадіях повторювали багато разів. Після завершення SELEX, продукт ПЛР клонували у вектор pGEM-T Easy (виготовлений Promega), та до у ньому трансформували штам Escherichia coli DH5α (виготовлений Toyobo). Після екстракції плазміну з однієї колонії, клони секвенували за допомогою ДНК секвенатора (3130Xl GeNetic ANalyzer, виготовлений ABI). Після завершення 8 раундів SELEX, послідовності визначали; конвергенція послідовностей не спостерігалася. Потім, додавали 2 мг/мл гепарину як конкуруючого агента, та SELEX продовжували до 11-го раунду. Послідовності з 40 клонів визначали, та спостерігали конвергенцію; послідовності усіх 40 клонів, як було знайдено, містили спільну послідовність, показану за допомогою SEQ ID NO: 21. Послідовності деяких з цих клонів показані за допомогою SEQ ID NO: 38-48. Існувало 6 послідовностей, показаних за допомогою SEQ ID NO: 38, 2 послідовності, показані за допомогою SEQ ID NO: 39, та 1 послідовність, показана за допомогою SEQ ID NO: 40-48. Передбачувані вторинні структури аптамерів послідовностей, показаних за допомогою SEQ ID NO: 38-40, 43, та 48, наведені на Фіг. 5, де кожна частина, сформована за допомогою спільної структури, показаної за допомогою SEQ ID NO: 21, включена у коло. У багатьох з цих частин, спільна послідовність показана за допомогою SEQ ID NO: 21, сформованою характеристичною петельною структурою, подібною до структури, показаної на Фіг. 1. Нижче наведені нуклеотиді послідовності, показані у SEQ ID NO: 38-48, відповідно. Якщо не вказано інше, наступні індивідуальні послідовності наведені у напрямку від 5" до 3", де пуринові основи (A та G) знаходяться у 2'-OH формі, та піримідинові основи (U та C) у 2'-фтормодифікованій формі. SEQ ID NO: 38: GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGGAUAGAGUUAAGAUCUGGCUGGCGCAUUAGCCUAUG CGUGCUAGUGUGA SEQ ID NO: 39: GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGGUUACGGAUAGAGUUAAGGUAACGGUACGGCCUAUG CGUGCUAGUGUGA SEQ ID NO: 40: GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGAACGGAUAGAGCUAAGAGUUCGUCAGAGGGGCCUAU GCGUGCUAGUGUGA SEQ ID NO: 41: GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGGUGAGAUAGAGUUAAACACCACAAUAGUAGCCUAUGC GUGCUAGUGUGA SEQ ID NO: 42: GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGCGUGAUCGUGCAAGGCGGAUAGAGUUAAGGCCUAUG CGUGCUAGUGUGA SEQ ID NO: 43: GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGAUGCCAAGAUAGAUUUAAAUGGCGUUUGGGCCUAUG CGUGCUAGUGUGA SEQ ID NO: 44: GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGUUAGACCAAAGCAUAGGAGAUAGAGUUAAACCUAUGC GUGCUAGUGUGA SEQ ID NO: 45: GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGGACCACCGAUGGGCAAGAUAGAGUUAAAUGCCUAUGC GUGCUAGUGUGA 20 UA 107663 C2 5 10 15 SEQ ID NO: 46: GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGGGACAGAUAGAGUUAAAGUCCGUUACGUGGCCUAUG CGUGCUAGUGUGA SEQ ID NO: 47: GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGGUGAUAGAUAGAGUUAAAAUCGCUGAAUGGCCUAUGC GUGCUAGUGUGA SEQ ID NO: 48: GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGUGAAGAUAGAGAUAAAUCACAUACAGUCGGCCUAUGC GUGCUAGUGUGA [0099] Активності зв'язування хімази нуклеотидних кислот, показаних за допомогою SEQ ID NO: 3848, оцінювали за допомогою способу поверхневого плазмонного резонансу. В оцінюваннях для SEQ ID NO: 38-48, вимірювання проводили подібно до того, як описано у Прикладі 1. Розчин C використовували як рухомий буфер. Результати вимірювань наведені у Таблиці 2. Нуклеїнові кислоти, показані за допомогою SEQ ID NO: 38-48, були ідентифіковані як аптамери, що зв'язують хімазу, у значному ступені, більш сильно, ніж 30N. Було знайдено, що X1 та X2, що містяться у спільній послідовності SEQ ID NO: 21 можуть бути обидві A чи обидві G, та що N1N2, що міститься у спільній послідовності, може бути GU, GC, GA, або UU. Таблиця 2 Активність зв'язування для хімази SEQ ID NO: 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Довжина 72 72 73 72 72 72 72 72 72 72 72 активність зв'язування за допомогою Biacore ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ "++" вказує на послідовність, що зв'язує хімазу, значною мірою, більш сильно, ніж негативний контроль 30N. Тут, 30N являє собою нуклеїновокислотний пул, що використовували у 1-му раунді, що містить випадкову послідовність з 30 нуклеотидів. 20 25 30 35 40 Приклад 3: Визначення інгібіторної активності хімази за допомогою синтетичного субстрату Чи інгібують ферментну активність хімази нуклеїнові кислоти, показані за допомогою SEQ ID NO: 4-20, 22-34, та 38-48, було визначено, як описано нижче. Субстрат хімази, який використовували, був Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA (виготовлений Peptide INstitute, INc.), що містить 4-амінокислотний пептид Ala-Ala-Pro-Phe, стандартний субстрат для хімотрипсин-подбніх протеаз. Тут Suc являє собою захисну сукцинільну групу, та MCA являє собою 4-метилкумарил7-амідну групу; після розщеплення C-кінцевого боку фенілаланіну, вивільнювався AMC (7-аміно4-метилкумарін). Шляхом детекції флуоресценції цього AMC, може бути визначена ферментна активність хімази. Аналіз проводили з використанням планшету на 96 лунок (F16 Black MaXisorp FluoroNuNc, виготовлений NuNc), з об'ємом реакційної суміші 100 мкл, у розчин C як буферного розчину. Спочатку, кожну нуклеїнову кислоту послідовно розводили до 0,0027-2 мкМ концентрацій у розчині C з одержанням 50 мкл розчинів. Після додавання 10 мкл 1 мM субстрату, одержаного у розчині C, до нього, планшет встановлювали у мікропланшетний рідер SpectraMaX190 (виготовлений Molecular Devices CorporatioN), та інкубували при 37C протягом 5 хвилин. Окремо, 0,05 мкг (або 0,005 мкг) хімази (рекомбінантна, виготовлений SIGMA) розводили у розчині C з одержанням 40 мкл розчину хімази, та інкубували при 37C протягом 5 хвилин. Розчин хімази додавали до суміші нуклеїнової кислоти та субстрату для початку ферментної реакції. Кінцева концентрація хімази у реакційній суміші становила 16,7 нM (або 1,67 нM), кінцева концентрація субстрату становила 100 мкл. Планшет, що містив реакційну суміш, встановлювали у мікропланшетний рідер SpectraMaX190 (виготовлений Molecular 21 UA 107663 C2 5 10 Devices CorporatioN), та досліджували залежні від часу зімни інтенсивності флуоресценції при 37C протягом 5 хвилин (або 30 хвилин) (довжина хвилі збудження становила 380 нм, довжина хвилі детекції становила 460 нм). Лінійна апроксимація збільшення флуоресценції AMC, вивільненої з субстрату, генерувала активність хімази, та ї нахил був взятий як початкова швидкість (Vмакс). Для контролю, проби обробляли та аналізували аналогічно у двох випадках: застосування 30N або 40N (нуклеотиду з 30 або 40 послідовними основами, представленими N; N являє собою A, G, C чи T) нуклеїновокислотний пул (негативний контроль), та застосування хімостатину, відомого хімотрипсин-подібного інгібітору серинових протеаз (позитивний контроль). Беручи початкову швидкість реакції без нуклеїнової кислоти та інгібітору (V0) як 100 % ферментну активність, швидкість інгібування кожної тестової речовини розраховували за допомогою такого рівняння: Швидкість інгібування (%) = (1-Vмакс/V0)×100 Визначали концентрацію інгібітору, необхідну для спричинення 50 % інгібування ферментної активності (IC50). Результати наведені у Таблиці 3. 15 Таблиця 3 Інгібуюча активність проти хімази (IC50) SEQ ID NO: 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 22 23 24 IC50 [µМ] 0.049 ± 0.003 0.080 ± 0.039 0.456 ± 0.261 > 0.5 0.453 ± 0.463 0.273 ± 0.069 > 0.5 0.145 ± 0.036 0.128 ± 0.023 0.058 ± 0.024 0.061 ± 0.053 0.285 ± 0.021 > 0.5 0.092 ± 0.042 0.058 ± 0.021 0.163 ± 0.001 0.282 ± 0.013 0.105 ± 0.009 0.238 ± 0.060 0.092 ± 0.003 SEQ ID NO: 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 38 40 41 42 43 44 45 46 47 48 IC50 [µМ] 0.079 ± 0.028 0.106 ± 0.004 > 0.5 0.045 ± 0.004 > 0.5 0.147 ± 0.044 0.155 ± 0.039 0.235 ± 0.055 0.145 ± 0.088 0.137 ± 0.009 0.050 ± 0.012 0.140 ± 0.085 0.060 ± 0.017 0.124 ± 0.026 0.081 ± 0.050 0.049 ± 0.013 0.074 ± 0.011 0.038 ± 0.004 0.058 ± 0.012 0.095 ± 0.018 ">0.5" вказує, що інгібуюча активність не спостерігалася у діапазоні концентрацій до 0.5 мкM. Кожне значення IC50 є середнім значенням для 2-3 вимірювань. 20 25 30 Негативний контроль 30N або 40N не проявляв інгібуючої активності (IC50>0,5 мкM). Позитивний контроль хімостатин проявляв значення IC50 0,1 мкM-0,2 мкM. Підсумовуючи, багато з аптамерів, перелічених у Таблиці 3, проявляли інгібуючу активність проти хімази. Аптамери, що проявляють значення IC50 0,1 мкM чи менше, зокрема, можуть бути розглянуті як такі, що мають відмінний інгібуючий вплив. Аптамери, що містять спільну послідовність, показану за допомогою SEQ ID NO: 21, усі проявляли інгібуючу активність. Ці відкриття демонструють, що X1 та X2, що містяться у спільній послідовності, можуть бути обидва A чи обидва G, та що N1N2 можу бути будь-яким з GA, GU, GC, UU, та CU. Приклад 4: Усічення аптамеру Аптамери показані за допомогою SEQ ID NO: 4, 12, 13, та 14 були скорочені. Аптамери, показані за допомогою SEQ ID NO: 4, 13, та 14, містять спільну послідовність, показану за допомогою SEQ ID NO: 21. SEQ ID NO: 12 являє собою аптамер, що не містить таку спільну послідовність. Послідовності скорочених аптамерів наведені у SEQ ID NO: 49-57. передбачені вторинні структури аптамерів показані за допомогою SEQ ID NO: 49, 51, та 55-57 та наведені на 22 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фіг. 6, де кожна частина, сформована спільною послідовністю, показаною за допомогою SEQ ID NO: 21, включена у коло. Нижче наведені нуклеотиді послідовності, показані за допомогою SEQ ID NO: 49-57, відповідно. Якщо не вказано інше, такі індивідуальні послідовності наведені у напрямку від 5" до 3", з пуриновими основами (A та G), що знаходяться у 2'-OH формі, та піримідиновими основами (U та C), що знаходяться у 2'-фтор-модифікованій формі. SEQ ID NO: 49: (послідовність, одержана шляхом скорочення клону, показана за допомогою SEQ ID NO: 4 до 29-нуклеотидної довжини, включаючи спільну послідовність) GGUUCUACAGAUAGAGAUAAAGUAGAACC SEQ ID NO: 50: (послідовність, одержана шляхом скорочення клону, показана за допомогою SEQ ID NO: 4 до 35-нуклеотидної довжини, включаючи спільну послідовність) GGCAUUCUACAGAUAGAGAUAAAGUAGAAUUUAAC SEQ ID NO: 51: (послідовність, одержана шляхом скорочення клону, показана за допомогою SEQ ID NO: 12 до 45-нуклеотидної довжини) CGUUACAUAAUGUAUAUACCAGGGUAACUAAACAUAGAAGAGCGG SEQ ID NO: 52: (послідовність, одержана шляхом скорочення клону, показана за допомогою SEQ ID NO: 12 до 26-нуклеотидної довжини) CCGUAUAUACCAGGGUAACUAAACGG SEQ ID NO: 53: (послідовність, одержана шляхом скорочення клону, показана за допомогою SEQ ID NO: 13 до 42-нуклеотидної довжини, включаючи спільну послідовність) GGGUAACUAUGGUUAGAUAGAGUUAAAAACCAUAGAAGACCC SEQ ID NO: 54: (послідовність, одержана шляхом скорочення клону, показана за допомогою SEQ ID NO: 13 до 36-нуклеотидної довжини, включаючи спільну послідовність) UAACUAUGGUUAGAUAGAGUUAAAAACCAUAGAAGA SEQ ID NO: 55: (послідовність, одержана шляхом скорочення клону, показана за допомогою SEQ ID NO: 13 до 29-нуклеотидної довжини, включаючи спільну послідовність) CUAUGGUUAGAUAGAGUUAAAAACCAUAG SEQ ID NO: 56: (послідовність, одержана шляхом скорочення клону, показана за допомогою SEQ ID NO: 13 до 23-нуклеотидної довжини, включаючи спільну послідовність) GGGUUAGAUAGAGUUAAAAACCC SEQ ID NO: 57: (послідовність, одержана шляхом скорочення клону, показана за допомогою SEQ ID NO: 14 до 27-нуклеотидної довжини, включаючи спільну послідовність) GCAUUUGAGAUAGAUUUAAACAAACGC Усі нуклеїнові кислоти SEQ ID NO: 49-57 були синтезовані хімічно. Чи зв'язуються нуклеїнові кислоти з хімазою, визначали за допомогою способу поверхневого плазмонного резонансу. Вимірювання здійснювали за допомогою Biacore T100 (від GE Healthcare), як описано нижче. Приблизно 4000 УО хімази рекомбінантної, виготовленої SIGMA) іммобілізували на поверхні сенсорного чіпу CM5 чіпу, з використанням набору амінного сполучення. 20 мкл кожної нуклеїнової кислоти, одержаної при 0,3 мкМ, як аналіт, вприскували при швидкості потоку 20 мкл/хв. Розчин C використовували як рухомий буфер. Результати вимірювань, наведені у Таблиці 4. Спосіб оцінювання, який використовували, був подібний до способу, який використовували у Прикладі 1. У результаті, нуклеїнові кислоти, що відрізняються від SEQ ID NO: 52, були ідентифіковані як аптамери, що зв'язують хімазу значною мірою більш сильно, ніж контроль 40N (Таблиця 4). Сенсограму, де показано, яким чином аптамери, показані за допомогою SEQ ID NO: 13, 55, та 56, зв'язували хімазу, наведені на Фіг. 7. Інгібуючу активність хімази визначали подібно до Прикладу 3. Відповідні значення IC50 наведені у Таблиці 4. Нуклеїнові кислоти, що відрізняються від SEQ ID NO: 52, проявляли сильну інгібуючу активність (Таблиця 4). Результати для SEQ ID NO: 51 та 52 показали, що аптамер, показаний за допомогою SEQ ID NO: 12, що не містить спільну послідовність, зберігав свою активність 23 UA 107663 C2 5 10 після скорочення до 45-нуклеотидної довжини, та втрачав активність при скороченні до 26нуклеотидної довжини. У той же час, результати для SEQ ID NO: 56 продемонстрували, що аптамер, показаний за допомогою SEQ ID NO: 13, що містить спільну послідовність, може бути скорочений до 23нуклеотидної довжини. Це демонструє, що спільна послідовність, показана за допомогою SEQ ID NO: 21, є критичною для активності зв'язування та інгібуючої активності проти хімази. Оскільки SEQ ID NO: 49 та 57 також проявляли інгібуючу активність, було показано, що N1N2, що містився у спільній послідовності, не обмежено GU, та що відсутні обмеження щодо послідовності, що яка міститься у стволовій структурі SEQ ID NO: 56 на Фіг. 6, оскільки стволова структура зберігається. Ці аптамери розглядають як корисні в якості інгібіторів хімази. Таблиця 4 Активність зв'язування та інгібуюча активність для хімази (IC50) SEQ ID NO: 49 50 51 52 53 54 55 56 57 Номер ID послідовності вихідного клону 4 4 12 12 13 13 13 13 14 Довжина 29 35 45 26 42 36 29 23 27 активність зв'язування за допомогою Biacore ++ ++ ++ + ++ ++ ++ ++ ++ IC50 [μM] 0.117 ± 0.066 0.138 ± 0.093 0.024 ± 0.009 >1 0.066 ± 0.024 0.051 ± 0.033 0.055 ± 0.023 0.046 ± 0.031 0.099 ± 0.013 "++" представляє послідовність, що зв'язує хімазу значною мірою більш сильно, ніж негативний контроль 40N. "+" представляє послідовність, що зв'язує хімазу еквівалентно порівняно із негативним контролем 40N. Тут 40N представляє нуклеїновокислотний пул, використаний у 1-му раунді у Прикладі 1, що містить випадкову послідовність з 40 нуклеотидів. ">1" вказує на відсутність інгібуючої активності, що спостерігалася у діапазоні концентрацій до 1 мкM. Кожне IC50 є середнім значенням для 2-3 вимірювань. 15 20 25 30 35 Негативний контроль 40N не проявляє інгібуючу активність при концентраціях до 1 мкМ (IC50>1 мкM). Позитивний контроль хімостатину проявляв значення IC50 0,1 мкM-0,2 мкM. Підсумовуючи, нуклеїнові кислоти, перелічені у Таблиці 4, що відрізняються від SEQ ID NO: 52, проявляли інгібуючу активність проти хімази. Нуклеїнові кислоти, що проявляли значення IC50 0,1 мкM чи менше, зокрема, можуть бути описані як такі, що мають значний інгібуючий вплив. Приклад 5: Вплив заміщення, делеції основи(основ) скороченого аптамера Мутацію або делецію вводили в аптамер, показаний за допомогою SEQ ID NO: 56, та досліджували вплив на активність зв'язування та інгібуючу активність. Послідовності наведені у SEQ ID NO: 58-68. Нуклеотидні послідовності відповідних аптамерів, показані за допомогою такої SEQ ID NO: 58-68, наведені нижче. Якщо не вказано інше, відповідні послідовності, зазначені нижче, знаходяться у напрямку від 5" до 3", модифікація у 2'-положенні рибози (наприклад, U(F) показує модифікацію 2'-положення рибози урацилу з F) показана у дужках, та F являє собою атом фтору. SEQ ID NO: 58: (послідовність, що містить випадковим чином розміщені 13 основ нуклеїнових кислот, що містяться у спільній послідовності клону, показаному за допомогою SEQ ID NO: 56) GGGU(F)U(F)GAAGAU(F)AU(F)U(F)AAAGAAC(F)C(F)C(F) SEQ ID NO: 59: (послідовність, в якій N2, що міститься у спільній послідовності клону, показаному за допомогою SEQ ID NO: 56 є заміщеним) GGGU(F)U(F)AGAU(F)AGAGAU(F)AAAAAC(F)C(F)C(F) 24 UA 107663 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO: 60: (послідовність, в якій N2, що міститься у спільній послідовності клону, показаному за допомогою SEQ ID NO: 56, є заміщеним) GGGU(F)U(F)AGAU(F)AGAGC(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F) SEQ ID NO: 61: (послідовність, в якій N1, що міститься у спільній послідовності клону, показаному за допомогою SEQ ID NO: 56 є заміщеним) GGGU(F)U(F)AGAU(F)AGAU(F)U(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F) SEQ ID NO: 62: (послідовність, в якій X1 та X2, що міститься у спільній послідовності клону, показаному за допомогою SEQ ID NO: 56, є заміщеними) GGGU(F)U(F)GGAU(F)AGAGU(F)U(F)AAGAAC(F)C(F)C(F) SEQ ID NO: 63: (послідовність, в якій послідовність основ, що міститься у клоні, показаному за допомогою SEQ ID NO: 56, за виключенням спільної послідовності, є заміщеною) GC(F)U(F)AC(F)AGAU(F)AGAGU(F)U(F)AAAGU(F)AGC(F) SEQ ID NO: 64: (послідовність, в якій послідовність основ, що міститься у клоні, показаному за допомогою SEQ ID NO: 56, за виключенням спільної послідовності, є заміщеною) GU(F)C(F)AC(F)AGAU(F)AGAGU(F)U(F)AAAGU(F)GAC(F) SEQ ID NO: 65: (послідовність, в якій послідовність основ, що міститься у клоні, показаному за допомогою SEQ ID NO: 56, за виключенням спільної послідовності, є частково заміщеною або частково делетованою) GGC(F)AGAU(F)AGAGU(F)U(F)AAAGC(F)C(F) SEQ ID NO: 66: (послідовність, в якій пуринова основа, що міститься у спільній послідовності клону, показаному за допомогою SEQ ID NO: 56 є заміщеною на піримідинову основу) GGGU(F)U(F)AGAU(F)CGAGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F) SEQ ID NO: 67: (послідовність, в якій пуринова основа, що міститься у спільній послідовності клону, показаному за допомогою SEQ ID NO: 56 є заміщеною на піримідинову основу) GGGU(F)U(F)AGAU(F)ACAGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F) SEQ ID NO: 68: (послідовність, в якій пуринова основа, що міститься у спільній послідовності клону, показаному за допомогою SEQ ID NO: 56 є заміщеною на піримідинову основу) GGGU(F)U(F)AGAU(F)AGUGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F) Усі нуклеїнові кислоти SEQ ID NO: 58-68 одержували шляхом хімічного синтезу. Чи зв'язують нуклеїнові кислоти хімазу, оцінювали за допомогою способу поверхневого плазмонного резонансу подібно до того, як описано у Прикладі 4. Інгібуючу активність для хімази вимірювали аналогічно тому, як вимірювали у Прикладі 3. Результати наведені у Таблиці 5. У результаті, було знайдено, що нуклеїнові кислоти SEQ ID NO: 59-65 з показаних у Таблиці 5, зберігають сильні властивості зв'язування та сильну інгібуючу активність. Оскільки активність зв'язування та інгібуюча активність SEQ ID NO: 58 зменшувалися до майже того ж самого рівня, що й 40N/30N, застосований у Прикладах 1та 2, було показано, що спільна послідовність, показана за допомогою SEQ ID NO: 21, є важливою для зв'язування та інгібіторної активності для хімази. З цих результатів, SEQ ID NO: 58 використовували як негативний контроль скорченого аптамеру у наступних Прикладах (Приклади 5-9). З результатів SEQ ID NO: 59-61, було показано, що N1 та N2, що містяться у спільній послідовності, можуть бути будь-якими нуклеотидами, що являють собою, переважно, GU, GA, GC та UU. З результатів SEQ ID NO: 62, було показано, що X 1 та X2 можуть бути будь-якими нуклеотидами, що являють собою, переважно, A та G, більш переважно, обидва являють собою A або обидва являють собою G. З результатів SEQ ID NO: 63-65, було показано, що послідовність пар основ (наприклад, SEQ ID NO: 56 на Фіг. 6) стволової структури, що міститься там, за виключенням спільної послідовності, може бути будь-якими нуклеотидами, поки зберігається стволова структура, та довжина становить, переважно, 3 пар основ чи довше. З результатів SEQ ID NO: 66-68, важливість спільної послідовності була показана знову, оскільки введення мутації у спільну послідовність зменшує активність. 25 UA 107663 C2 Таблиця 5 Активність зв'язування хімази та хімаза-інгібуюча активність (IC50) SEQ ID NO: 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 активність зв'язування за допомогою Biacore + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + + IC50 [мкM] >1 0,038 ± 0,009 0,026 ± 0,006 0,023 ± 0,006 0,029 ± 0,004 0,023 ± 0,003 0,020 ± 0,005 0,056 ± 0,046 >1 >1 >1 В активності зв'язування, "++" вказує на значне зв'язування із хімазою, ніж SEQ ID NO: 58 що являє собою негативний контроль, та "+" вказує на аналогічний рівень зв'язування, як у SEQ ID NO: 58 що являє собою негативний контроль. В інгібуючій активності, ">1" вказує на відсутність інгібуючій активності у діапазоні концентрацій до 1 мкM. Значення IC50 є середнім значенням для двох вимірювань. 5 10 15 20 25 30 35 SEQ ID NO: 58 не вказує на інгібуючу активність у діапазоні концентрацій до 1 мкM (IC50>1 мкM). Додатково, значення IC50 хімостатину, що являє собою позитивний контроль, становило 0,1 мкM-0,2 мкM. Із зазначених вище результатів, очевидно, що, серед аптамерів, показаних у Таблиці 5, аптамери, показані за допомогою SEQ ID NO: 59-65, мають сильну хімаза-інгібуючу активність (IC501 0,111 ± 0,003