Білки, які зв’язуються з b-амілоїдним пептидом та полінуклеотиди, що їх кодують

Ця заявка розкриває переваги попередньої заявки США №60/064583, поданої 16 квітня 1997 року, вміст якої включено тут як посилання. Даний винахід стосується нових полінуклеотидів та білків, що кодуються такими полінукпеотидами, поряд з терапевтичним, діагностичним та дослідницьким застосуванням цих полінуклеотидів та білків. Зокрема, даний винахід стосується полінуклеотидів та білків, що кодуються такими полінуклеотидами, які зв'язуються з β-амілоїдним пептидом, який є одним з первинних компонентів амілоїдних відкладень, пов'язаних з патогенезом хвороби Альцгеймера. Хвороба Альцгеймера (АD) - розлад, зв'язаний з прогресуючою деменцією у літніх людей, який характеризується рядом структурних аномалій головного мозку. У множинних ділянках центральної нервової системи (ЦНС) нейрони стають дисфункціональними та погибають, внаслідок чого відбувається зміна синоптичних шляхів. Тіла та проксимальні дендрити цих уразливих нейронів містять нейрофібрилярні клубки, які складаються з парних спіральних ниток, основним компонентом яких є фосфорилований білок, що зв'язується з мікротрубочками, позначений як «t-білок» (білок «тау»). Однією з суттєвих ознак даного захворювання є накопичення амілоїдних відкладень у межах головного мозку, які називаються старечими (або нейригними) бляшками. Принциповим компонентом амілоїдних бляшок є β-амілоїдний пептид (тут та надалі позначається «ВАР», а в літературі також відомий як «Αβ», «βΑΡ» та ін.), який утворює щільні скупчення у процесі розвитку AD. ВАР - білок, що складається з 39-43 амінокислот, який утворюється в результаті протеолітичного розщеплення із амілоїдного поліпепггида-попередника (тут та надалі позначається «АРР») і складається з частини трансмембранного домену та домену «просвіту ендоплазматичного ретикулума» АРР. Вважається, що пептид ВАР, який складається з 42 амінокислот (ВАР42), у людини є потенційно більш токсичною агрегованою формою. АРР зустрічається у вигляді кількох ВАР-вмісних ізоформ. Основні ізоформи складаються з 695, 751 та 770 амінокислот, при тому, що останні дві АРР включають домен, який має структурну та функціональну гомологію з інгібіторами серинової протеази Кюнітца. У здорових індивідуумів ВАР не накопичується і швидко видаляється з циркулюючих рідин організму. Однак пептид здатен утворювати бляшки на поверхні аномальних дендритів та аксонів, мікроглії та реактивних астроцитів. Агрегування та відкладання ВАР у вигляді нейритних бляшок розглядається як один із запускних механізмів розвитку хвороби Альцгеймера. Вивчення процесів, які призводять до експресії і функцій ВАР та їх власної ролі у патогенезі AD займає суттєву увагу в нейрологічних дослідженнях. Зокрема, відкриття білків, які можуть зв'язуватись з білком ВАР, є принциповим у зв'язку з розумінням патогенетичних шляхів цього захворювання і приводить до появи нових потенційних терапевтичних мішеней. До даного винаходу білки та їх фрагменти, які б зв'язувались з білком ВАР людини, і які могли б бути втягнені до біологічних ефектів ВАР у ході розвитку AD, ідентифіковані не були. Даний винахід представляє нові виділені полінуклеотиди, які кодують генні продукти, що вибірково зв'язуються з амінокислотними послідовностями β-амілоїдного пептиду людини (ВАР). В одному з варіантів даний винахід представляє композицію, що включає виділений поліпептид, який обирають з групи, що включає: (a) полінуклеотид, що включає нуклеотидну послідовність за SEQ ID NO 1; (b) полінуклеотид, який включає нуклеотидну послідовність білка, що зв'язується з р-амілоїдним пептидом (ВВР), клону ВВР1-Г1, внесеного під депозитарним номером АТСС 98617; (c) полінуклеотид, що кодує білок, який зв'язується з р-амілоїдним пептидом (ВВР), кодований вставкою кДНК клону ВВР1-П, внесеного під депозитарним номером АТСС 98617; (d) полінуклеотид, який включає нуклеотидну послідовність за SEQ ID NO 1 від 202-го нуклеотиду до 807го нуклеотиду; (e) полінуклеотид, який включає нуклеотидну послідовність білка, що зв'язується з р-амілоїдним пептидом (ВВР), клону рЕК196, внесеного під депозитарним номером АТСС 98399; (f) полінукпеотид, що кодує білок, який зв'язується з β-амілоїдним пегтгидом (ВВР), що кодується вставкою кДНК клону рЕК196, внесеного під депозитарним номером АТСС 98399; (д) полінукпеотид, що кодує білок, який включає амінокислотну послідовність за SEQ ID NO 2; (h) полінуклеотид, який кодує білок, що включає фрагмент амінокислотної послідовності за SEQ ID NO 2, який має активність по зв'язуванню з β-амілоїдним пептидом, тобто фрагмент, який включає амінокислотну послідовність від 68-ї амінокислоти до 269-ї амінокислоти згідно з SEQ ID NO 2; (j) полінукпеотид, який є алельним варіантом полінуклеотиду за nn.(a)-(f), описаним вище; (k) полінуклеотид, який кодує варіант, гомологічний білку за nn.(gHf), описаний вище; і (i) нуклеотид, здатний гібридизуватись у жорстких умовах з будь-яким полінуклеотидом за пп.(а)-(h). Краще такий полінуклеотид включає нуклеотидну послідовність за SEQ ID NO 1, нуклеотидну послідовність білка, який зв'язується з β-амілоїдним пептидом (ВВР) клону BBPI-fi, внесеного під депозитарним номером АТСС 98617, або полінуклеотид, що кодує білок, який зв'язується з β-амілоїдним пептидом, що кодується вставкою кДНК клону BBP1-f1, внесеного під депозитарним номером АТСС 98617. Інший варіант представляє ген, що відповідає послідовності кДНК за SEQ ID NO 1. За іншими варіантами даний винахід представляє композицію, що включає білок, при тому, що зазначений білок включає амінокислотну послідовність, яку обирають з групи, що включає: (a) амінокислотну послідовність за SEQ ID NO 2; (b) амінокислотну послідовність за SEQ ID NO 2 від 68-ї амінокислоти до 269-ї амінокислоти; (c) амінокислотну послідовність, що кодується вставкою кДНК клону ВВР1-Н, внесеного під депозитарним номером АТСС 98617; і (d) фрагменти амінокислотної послідовності за SEQ ID NO 2, які включають амінокислотну послідовність від 185-ї амінокислоти до 217-ї амінокислоти за SEQ ID NO2. Краще такий білок включає амінокислотну послідовність за SEQ ID NO 2 або амінокислотну послідовність за SEQ ID NO 2 від 68-ї амінокислоти до 269-ї амінокислоти. Злиті білки також формулюються даним винаходом. У ряді кращих варіантів полінуклеотид функціонально приєднаний до послідовності, що регулює експресію. Також даний винахід представляє клітину-хазяїна, включаючи бактеріальні, дріжджові клітини, клітини комах та ссавців, трансформовані такими полінуклеотидними композиціями. Також представляються способи вироблення ВВР, які включають (а) вирощування клітин-хазяїв за п.3 формули винаходу у придатному культуральному середовищі; і (b) очистку білка з культурального середовища. Також даним винаходом представляються композиції, які включають антитіло, специфічне щодо таких ВВР. Способи та діагностичні прийоми також представляються у зв'язку з виявленням захворювання, яке характеризується аномальною експресією білка ВАР людини, так само як і способи ідентифікації сполук, які беруть участь у регуляції активності ВАР. Інший варіант даного винаходу включає трансгенних тварин, які несуть полінуклеотид, що кодує ВВР, функціонально з'єднаний з послідовністю, що регулює експресію. Нижченаведені креслення характеризують деякі варіанти даного винаходу. Вони є виключно ілюстративними і ні в чому не обмежують даний винахід. Фігура 1. Тест на дигібридний дріжджовий скринінг. Штам хазяїна Y2H, що експресує ДНК-зв'язуючий домен Gal4, злитий з BAF42 (ВАРBD; плазміда, яка несе маркер TRP1) і незлитий ВАР42 (ВАР; плазміда, яка несе маркер URA3), був трансформований У2Н-бібліотекою кДНК клітин плодового головного мозку людини (плазміда, яка несе маркер LEU2), що експресує злиті білки («unknownAD»), які включають активаторний домен Gal4, згідно з описаним у цьому тексті. Відповідно, штами, що несуть три позахромосомні плазміди, позначені окружностями, експресували позначений білок. Позитивні міжбілкові взаємодії відновляють активність Gal4 по розташованій вище активаторній послідовності (GALL)AS), в результаті чого індукується транскрипція репортерного гена HIS3. Фігура 2. Виявлення зв'язування ВВР1/ВАР. Штами Y2H були тестовані на прототрофію по гістидину шляхом одержання 10-кратних серійних розведень та розхапуванням по 5мкл на синтетичне агарове середовище, позбавлене триптофану, лейцину, гістидину, яке містить 25мМ 3-амінотриазолу, у відповідності з описаним у цьому тексті. Усі штами несуть плазміду рЕК162, яка експресує злитий білок ВАР, що помічено міткою «ВАР». Перші стовпчики («вектор») відповідають незалежно сформованим штамам, які несуть плазміду рЕК162 та вектор рАСТ2, що експресує сторонній злитий білок. Цей варіант править за фон для порівняння із штамами, які експресують цікавлячі білки. Колонки, позначені «BBPIDtm», відповідають експресії укороченого ВВР1 з плазміди рЕК198 так, як це описано у цьому тексті. Взаємодія між злитими білками ВАР та BBPIDtm відновляють активність Gal4, в результаті чого відбувається індукування репортерного гена HIS3 (див. Фіг.1), що виявляється з посилення прототрофного росту порівняно з контрольними штамами. Фігура 3. Біотести, які показують взаємодію ВВР1 з Ga-білками. Гаданий внутріклітинний домен білка ВВР1 експресували як ДНК-зв'язуючий домен Gal4, з'єднаний з частинами факторів Gas, Gao або Gal2 щура, експресованими як злиті білки, що включають активаторний домен Gal4. Відповіді Y2H, які представляють два незалежно утворених клони кожного штаму, порівнювали з відповідями клітин, позбавлених G-білкового компонента (колонки «вектор»). Методика описана у легенді до Фіг.2. Фігура 4. Картування взаємодій між ВВР1 та ВАР. BBPIDtm був розділений на два сегменти, що перекриваються, у відповідності до описаного у цьому тексті. Ці білки, позначені ВВР1АС та ΒΒΡ1DΝ, були протестовані за їх взаємодією з ВАР. Протокол тестування та штами, позначені як «вектор» і «BBPIAtm», описані у легенді до Фіг.2. Штами, помічені як «ВВР1DС» та «ΒΒΡ1DΝ», експресують позначений сегмент ВВР1DС та ВВР1 у вигляді злитого білка. Фігура 5. Експресія мРНК ВВР1 у тканинах людини (А) та ділянках головного мозку (В). Нейлонові мембрани, на які було нанесено по 2мкг фракціонованої за розміром поліаденілованоГ РНК, виділеної з позначених тканин, були одержані від Clontech. їх гібридизували з радіоактивно поміченим зондом кДНК-ВВР1 так, як це описано у цьому тексті. Основний бенд, який відповідає 1250 пар нуклеотидів (визначено за маркерами молекулярної маси; дані тут не включені) був виявлений в усіх лініях. Більш високі значення молекулярної маси, по-видимому, відповідають гетероядерним РНК; ген ВВР1 включає кілька інтронів. Блоти були вивільнені і повторно зондовані b-актином з метою контролю завантаження та інтегрованості РНК: yd лінії виявили однаковий сигнал (дані сюди не включені). Фігура 6. Експресія ВВР1 та АРР ν клітинах гіпокзмпа. Представлені зображення авторентгенограм, одержаних в ході гібридизації in situ, які показують параметри експресії ВВР1 (А) та АРР (В) в гіпокампі та в енторинальній області кори головного мозку людини. Зрізи тканин, які використовувались для одержання цих зображень, були узяті при проведенні розтину двох різних пацієнтів. Скорочення: DG - зубчаста звивина кори головного мозку; СА1 - нижня область гіпокампу; ЕС - енторинальна область кори головного мозку. Фігура 7. Порівняння взаємодії ВВР1 з ВАР людини та гризуна. ВАР гризуна був сконструйований та експресований у вигляді злитого білка згідно з описом у цьому тексті. Штами, помічені «ВАР людини», ідентичні до тих, що були зображені на фіг.2. Штами, помічені «ВАР гризуна», експресують ВАР гризуна у вигляді злитого білка, що включає домен Gal4, який зв'язується з ДНК. «Вектор» визначає контрольні штами, що несуть лише вектор на протилежність злитим білкам ВАР; «ВВР1» визначає штами, що експресують злитий білок BBPIDtm. Даний винахід стосується виділення та клонування білка (ВВР1), що зв'язується з β-амілоїдним пептидом людини. ВВР1 був охарактеризований як злитий білок в дигібридному дріжджовому тесті із зв'язування з 42амінокислотним фрагментом ВАР (ВАР42). Експресія ВВР1 була продемонстрована у тканинах людини та у конкретних відділах головного мозку (фіг.5). Важливо, що для ВВР1 показана вибірковість у зв'язуванні з ВАР людини в системі дигібрвдного дріжджового тесту у порівнянні з ВАР гризуна. Ці дані підтверджують припущення про те, що ВВР1 за даним винаходом можуть бути використані у діагностиці та лікуванні хвороби Альцгеймера, так само як і для оцінки та скринінгу лікарських засобів, призначених для регуляції накопичення амілоїдних бляшок у головному мозку. Кодуюча послідовність ВВР1 Вихідний клон ВВР1 людини (позначений як «клон 14») був одержаний з використанням дигібридного дріжджового генетичного тесту (Y2H), розробленого для цілей ідентифікації білків, що взаємодіють з ВАР42 людини, який є потенційно більш токсичною формою ВАР. ВАР42 був експресований при злитті з доменом Gal4 дріжджів, який зв'язується з ДНК, і також був експресований у вигляді вільного пептиду (фіг.1). Цей штам був трансформований У2Н-бібліотекою кДНК плодового головного мозку людини. Єдиний клон, позначений як «№14», з приблизно мільйона незалежних трансформантів, обумовлював чітку активацію репортерного гена і включають відкриту кодуючу рамку, що переходить у домен GAL4. кДНК-вставка включала 984 пари основ і закінчувалась поліаденіловим трактом. Ця послідовність кодувала 201 амінокислоту (від 68-ї амінокислоти до 269-ї амінокислоти у відповідності до SEG ID NO 2) і мала дві ділянки, що характеризуються довжиною та рівнем гідрофобності, достатніми для проникнення скрізь клітинну мембрану. Також у її складі є потенційні сайти глікозилювання по залишкам аспарагіну (N-глікозилювання). «Клон 14» був позначений як клон рЕК196 і внесений до Американської колекції типових культур за депозитарним номером АТСС 98399. Похідна від бібліотеки плазміда була виділена з клону 14 і використана для реконструкції штамів, включених до тесту Y2H. Тестування цих штамів показало, що злитий білок ВАР специфічним чином взаємодіє з білком, що кодується клоном 14, хоч відповідь виявилась досить слабкою. З урахуванням того, що білкові домени, які мають високий рівень гідрофобності, такі як трансмембранні ділянки, пригнічують відповіді у тесті Y2H (Ozenberger, неопубліковані дані), то клон 14 був укорочений (з одержанням варіанта BBPIDtm: див. нижче табл.2 у зв'язку з подальшим описом) з метою видалення ділянки жорсткої гідрофобності з подальшим повторним тестуванням по взаємодії з ВАР. Суттєво більш потужна відповідь у тесті Y2H була відмічена з варіантом BBPIDtm: це підтверджує зауваження про те, що делеговані послідовності кодували можливий трансмембранний «якір» («tm»). Клон 14 ідентифікує новий білок, що зв'язується з ВАР, у формі злитого білка. Послідовності кДНК ВВР1, що находяться у клоні 14, були ідентифіковані як такі, що втратили 5'-кодуючу ділянку, на що вказує відсутність потенційного ініціюючого кодону метіоніну. Численні спроби застосування стандартного метода 5'-RACE («швидка ампліфікація кінців кДНК») із використанням звичайної зворотної транскриптази дали змогу додати лише 27 нуклеотидів. Таким чином, методика геномного клонування, описана нижче у прикладі 2, була застосована для виділення 5'-кінцевої ділянки. Оскільки послідовність, кодуюча 5'-кінцеву ділянку, є похідною від геномної бібліотеки, існує небезпека присутності у цій послідовності інтрона. Таку ймовірність було оцінено з використанням двох методів, описаних нижче у прикладі 2. Одержані в результаті дані підтверджують, що точність виділення лежачих вище послідовностей (як з геномних, так і з кДНК-джерел) і відсутність інтронів у цій ділянці. Плазміду ΒΒΡ1-f1, що включає вставку кДНК, яка кодує повнорозмірний білок ВВР1, було вкладено до Американської колекції типових культур за депозитарним номером АТСС 98617. Повна кодуюча ділянка та розшифрована послідовність поліпептиду показані у SEQ ID NO 1 та SEQ ID NO 2, відповідно. До складу вихідного клону 14 (рЕК196) включаються 3'-нуклеотидні послідовності, що не транслюються. Згідно з даним винаходом нуклеотидні послідовності, що кодують ВВР1, його фрагменти, злиті білки чи функціональні еквіваленти, можуть бути використані для формування рекомбінантних молекул ДНК, які б спрямовували експресію ВВР1 або функціонально активного пептиду у придатній кпітині-хазяїні. З іншого боку, нуклеотидні послідовності, що гібридизуються з фрагментами послідовності ВВР1, можуть бути використані у тестах з гібридизації нуклеїнових кислот, у Саузерн-блотингу, у Нозерн-блотингу і т.ін. Даний винахід також представляє полінуклеотиди, послідовності яких комплементарні до описаних у даному тексті полінуклеотидів. Також даний винахід представляє полінуклеотиди, здатні гібридизувати за умов зниженої жорсткості, ще краще за умов звичайної жорсткості і найкраще за умов високої жорсткості, з описаними у даному тексті полінуклеотидами. Приклади умов жорсткості гібридизації показані нижче у таблиці: умовами високої жорсткості є такі умови, які можуть бути зіставлені з тими, що наведені, наприклад, у графах A-F; умови звичайної жорсткості є принаймні настільки жорсткими, наскільки це показано, наприклад, у графах G-L; і умови зниженої жорсткості принаймні такі, як це показано, наприклад, у графах M-R. Таблиця 1 Умови жорсткості Довжина Температура Температура Умови Полінукпеотидний гібрида (пар та буфер та буфер жорсткості гібрид 1 нуклеотидів) гібридизації промивання 65°C1xSSC;aбo 65°СА ДНК/ДНК $50 42°C0,3xSSC 1xSSC; 50% формамід B ДНК/ДНК