Спосіб визначення активності хімази у біологічних рідинах

Номер патенту: 32131

Опубліковано: 15.12.2000

Автор: Самохіна Любов Михайлівна

Завантажити PDF файл.

Текст

МПК С 12 Q 1/37, G 01 N 33/49 Спосіб визначення активності хімази у біологічних рідинах Винахід відноситься до біохімії і може бути використаний у нау кових дослідженнях в галузі медицини для вивчення альтернативного шляху утворення ангіотензина II з метою розробки способів контролю ефективності лікування серцево-судинних захворювань . Відомий Спосіб визначення активності протеїназ або їх інгібіто рів в біологічних рідинах (див. Пат. Росії N 1655991, МПК C12Q1/37) - прототип., який включає кон'югацію маркерного фермента з субстратом білкової природи , імобілізацію отриманого комплексу на поверхні по лістиролової твердої фази проведення протеолітичної реакції з нас , тупним усуненням продуктів реакції відмиванням і визначення залишко вої активності маркерного фермента . Недоліки: відомий спосіб не передбачає можливості диференційно го визначення хімотрипсинподібної протеїнази хімази. Задача: розробка способу, специфічного для визначення активнос ті хімази в біологічних рідинах. Поставлена задача вирішена автором шляхом кон'югації маркерного фермента з субстратом білкової природи імобілізації отриманого , комплексу на поверхні полістиролово'ї твердої фази Проводять протео. літичну реакцію, продукти реакції усувають відмиванням Визначають . залишкову активність маркерного фермента Здійснюють кон'югацію мар . керного фермента з субстратом із кінцевою послідовністю пролін-фені лаланін (Pro-Phe). Перед проведенням протеолітичної реакції пригні чують активність трипсиноподібних протеїназ добавленням інгібітора трипсина із сої у концентрації 0.01 мкг/мл. Відрізняючими ознаками є: - здійснюють кон'юга цію марк ерного ф ермента з субст ратом і з кінцевою послідовністю Pro-Phe; - перед проведенням протеолітичної реакції пригнічують актив ність трипсиноподібних протеїназ добавленням інгібітора трипсина із сої у концентрації 0.01 мкг/мл. Використання субстрату, який містить кінцеву послідовність Pro-Phe, забезпечує проведення специфічного визначення активності хімази в біологічних рідинах Вважають, що оптимальний субстрат для . хімази серця людини повинен містити структуру : Xaa-Pro-Phe, Туг або Trp-Yaa-Yaa, де Хаа - люба амінокислота, Yaa - люба амінокислота, крім Pro [1]. Відомо також, що хімотрипсин, який каталізує гідроліз багатьох пептидів або поліпептидів розриває тільки ті пептидні , зв'язки, в котрих карбонільна група належить залишкам фенілаланіна , тирозина або триптофана Тому для специфічного визначення хімотрип . синподібної протеїнази - хімази кращим субстратом можна вважати пеп тиди, які містять кінцеву послідовність Pro-Phe, наприклад, фрагмент 5-8 ангіотензина II. Пригнічення активності трипсиноподібних протеїназ перед про веденням протеолітичної реакції також сприяє підвищенню специфічності метода за рахунок зменшення загальної кількості протеїназ в біо логічних рідинах, в незначній мірі здатних руйнувати глобулярні біл ки, такі як маркерний фермент [23. Відрізняючі ознаки відповідають критерію "новизна" та вимогам винахідницького рівня. Дослідження по запропонованому способу проведені в Інституті терапії АМН України. Чутливість способу - 10 -10 г/мл. Відтвореність - ступінь вірогідності відмінностей не перевищує 5 %. Використання запропонованого способу в медичній практиці дозво лить проводити визначення хімази в біологічних рідинах . Запропонований спосіб здійснюють у такій послідовності : 1. Здійснюють кон'югацію маркерного фермента (пероксидази) з субстра том, який має к інцев у пос лідов ність Pro- Phe, напри клад з фрагментом 5-8 ангіотензина II. 2. Імобілізують утворений комплекс на поверхні полістиролових плашок. Неімобілізований комплекс відмивають дистильованою водою з 0.05 % твину-20. 3. Проводять протеолітичну реакцію. Для цього насамперед готують дослідні зразки наприклад: сиро, ватку крові людини розводять у 250 разів 0.01 М фосфатно-солевим буфером р Н 7.2 -7.6 з 0.0 5 % т вину- 20. Потім пригнічують активність трипсиноподібних протеїназ добав ленням інгібітора трипсина із сої (СІТ) у концентрації 0.01 мкг/мл 1:1 та інкубують при 37 °С протягом 5 хвилин. -з Утворену реакційну суміш вносять у лунки полістиролової плашки з імобілізованим комплексом пероксидаза-субстрат у контрольні зразки , вносять лише буфер. Інкубують при 37 °С протягом 15 хвилин. 4. Продукти реакції усувають відмиванням як вказано раніше . 5. Визначають залишкову активність маркерного фермента . Для цього у лунки плашок вносять суміш яка містить ортофені , лендіамін (ОФД) і пергідроль у 0.1 М цитратному буфері рН 4.5-4.6. 6. Зупиняють реакцію добавленням 50 % сірчаної кислоти. 7. Визначають оптичну густину контрольних і дослідних зразків за допомогою багатоканального мікроспектрофотометра при 490 нм. 8. Розраховують активність хімави по розщепленню субстрату у процентах зменшення оптичної густити у дослідних зразках порівняно з контролем, де активність імобілізованої пероксидази максимальна (100 %). Можливість здійснення запропонованого способу підтверджується прикладами визначення активності хімази в різних біологічних рідинах . Прикл ад 1 . Ви зна ченн я ак тивн ості хі мази в с иров атц і кр ові. Здійснюють кон'югацію пероксидази із фрагментом 5-8 ангіотензина II методом перйодатного окислення . Мобілізують утворений комплекс на полістиролових плашках шляхом вмсушення із розчину0.5 М бікарбонату амонію. Неімобілізовании комплекс відмивають 2-3 рази дистильованою водою з 0.05 % твину-20. Для проведення протеолітичної реакції окремо на титровальній дошці готують дослідні зразки сироватки крові , які розводять у 250 разів 0.01 М фосфатно-солевим буфером з 0.05 % твину-20. Додають у дослідні зразки 1:1 розчин СІТ у концентрації 0.01 мкг/мл та інкубують при 37 °С протягом 5 хвилин. Утворену реакційну суміш вносять у лунки полістиролової плашки з імобілізованим комплексом пероксидаза-субстрат , у контрольні зразки вносять лише буфер. Інкубують при 37 °С протягом 15 хвилин, а потім відмивають плашки як вказано раніше. Додають у лунки плашок суміш , яка містить 2 мг ОФД, 10 мкл пер гідролю у 12-15 мл 0.1 М цитратного буфера рН 4.5-4.6. Зупиняють реакцію добавленням 50 % сірчаної кислоти по 50 мкл у лунку. Оптичну густину визначають при 490 нм за допомогою багатока нального мікроспектрофотометра типу "Flow" (Великобританія). Розраховують активність хімази у процентах по розщепленню субс трата у дослідних зразках порівняно з контролем за формулою : -4В 100 ----- %, де А А - оптична густина контрольного зразку у одиницях екстинції В , - оптична густина дослідного зразку у одиницях екстинції 100 , коефіцієнт перерахунку у проценти. Висновок: використання запропонованого способу забезпечує ви значення хімази у сироватці крові. Приклад 2. Визначення активності хімази у цитозолі серця шурів . Здійснюють кон'югацію пероксидази із фрагментом 5-8 ангіотензина II методом перйодатного окислення Імобілізують утворений комп . лекс на полістиролових плашках шляхом висушення із розчину 0.5 М бікарбонату амонію. Неімобілізовании комплекс відмивають 2-3 рази дистильованою водою з 0.05 % твину-20. На титровальній дошці проводять реакцію пригнічення активності трипсиноподібних протеїназ для цьго додають у дослідні зразки 1:1 , розчин СП у концентрації 0.01 мкг/мл та інкубують при 37 °С протягом 5 хвилин. Утворену реакційну суміш вносять у лунки полістиролової плашки з імобілізованим комплексом пероксидаза-субстрат у контрольні зразки , вносять лише буфер. Інкубують при 37 °С протягом 15 хвилин, а потім відмивають плашки як вказано раніше. Додають у лунки плашок суміш, яка містить 2 мг ОФД, 10 мкл пергідролю у 12-15 мл 0.1 М цитратного буфера рН 4.5-4.6. Зупиняють реакцію доданням 50 % сірчаної кислоти по 50 мкл у лунку. Оптичну густину визначають при 490 нм за допомогою багатоканального мікрос пектрофотометра типу "Flow" (Великобританія). Розраховують активність хімази у процентах по розщепленню субс трату у дослідних зразках порівняно з контролем за формулою : В 100 ------ %, де А А - оптична густина контрольного зразку у одиницях екстинції , В - оптична густина дослідного зразку у одиницях екстинції , 100 - коефіцієнт перерахунку у проценти . Висновок: використання запропонованого способу забезпечує ви значення хімази у біологічних рідинах , наприклад у цитозолі серця щурів. Література. Multiple determinants for the high substrate specifity of an angiotensin II-forming chymase from the human heart /A.Kinoshita, H.Urata, F.M.Bumpus, A.Husain//Am.Rev.Respir.Dis.- 1991.- 143, N3 (Pt.2).- P.61-63. Andrews A.T. A new approach to the general detection and measurement of the proteinase and proteinase inhibitor activities//Bloch. et bioph. acta.- 1982.- 708.- P.194-202.

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

The method for determination of chymase activity in biological liquids

Автори англійською

Samokhina Lyubov Mykhaylivna

Назва патенту російською

Способ определения активности химазы в биологических жидкостях

Автори російською

Самохина Любовь Михайловна

МПК / Мітки

МПК: C12Q 1/37, G01N 33/49

Мітки: спосіб, рідинах, хімази, визначення, активності, біологічних

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/5-32131-sposib-viznachennya-aktivnosti-khimazi-u-biologichnikh-ridinakh.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб визначення активності хімази у біологічних рідинах</a>

Подібні патенти