Гуманізоване антитіло, яке розпізнає альфа-синуклеїн

Реферат: Винахід стосується антитіла, що специфічно зв'язується з альфа-синуклеїном людини, нуклеїнової кислоти, що кодує вказане антитіло, клітини-хазяїна, що містить зазначену нуклеїнову кислоту, фармацевтичної композиції, яка містить вказане антитіло, способу лікування та діагностики пацієнта, який має захворювання тілець Леві. UA 115439 C2 (12) UA 115439 C2 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресні посилання на споріднені заявки Дана заявка заявляє пріоритет за попередньою заявкою на патент США № 61/591,835, яка була подана 27 cічня 2012, і за попередньою заявкою на патент США № 61/711,207, яка була подана 8 жовтня 2012, зміст кожної з яких включено до цього опису як посилання у повному обсязі для використання з будь-якою метою. ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ Синуклеїнопатії, включаючи хвороби тілець Леві (LBD), характеризуються дегенерацією допамінергічної системи, змінами моторики, когнітивними порушеннями та утворенням тілець Леві (LB) та/або нейритів Леві (McKeith et al., Neurology (1996) 47:1113-24). Синуклеїнопатії включають хворобу Паркінсона (в т.ч. ідіопатичну хворобу Паркінсона), хворобу дифузних тілец Леві (DLBD), відому також як деменція з тільцями Леві (DLB), варіант хвороби Альцгеймера з тільцями Леві (LBV), комбіновану хворобу Альцгеймера та Паркінсона, первинну автономну недостатність та мультисистемну атрофію (MSA; напр., оливопонтоцеребелярна атрофія, стріатонегральна дегенерація і синдром Шая-Дрейджера). Вважають, що декілька немоторних ознак та симптомів є передвісниками синуклеїнопатій на продромальній стадії розвитку захворювання (тобто, пресимптоматичний, субклінічний, доклінічний або премоторний період). Такі ранні ознаки включають, наприклад, порушення поведінки під час сну зі швидким рухом очей (REM sleep behavior disorder (RBD), втрату сприйняття запаху та закріп (Mahowald et al., Neurology (2010) 75:488-489). Хвороби тілець Леві продовжують залишатись загальною причиною рухових розладів та когнітивної деградації серед населення похилого віку (Galasko et al., Arch. Neurol. (1994) 51:888-95). Альфа-синуклеїн є частиною великої родини білків, що включає також бета-, гама-синуклеїн і синоретин. Альфа-синуклеїн експресується у нормальному стані і пов'язаний з синапсами. Вважають, що він відіграє роль у нервовій пластичності, навчанні та запам'ятовуванні. Декілька досліджень відводять альфа-синуклеїну центральну роль у патогенезі хвороби Паркінсона. Білок може агрегуватись, утворюючи при патологічних станах нерозчинні фібрили. Наприклад, синуклеїн акумулюється в тільцях Леві (Spillantini et al., Nature (1997) 388:839-40; Takeda et al., J. Pathol. (1998) 152:367-72; Wakabayashi et al., Neurosci. Lett. (1997) 239:45-8). Мутації гена альфа-синуклеїну обумовлюють розвиток рідкісних форм родинного (спадкового) паркінсонізму (Kruger et al., Nature Gen. (1998) 18:106-8; Polymeropoulos, et al., Science (1997) 276:2045-7). Надекспресія альфа-синуклеїну у трансгенних мишей (Masliah et al., Science (2000) 287:1265-9) і Drosophila (Feany et al., Nature (2000) 404:394-8) імітує декілька патологічних аспектів хвороби тілець Леві. Крім того, було висловлено припущення, що ці розчинні олігомери синуклеїну можуть бути нейротоксичними (Conway et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:571–576; Volles et al., J. Biochemistry (2003) 42:7871–7878). Акумулювання альфа-синуклеїну з аналогічними морфологічними та нейрологічними змінами у видів та у тваринних моделях, таких як у людей, у мишей, мух, дає підставу висловити припущення, що ця сполука бере участь у розвитку хвороби тілець Леві. СУТЬ ВИНАХОДУ Винахід забезпечує антитіла, що містять зрілу варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка включає три CDR ділянки за Kabat SEQ ID №:44, і є, щонайменше, на 90 % ідентичною до SEQ ID №:44, і легкий ланцюг, що включає три CDR за Кабат SEQ ID №:45, і є, щонайменше, на 90 % ідентичним до SEQ ID №:45. У деяких антитілах, зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга є, щонайменше, на 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, або 99 % ідентичною до SEQ ID №:44 і зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга є, щонайменше, на 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичною до SEQ ID №: 45. У деяких антитілах положення L46 (нумерація за Kabat) може бути зайняте F; положення L49 (нумерація за Kabat) може бути зайняте C; положення L83 (нумерація за Kabat) може бути зайняте A; положення H11 (нумерація за Kabat) може бути зайняте L; положення H28 (нумерація за Kabat) може бути зайняте S; положення H38 (нумерація за Kabat) може бути зайняте K; положення H48 (нумерація за Kabat) може бути зайняте I; положення H67 (нумерація за Kabat) може бути зайняте A; положення H69 (нумерація за Kabat) може бути зайняте L; положення H71 (нумерація за Kabat) може бути зайняте A; та/або положення H91 (нумерація за Kabat) може бути зайняте F. У деяких таких антитілах, положення H97 (нумерація за Kabat) може бути зайняте S. У деяких таких антитілах амінокислотна послідовність зрілої варіабельної ділянки важкого ланцюга являє собою послідовність SEQ ID №:44, а зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга - SEQ ID №:45, за винятком того, що положення L46 (нумерація за Kabat) може бути зайняте L або F та/або положення L49 (нумерація за Kabat) може бути зайняте Y або C, та/або положення L83 (нумерація за Kabat) може бути зайняте F або A, та/або положення H11 (нумерація за Kabat) може бути зайняте V або L, та/або положення H28 (нумерація за Kabat) може бути зайняте T або S, та/або положення H38 1 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (нумерація за Kabat) може бути зайняте R або K, та/або положення H48 (нумерація за Kabat) може бути зайняте M або I, та/або положення H67 (нумерація за Kabat) може бути зайняте V або A, та/або положення H69 (нумерація за Kabat) може бути зайняте M або L, та/або положення H71 (нумерація за Kabat) може бути зайняте T або A, та/або положення H91 (нумерація за Kabat) може бути зайняте Y або F, та/або H97 (нумерація за Kabat) може бути зайняте Cor S. У деяких таких антитілах, положення H71 (нумерація за Kabat) зайняте A. У деяких таких антитілах, положення H67 (нумерація за Kabat) зайняте A, положення H71 (нумерація за Kabat) зайняте A. У деяких таких антитілах, положення L46 (нумерація за Kabat) зайняте F. У деяких таких антитілах, положення L46 (нумерація за Kabat) зайняте F, положення L49 (нумерація за Kabat) зайняте C. У деяких таких антитілах, положення L46 (нумерація за Kabat) зайняте F, положення L49 (нумерація за Kabat) зайняте Y. У деяких таких антитілах, положення H67 (нумерація за Kabat) зайняте A, положення H71 (нумерація за Kabat) зайняте A, L46 (нумерація за Kabat) зайняте F, а положення L49 (нумерація за Kabat) зайняте C. У деяких таких антитілах, положення H11 (нумерація за Kabat) зайняте L, а положення H38 (нумерація за Kabat) зайняте K. У деяких таких антитілах, положення H11 (нумерація за Kabat) зайняте V, а положення H38 (нумерація за Kabat) зайняте R. У деяких таких антитілах, положення H28 (нумерація за Kabat) зайняте S, положення H48 (нумерація за Kabat) зайняте I, положення H69 (нумерація за Kabat) зайняте L, положення H91 (нумерація за Kabat) зайняте F. У деяких таких антитілах, положення H28 (нумерація за Kabat) зайняте T, положення H48 (нумерація за Kabat) зайняте M, положення H69 (нумерація за Kabat) зайняте M, положення H91 (нумерація за Kabat) зайняте Y. У деяких таких антитілах, положення L83 (нумерація за Kabat) зайняте A. У деяких таких антитілах, положення L83 (нумерація за Kabat) зайняте F. У деяких таких антитілах, положення H97 (нумерація за Kabat) зайняте S. У деяких таких антитілах, положення H97 (нумерація за Kabat) зайняте C. У деяких таких антитілах, положення L46 (нумерація за Kabat) зайняте F, положення L49 (нумерація за Kabat) зайняте C, а положення L83 (нумерація за Kabat) зайняте A. У деяких таких антитілах, положення L46 (нумерація за Kabat) зайняте F, положення L49 (нумерація за Kabat) зайняте Y, а положення L83 (нумерація за Kabat) зайняте A. У деяких таких антитілах, положення L46 (нумерація за Kabat) зайняте F, положення L49 (нумерація за Kabat) зайняте C, а положення L83 (нумерація за Kabat) зайняте F. У деяких таких антитілах, положення L46 (нумерація за Kabat) зайняте F, положення L49 (нумерація за Kabat) зайняте Y, а положення L83 (нумерація за Kabat) зайняте F. У деяких таких антитілах, положення H11 (нумерація за Kabat) зайняте L, положення H28 (нумерація за Kabat) зайняте S, положення H38 (нумерація за Kabat) зайняте K, положення H48 (нумерація за Kabat) зайняте I, положення H67 (нумерація за Kabat) зайняте A, положення H69 (нумерація за Kabat) зайняте L, положення H71 (нумерація за Kabat) зайняте A, положення H91 (нумерація за Kabat) зайняте F, а положення H97 (нумерація за Kabat) зайняте C. У деяких таких антитілах, положення H11 (нумерація за Kabat) зайняте V, положення H28 (нумерація за Kabat) зайняте S, положення H38 (нумерація за Kabat) зайняте R, положення H48 (нумерація за Kabat) зайняте I, положення H67 (нумерація за Kabat) зайняте A, положення H69 (нумерація за Kabat) зайняте L, положення H71 (нумерація за Kabat) зайняте A, положення H91 (нумерація за Kabat) зайняте F, а положення H97 (нумерація за Kabat) зайняте C. У деяких таких антитілах, положення H11 (нумерація за Kabat) зайняте V, положення H28 (нумерація за Kabat) зайняте T, положення H38 (нумерація за Kabat) зайняте R, положення H48 (нумерація за Kabat) зайняте M, положення H67 (нумерація за Kabat) зайняте A, положення H69 (нумерація за Kabat) зайняте M, положення H71 (нумерація за Kabat) зайняте A, положення H91 (нумерація за Kabat) зайняте Y, а положення H97 (нумерація за Kabat) зайняте C. У деяких таких антитілах, положення H11 (нумерація за Kabat) зайняте V, положення H28 (нумерація за Kabat) зайняте S, положення H38 (нумерація за Kabat) зайняте R, положення H48 (нумерація за Kabat) зайняте I, положення H67 (нумерація за Kabat) зайняте A, положення H69 (нумерація за Kabat) зайняте L, положення H71 (нумерація за Kabat) зайняте A, положення H91 (нумерація за Kabat) зайняте F, а положення H97(нумерація за Kabat) зайняте S. У деяких таких антитілах, положення H11 (нумерація за Kabat) зайняте V, положення H28 (нумерація за Kabat) зайняте T, положення H38 (нумерація за Kabat) зайняте R, положення H48 (нумерація за Kabat) зайняте M, положення H67 (нумерація за Kabat) зайняте A, положення H69 (нумерація за Kabat) зайняте M, положення H71 (нумерація за Kabat) зайняте A, положення H91 (нумерація за Kabat) зайняте Y, а положення H97 (нумерація за Kabat) зайняте S. У деяких таких антитілах амінокислотна послідовність зрілої варіабельної ділянки важкого ланцюга інша, ніж SEQ ID №: 44, та амінокислотна послідовність зрілої варіабельної ділянки легкого ланцюга інша, ніж послідовність, позначена як SEQ ID №:45. Винахід також забезпечує антитіло, яке містить гуманізований важкий ланцюг, який містить три CDR ділянки за Kabat SEQ ID №:44 та гуманізований легкий ланцюг, який містить три CDR 2 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ділянки за Kabat SEQ ID №:45, за умови, що положення L46 (нумерація за Kabat) зайняте F та/або положення L49 (нумерація за Kabat) зайняте C та/або положення L83 (нумерація за Kabat) зайняте F, та/або положення H11 (нумерація за Kabat) зайняте V, та/або положення H28 (нумерація за Kabat) зайняте T, та/або положення H38 (нумерація за Kabat) зайняте R, та/або положення H48 (нумерація за Kabat) зайняте M, та/або положення H67 (нумерація за Kabat) зайняте A, та/або положення H69 (нумерація за Kabat) зайняте M, та/або положення H71 (нумерація за Kabat) зайняте A, та/або положення H91 (нумерація за Kabat) зайняте Y, та/або положення H97 (нумерація за Kabat) зайняте C. У деяких таких антитілах, положення L46 (нумерація за Kabat) зайняте F, а положення L49 (нумерація за Kabat) зайняте C. У деяких таких антитілах, положення H67 (нумерація за Kabat) зайняте A, а положення H71 (нумерація за Kabat) зайняте A. У деяких таких антитілах, положення L46 (нумерація за Kabat) зайняте F, положення H67 (нумерація за Kabat) зайняте A, положення H71 (нумерація за Kabat) зайняте A, а положення L49 (нумерація за Kabat) зайняте C. У деяких таких антитілах, положення H11 (нумерація за Kabat) зайняте V, а положення H38 (нумерація за Kabat) зайняте R. У деяких таких антитілах, положення H28 (нумерація за Kabat) зайняте T, положення H48 (нумерація за Kabat) зайняте M, положення H69 (нумерація за Kabat) зайняте M, а положення H91 (нумерація за Kabat) зайняте Y. У деяких таких антитілах, положення L49 (нумерація за Kabat) зайняте C, а положення L83 (нумерація за Kabat) зайняте F. У деяких таких антитілах, положення H28 (нумерація за Kabat) зайняте T, положення H48 (нумерація за Kabat) зайняте M, положення H69 (нумерація за Kabat) зайняте M, положення H91 (нумерація за Kabat) зайняте Y, положення L49 (нумерація за Kabat) зайняте C, а положення L83 (нумерація за Kabat) зайняте F. У деяких таких антитілах, положення H97 (нумерація за Kabat) зайняте C. У деяких таких антитілах, положення L46 (нумерація за Kabat) зайняте F, положення L49 (нумерація за Kabat) зайняте C, положення L83 (нумерація за Kabat) зайняте F, положення H11 (нумерація за Kabat) зайняте V, положення H28 (нумерація за Kabat) зайняте T, положення H38 (нумерація за Kabat) зайняте R, положення H48 (нумерація за Kabat) зайняте M, положення H67 (нумерація за Kabat) зайняте A, положення H69 (нумерація за Kabat) зайняте M, положення H71 (нумерація за Kabat) зайняте A, положення H91 (нумерація за Kabat) зайняте Y, а H97 (нумерація за Kabat) зайняте C. Винахід також забезпечує варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 % ідентичну до SEQ ID №:23, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, щонайменше на 90 % ідентичну до SEQ ID №:37. У деяких таких антитілах, зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга містить три CDR ділянки за Кабат SEQ ID №:23, а зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга містить три CDR ділянки SEQ ID №:37, а положення H67 (нумерація за Kabat) зайняте A, H71 (нумерація за Kabat) зайняте A, положення L46 (нумерація за Kabat) зайняте F, а положення L49 (нумерація за Kabat) зайняте C. У деяких таких антитілах, положення L83 (нумерація за Kabat) зайняте F. У деяких таких антитілах, положення H97 (нумерація за Kabat) зайняте C. У деяких таких антитілах, зрілий важкий ланцюг має щонайменше 95 % ідентичності послідовності до SEQ ID №:23, а зрілий легкий ланцюг має щонайменше 95 % ідентичності послідовності до SEQ ID №:37. У деяких таких антитілах, будьякі відмінності в межах гіперваріабельних ділянок CDR зрілої варіабельної ділянки важкого ланцюга і зрілої варіабельної ділянки легкого ланцюга від SEQ ID №: 52 та 60, відповідно, знаходяться в положеннях H60-H65. У деяких таких антитілах, KД для альфа-синуклеїну антитіла становить від приблизно 0,5 до 2 KД для альфа-синклеїну мишачого або химерного антитіла 1H7. У деяких таких антитілах, положення L83 (нумерація за Kabat) зайняте F або A, положення H11 (нумерація за Kabat) зайняте V, положення H28 (нумерація за Kabat) зайняте T, положення H38 (нумерація за Kabat) зайняте R, положення H48 (нумерація за Kabat) зайняте M, положення H67 (нумерація за Kabat) зайняте A, положення H69 (нумерація за Kabat) зайняте M, положення H71 (нумерація за Kabat) зайняте A, положення H91 (нумерація за Kabat) зайняте Y, а H97 (нумерація за Kabat) зайняте C. У деяких таких антитілах, положення L83 (нумерація за Kabat) зайняте F. У деяких таких антитілах, положення H97 (нумерація за Kabat) зайняте C. У деяких таких антитілах, будь-яка відмінність у каркасній області варіабельної ділянки зрілої варіабельної ділянки важкого ланцюга та SEQ ID №:23 знаходиться в одному або більше положеннях H11 (нумерація за Kabat), зайнятих V, H28 (нумерація за Kabat), зайнятому T, положенні H38 (нумерація за Kabat), зайнятому R, положенні H48 (нумерація за Kabat), зайнятому M, положенні H69 (нумерація за Kabat), зайнятому M, і положенні H91 (нумерація за Kabat), зайнятому Y. У деяких таких антитілах, будь-яка відмінність у каркасній області варіабельної ділянки зрілої варіабельної ділянки легкого ланцюга та SEQ ID №:37 – це положення L83 (нумерація за Kabat), зайняте F або A. У деяких таких антитілах, зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID 3 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 №:23, а зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:37. У деяких антитілах зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:44, а зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:45, 33, 35, 37 або 39. У деяких антитілах зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:19, а зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 45, 33, 35, 37 або 39. У деяких антитілах, зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:21, а зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:45, 33, 35, 37 або 39. У деяких антитілах, зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:23, а зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 45, 33, 35, 37 або 39. У деяких антитілах, зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:25, а зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 45, 33, 35, 37 або 39. У деяких антитілах, зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:27, а зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №: 45, 33, 35, 37 або 39. У будь-якому з вищенаведених антитіл зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга може бути злита з константною ділянкою важкого ланцюга, а зріла константна ділянка легкого ланцюга може бути злита з константною ділянкою легкого ланцюга. У будь-якому з вищенаведених антитіл константна ділянка важкого ланцюга може бути мутантною формою природної константної ділянки людини, яка має знижену здатність до зв'язування з Fcγ рецептором порівняно з природною константною ділянкою людини. У будь-якому з вищенаведених антитіл, константна ділянка важкого ланцюга може походити з IgG1 ізотипу людини. У деяких антитілах алотипом є G1m3. У деяких антитілах алотипом є G1m1. У деяких антитілах константна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:52, за умови, що C-термінальний залишок лізину може бути втрачений. У деяких антитілах константна ділянка легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:49. У деяких антитілах, зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга зливається з константною ділянкою важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:52, за умови, що C-термінальний залишок лізину може бути втрачений, а зріла константна ділянка легкого ланцюга зливається з константною ділянкою легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:49. У деяких антитілах, зрілий легкий ланцюг включає SEQ ID №:53, а зрілий легкий ланцюг включає SEQ ID №:56. Винахід також забезпечує нуклеїнову кислоту, яка кодує будь-яку з вищезгаданих зрілих варіабельних ділянок важкого ланцюга та/або будь-яку з вищезгаданих зрілих варіабельних ділянок легкого ланцюга, напр., SEQ ID №: 18, 20, 22, 24, 26, 32, 34, 36 або 38. Винахід також забезпечує клітину-хазяїна, яка містить вектор, що містить будь-яку з нуклеїнових кислот, описаних вище. Винахід також забезпечує фармацевтичну композицію, яка містить будь-яке із вищезгаданих антитіл. Винахід також забезпечує спосіб лікування пацієнта, що має захворювання тілець Леві або перебуває під ризиком захворювання на цю хворобу, що полягає у призначенні пацієнтові ефективної схеми застосування будь-якого із вищезгаданих антитіл. У деяких способах захворюванням є хвороба Паркінсона. У деяких способах, зниження когнітивної функції пацієнта інгібується. У деяких способах нейронні та/або аксональні агрегати альфа-синуклеїну зменшуються. У деяких способах синаптична та/або дендритна щільність зберігається. У деяких способах спосіб зберігає синаптофізин та/або MAP2 у пацієнта. Винахід також забезпечує спосіб зменшення утворення тілець Леві у пацієнта, що має хворобу тілець Леві або перебуває під ризиком захворювання на цю хворобу, що полягає у введенні пацієнтові ефективної кількості будь-якого із вищезгаданих антитіл. У деяких способах захворювання – це хвороба Паркінсона. У деяких способах інгібується зниження когнітивної функції у пацієнта. У деяких способах, нейронні та/або аксональні агрегати альфа-синуклеїну зменшуються. У деяких способах, невритична дистрофія у пацієнта зменшується. У деяких способах щільність синапсів та/або дендритів зберігається. У деяких способах спосіб зберігає синаптофізин та/або MAP2 у пацієнта. 4 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід також забезпечує спосіб інгібування агрегації синуклеїну або виведення тілець Леві або синуклеїнових аргегатів у пацієнтів, що мають хворобу тілець Леві або перебувають під ризиком її розвитку, що полягає у введенні пацієнтові ефективної кількості будь-якого із вищезазначених антитіл. У деяких способах захворювання – це хвороба Паркінсона. У деяких способах інгібується зниження когнітивної функції у пацієнта. У деяких способах, нейронні та/або аксональні агрегати альфа-синуклеїну зменшуються. У деяких способах, невритична дистрофія у пацієнта зменшується. У деяких способах, щільність синапсів та/або дендритів зберігається. У деяких способах, спосіб зберігає синаптофізин та/або MAP2 у пацієнта. Винахід також забезпечує спосіб визначення тілець Леві у пацієнта, що має хворобу тілець Леві або перебуває під ризиком захворювання на цю хворобу, що полягає у введенні пацієнтові ефективної кількості будь-якого із вищезгаданих антитіл, де антитіло зв'язується з тільцями Леві, а зв'язане антитіло виявляється. У деяких способах захворювання – це хвороба Паркінсона. У деяких способах антитіла є міченими. Винахід також забезпечує спосіб одержання антитіла, який полягає в культивуванні клітин, трансформованих за допомогою нуклеїнових кислот, що кодують важкі та легкі ланцюги антитіла, в результаті чого клітина секретує антитіло; очищенні антитіла від клітин культурального середовища; де антитіло – це будь-яке з антитіл, описаних вище. Винахід також забезпечує спосіб одержання клітинної лінії, що продукує антитіло, який полягає у введенні вектора, що кодує важкі та легкі ланцюги антитіла, і селективного маркера в клітини; розмноження клітин за умов для відбору клітин, що мають збільшену кількість копій вектора; виділення єдиної клітини із відібраних клітин; і створення банку клітин, клонованих з поодиноких клітин, відібраних на основі їх здатності забезпечувати вихід антитіла; де антитіло – це будь-яке з антитіл, описаних вище. Деякі серед цих методів також передбачають розмноження клітин за селективних умов та скринінг клітинних ліній, що має природну здатність 6 експресувати та секретувати щонайменше 100 мг/л/10 клітин/24 год. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ На ФІГ. 1 представлено вирівнювання амінокислотних послідовностей m1H7 з чотирма версіями зрілої варіабельної ділянки важкого ланцюга гуманізованого 1H7. BAC02037 (SEQ ID №:42) – це акцепторна послідовність VH людини. CDR ділянки згідно визначення за Kabat, підкреслені та виділені жирним шрифтом. На ФІГ. 2 представлено вирівнювання амінокислотних послідовностей m1H7 з чотирма версіями зрілої варіабельної ділянки легкого ланцюга гуманізованого 1H7. AAY33358 (SEQ ID №:43) - це акцепторна послідовність VL людини. CDR ділянки, згідно з визначенням за Kabat, підкреслені та виділені жирним шрифтом. На ФІГ. 3 A-C представлені результати аналізу кінетики зв'язування (Biacore) мишачого 1H7 (A), химерного 1H7 (B) та гуманізованого 1H7 Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv3 антитіл, відповідно. На ФІГ. 4 A-C представлені результати кінетичних параметрів зв'язування (ForteBio) гуманізованих антитіл 1H7 (Hu1H7VHv2-Hu1H7VLv4, Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv1, Hu1H7VHv3Hu1H7VLv2, Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv3, Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv4, Hu1H7VHv4-Hu1H7VLv1) та химерного 1H7 антитіла. На ФІГ. 5 представлені результати пасивної імунотерапії з використанням 1H7 на функцію пам'яті в тесті "Водний лабіринт Морріса". На ФІГ. 6 представлені результати пасивної імунотерапії з використанням 1H7 на "швидкість" та "похибки" при тестуванні за допомогою круглої перекладини. КОРОТКИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ SEQ ID №:1 - амінокислотна послідовність природного дикого типу альфа-синуклеїну людини. SEQ ID №:2 - послідовність домену неамілоїдного компонента (NAC) альфа-синуклеїну, як повідомлено Jensen et al. (Biochem. J. 310 (Pt 1): 91-94, 1995; GenBank accession number S56746). SEQ ID №:3 - послідовність домену неамілоїдного компонента (NAC) альфа-синуклеїну, як повідомлено Uéda et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11282-6, 1993). SEQ ID №:4 - це нуклеотидна послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга мишачого антитіла 1H7 (m1H7). SEQ ID №:5 - це амінокислотна послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга m1H7. SEQ ID №:6 - це нуклеотидна послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга m1H7. SEQ ID №:7 - це амінокислотна послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга m1H7. SEQ ID №:8 - це нуклеотидна послідовність зрілої варіабельної ділянки важкого ланцюга m1H7. 5 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 SEQ ID №:9 - це амінокислотна послідовність зрілої варіабельної ділянки важкого ланцюга m1H7. SEQ ID №:10 - це нуклеотидна послідовність зрілої варіабельної ділянки легкого ланцюга m1H7. SEQ ID №:11 - це амінокислотна послідовність зрілої варіабельної ділянки легкого ланцюга m1H7. SEQ ID №:12 - CDR1 ділянка (визначення за Kabat) важкого ланцюга m1H7. SEQ ID №:13-CDR2 ділянка (визначення за Kabat) важкого ланцюга m1H7. SEQ ID №:14-CDR3 ділянка (визначення за Kabat) важкого ланцюга m1H7. SEQ ID №:15-CDR1 ділянка (визначення за Kabat) легкого ланцюга m1H7. SEQ ID №:16-CDR2 ділянка (визначення за Kabat) легкого ланцюга m1H7 (визначення за Kabat). SEQ ID №:17-CDR3 ділянка (визначення за Kabat) легкого ланцюга m1H7. SEQ ID №:18 - нуклеотидна послідовність Hu1H7VHv1. SEQ ID №:19 - амінокислотна послідовність Hu1H7VHv1. SEQ ID №:20 - нуклеотидна послідовність Hu1H7VHv2. SEQ ID №:21 - амінокислотна послідовність Hu1H7VHv2. SEQ ID №:22 - нуклеотидна послідовність Hu1H7VHv3. SEQ ID №:23 – це амінокислотна послідовність Hu1H7VHv3. SEQ ID №:24 - нуклеотидна послідовність Hu1H7VHv4. SEQ ID №:25 - це амінокислотна послідовність Hu1H7VHv4. SEQ ID №:26 - нуклеотидна послідовність Hu1H7VHv5. SEQ ID №:27 - амінокислотна послідовність Hu1H7VHv5. SEQ ID №:28 – нуклеотидна послідовність сигнального пептиду Hu1H7VH. SEQ ID №:29 – амінокислотна послідовність сигнального пептиду Hu1H7VH. SEQ ID №:30 – нуклеотидна послідовність сигнального пептиду Hu1H7VH. SEQ ID №:31 - амінокислотна послідовність сигнального пептиду Hu1H7VH. SEQ ID №:32 - нуклеотидна послідовність Hu1H7VLv1. SEQ ID №:33 - амінокислотна послідовність Hu1H7VLv1. SEQ ID №:34 - нуклеотидна послідовність Hu1H7VLv2. SEQ ID №:35 - амінокислотна послідовність Hu1H7VLv2. SEQ ID №:36 – нуклеотидна послідовність Hu1H7VLv3. SEQ ID №:37 - амінокислотна послідовність Hu1H7VLv3. SEQ ID №:39 - амінокислотна послідовність Hu1H7VLv4. SEQ ID №:40 - нуклеотидна послідовність сигнального пептиду Hu1H7VL. SEQ ID №:41 - амінокислотна послідовність сигнального пептиду Hu1H7VL. SEQ ID №:42 - акцепторна послідовність BAC02037 (GI-21670055) людини, яка використовується для каркасної амінокислотної послідовності важкого ланцюга. SEQ ID №:43 – акцепторна послідовність AAY33358 (GI-63102905) людини, яка використовується для каркасної амінокислотної послідовності легкого ланцюга. SEQ ID №:44 – Hu1H7VH, який не має зворотніх мутацій або мутацій у CDR. SEQ ID №:45 – Hu1H7VL, який не має зворотніх мутацій або мутацій у CDR. SEQ ID №:46 – послідовність для альтернативних версій Hu1H7VH. SEQ ID №:47 - послідовність для альтернативних версій Hu1H7VL. SEQ ID №:48 - послідовність для альтернативних версій CDR3 Hu1H7VH. SEQ ID №:49 – константна ділянка легкого ланцюга Hu1H7 (з аргініном) (спільна для v1-v4). SEQ ID №:50 – константна ділянка важкого ланцюга Hu1H7 (IgG1; спільна для v1-v5). SEQ ID №:51 - константна ділянка легкого ланцюга Hu1H7 (без аргініну) (спільна для v1-v4). SEQ ID №:52 - константна ділянка важкого ланцюга Hu1H7 (G1m3 алотип). SEQ ID №:53 - версія 3 легкого ланцюга Hu1H7 (варіабельна ділянка + константна ділянка з аргініном). SEQ ID №:54 - версія 3 легкого ланцюга Hu1H7 (варіабельна ділянка + константна ділянка без аргініну). SEQ ID №:54 – версія 3 важкого ланцюга Hu1H7 (варіабельна ділянка + константна ділянка). SEQ ID №:56 - версія 3 важкого ланцюга Hu1H7 (варіабельна ділянка + константна ділянка; G1m3 алотип). SEQ ID №:57 - константна ділянка важкого ланцюга Hu1H7 (IgG2). SEQ ID №:58 - константна ділянка легкого ланцюга Hu1H7 (G1m1 алотип). 6 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ВИЗНАЧЕННЯ Моноклональні антитіла, як правило, забезпечуються в очищеному вигляді. Це означає, що антитіло здебільшого є щонайменше на 50 % в/о очищеним від білків та інших макромолекул, що утворюються у процесі їх виробництва або очищення, але не виключається можливість, що моноклональне антитіло поєднується з надлишком фармацевтичного носія(їв) або іншими носіями, призначеними для сприяння його використанню. Інколи моноклональні антитіла є щонайменше на 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 або 99 % в/о чистими від білків та інших макромолекул в результаті виробництва або очищення. Специфічне зв'язування моноклонального антитіла з його антигеном-мішенню означає 6 7 8 9 10 -1 афінність щонайменше 10 , 10 , 10 , 10 або 10 M . Специфічне зв'язування є істотно вищим за розмахом і відрізняється від неспецифічного зв'язування, поширюючись відносно, щонайменше, однієї неспорідненої мішені. Специфічне зв'язування може бути результатом утворення зв'язків між конкретними функціональними групами або конкретної просторової відповідності (напр., типу "замок-ключ"), тоді як неспецифічне зв'язування, як правило, є результатом дії Ван-дер-Ваальсових сил. Разом з тим, специфічне зв'язування не передбачає обов'язково, що моноклональне антитіло зв'язується з однію і лише однією мішенню. Основна структурна одиниця антитіла являє собою тетрамер, що складається із субодиниць. Кожен тетраметр включає дві ідентичні пари поліпептидних ланцюгів, кожна пара має один "легкий" (близько 25 кДа) і один "важкий" ланцюг (близько 50-70 кДа). Амінотермінальна частина кожного ланцюга включає варіабельну ділянку, утворену приблизно від 100 до 110 або більше амінокислотами, відповідальними передусім за розпізнавання антигена. Ця варіабельна ділянка початково експресується зв'язаною з сигнальним пептидом, здатним до відщеплення. Варіабельна ділянка без сигнального пептида інколи називається зрілою варіабельною ділянкою. Таким чином, наприклад, зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга означає варіабельну ділянку легкого ланцюга без сигнального пептида легкого ланцюга. Карбокситермінальна частина кожного ланцюга визначає константну ділянку, яка відповідає, насамперед, за ефекторну функцію. Легкі ланцюги класифікуються як каппа або лямбда. Важкі ланцюги класифікуються як гама, мю, альфа, дельта або епсилон, і визначають ізотип антитіла, такий як IgG, IgM, IgA, IgD і IgE, відповідно. В межах легкого та важкого ланцюгів варіабельні та константні ділянки з'єднуються за допомогою "J" ділянки, що утворена приблизно 12 або більше амінокислотами; причому важкий ланцюг також включає "D" ділянку, утворену приблизно 10 або більше амінокислотами. (Див. загалом, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7, що включені шляхом посилань у повному обсязі для використання з будь-якою метою). Зрілі варіабельні ділянки кожної пари легкий/важкий ланцюг утворюють зв'язуючий центр (сайт) антитіла. Таким чином, інтактне антитіло має два зв'язуючі сайти. За винятком біфункціональних або біспецифічних антитіл, два зв'язуючі сайти – це одне й те ж. Всі ланцюги виявляють ту ж загальну структуру щодо консервативних каркасних ділянок (FR), з'єднаних за допомогою трьох гіперваріабельних ділянок, які також мають назву ділянок, що визначають комплементарність до антигену, або CDR. CDR від двох ланцюгів із кожної пари вирівнюються каркасними ділянками, що робить можливим зв'язування зі специфічним епітопом. Від Nтермінальної до C-термінальної частини, як легкі, так і важкі ланцюги включають домени FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 і FR4. Розподіл амінокислот між кожним доменом відбувається відповідно до визначень Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (Національні Інститути здоров'я, Bethesda, MD, 1987 та 1991), або Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989). Kabat також забезпечує широко вживане правило нумерації (нумерація за Kabat), згідно з яким відповідним залишкам між різними важкими ланцюгами або між різними легкими ланцюгами надається той же номер (напр., H83 означає положення 83 за нумерацією Kabat у зрілій варіабельній ділянці важкого ланцюга; подібним чином, положення L36 означає положення 36 за нумерацією Kabat у зрілій варіабельній ділянці легкого ланцюга). Нумерація за Kabat використовується у всьому тексті при посиланні на положення у варіабельній ділянці антитіла, якщо однозначно не стверджується щось інше. Термін "антитіло" включає інтактні антитіла та їхні зв'язуючі фрагменти. Як правило, фрагменти конкурують з інтактним антитілом, з якого вони походять, за специфічне зв'язування з мішенню, включаючи окремі важкі ланцюги, легкі ланцюги Fab, Fab', F(ab') 2, F(ab)c, діатіла, Dabs, нанотіла та Fv. Фрагменти також можуть бути отримані за допомогою методик рекомбінантних ДНК або шляхом ферментативного або хімічного розділення інтактних імуноглобулінів. Термін "антитіло" може включати біспецифічне антитіло та/або гуманізоване антитіло. Біспецифічне або біфункціональне антитіло являє собою штучне гібридне антитіло, 7 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що має дві різні пари ланцюгів - важкий /легкий та два різних зв'язуючих сайти (див., напр., Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-53 (1992)). У деяких біспецифічних антитілах, дві різні пари важких/легких ланцюгів включають пару важкий/легкий ланцюги гуманізованого 1H7 та пару важкий/легкий ланцюги, що є специфічними до іншого епітопу на альфа-синуклеїні, ніж той, що зв'язується з 1H7. У деяких біспецифічних антитілах, одна пара важкий/легкий ланцюг являє собою гуманізоване антитіло 1H7, як далі розкрито нижче, а пара важкий /легкий ланцюг належить антитілу, що зв'язується з рецептором, який експресується на гематоенцефалічному бар'єрі, таким як інсуліновий рецептор, рецептор інсуліноподібного фактору росту (IGF), лептиновий рецептор або ліпопротеїновий рецептор, або, переважно, рецептор трансферину (Friden et al., PNAS 88:4771-4775, 1991; Friden et al., Science 259:373-377, 1993). Таке біспецифічне антитіло може бути перенесене через гематоенцефалічний бар'єр шляхом рецептор-опосередкованого трансцитозу. Поглинання мозком біспецифічного антитіла може також бути підсилене шляхом конструювання біспецифічного антитіла для зниження його афінності до рецепторів гематоенцефалічного бар'єру. Знижена афінність щодо рецептора призводить до ширшого розповсюдження в мозку (див., напр., Atwal. et al. Sci. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011; Yu et al. Sci. Trans. Med. 3, 84ra44, 2011). Типові біспецифічні антитіла можуть також бути (1) антитілом з подвійним варіабельним доменом (DVD-Ig), де кожен легкий ланцюг і важкий ланцюг містить два варіабельні домени у тандемі через короткий пептидний зв'язок (Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) Tandab – антитілом, утвореним від злиття двох одноланцюгових димерних антитіл (діатіл), що призводить до утворення тетравалентного біспецифічного антитіла, яке має два зв'язуючі сайти для кожної мішені-антигена; (3) флекситілом, що являє собою комбінацію scFvs з димерним антитілом, що призводить до утворення мультивалентної молекули; (4) так званою "стиковочною" молекулою (за типом "dock and lock"), основаною на "димеризації та докінгу домена" у протеїнкіназі A, яка, при застосуванні щодо Fabs, може дати тривалентне бiспецифічне зв'язування білка, яке містить два ідентичні Fab фрагменти, зв'язані з різним Fab фрагментом; (5) так званою Скорпіон-молекулою, що включає, напр., два scFvs, злиті з обома кінцевими ділянками людської Fc-ділянки. Приклади платформ, що використовуються для отримання біспецифічних антитіл, включають, але не обмежені ними, BiTE (Micromet), DART (MacroGenics), Fcab та Mab2 (F-star), Fc-сконструйовані IgGl (Xencor) або DuoBody (основана на обміні Fab плечей, Genmab). Термін "епітоп" стосується сайта на антигені, з яким антитіло зв'язується. Епітоп може бути утворений послідовними або непослідовними амінокислотами, які виявляються суміжними ("накладаються одна на одну") при утворенні третинної структури одного або більше білків. Епітопи, утворені послідовними амінокислотами, як правило, зберігаються після обробки денатуруючими розчинниками; натомість епітопи, утворені в результаті третинної конформації, переважно втрачаються під впливом денатуруючих розчинників. Епітоп зазвичай включає щонайменше 3, а зазвичай більше, щонайменше 5 або 8-10 амінокислот, що мають унікальну просторову конформацію. Способи визначення просторової конформації епітопів включають, наприклад, рентгенівську кристалографію та 2-вимірний ядерно-магнітний резонанс. Див., напр., Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). Антитіла, які розпізнають ті ж епітопи або епітопи, що перекриваються, можуть бути ідентифіковані за допомогою простого імуноферментного аналізу, що виявляє здатність одного антитіла конкурувати за зв'язування іншого антитіла з антигеном-мішенню. Епітоп антитіла також може бути визначений за допомогою рентгенівської кристалографії антитіла, зв'язаного з його антигеном для ідентифікації контактних залишків. Альтернативно, два антитіла мають той же епітоп, якщо всі амінокислотні мутації в антигені, які зменшують або елімінують зв'язування одного антитіла, зменшують або елімінують зв'язування іншого. Два антитіла мають епітопи, які перекриваються, якщо деякі амінокислотні мутації, що зменшують або елімінують зв'язування одного антитіла, зменшують або елімінують зв'язування іншого. Конкуренція між антитілами визначається за допомогою тесту, в якому досліджуване антитіло інгібує специфічне зв'язування референс-антитіла зі звичайним антигеном (див., напр., Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). Досліджуване антитіло конкурує з референсантитілом, якщо надлишок досліджуваного антитіла (напр., щонайменше 2x, 5x, 10x, 20x або 100x) інгібує зв'язування еталонного референс-антитіла щонайменше на 50 %, але переважно на 75 %, 90 % або 99 % при вимірюванні у тесті конкурентного зв'язування. Антитіла, ідентифіковані за допомогою конкурентного аналізу (конкуруючі антитіла), включають антитіла, що зв'язуються з тим же епітопом, що й референс-антитіло, та антитіла, які зв'язуються з 8 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 прилеглим епітопом, достатньо близько розташованим до епітопу, зв'язаного референсантитілом, для того щоб мала місце стерична невідповідність. "Пацієнт" включає людину або іншого ссавця, що отримує профілактичне або терапевтичне лікування. З метою класифікації амінокислотних замін як консервативних, так і неконсервативних, амінокислоти групуються наступним чином: Група I (з гідрофобними бічними ланцюгами): метионін (met), аланін (ala), валін (val), лейцин (leu), ізолейцин (ile); Група II (з нейтральними гідрофільними бічними ланцюгами): цистеїн (cys), серин (ser), треонін (thr); Група III (з кислотними бічними ланцюгами): аспарагінова кислота (asp), глутамінова кислота (glu); Група IV (з основними бічними ланцюгами): аспарагін (asn), глутамін (gln), гістидин (his), лізин (lys), аргінін (arg); Група V (із залишками, що впливають на орієнтацію ланцюга): гліцин (gly), пролін (pro); і Група VI (з ароматичними бічними ланцюгами): триптофан (trp), тирозин (tyr), фенілаланін (phe). Консервативні заміщення включають заміщення між амінокислотами одного класу. Неконсервативні заміщення включають заміщення члена одного з цих класів на члена іншого класу. Відсоток ідентичності послідовностей визначається за допомогою послідовностей антитіла, максимально вирівняного згідно правила нумерації Kabat. Після вирівнювання, якщо ділянка антитіла суб'єкта (напр., ціла зріла варіабельна ділянка важкого або легкого ланцюга) порівнюється з тією ж ділянкою референс-антитіла, відсоток ідентичності послідовності між ділянками антитіла суб'єкта та референс-антитіла являє собою кількість положень, які зайняті тими ж амінокислотами, що й у суб'єкта, так і в ділянці референс-антитіла, розділена на загальну кількість вирівняних положень обох ділянок (при цьому пробіли не враховуються), помножена на 100, для того щоб перевести значення у відсотки. Композиції або способи, "що включають" один або більше з наведених елементів, можуть включати й інші елементи, які окремо не були перелічені. Наприклад, композиція, що включає антитіло, може містити лише антитіло або в комбінації з іншими інгредієнтами. Позначення інтервалу значень включає всі цілі значення в межах або окреслюючи інтервал у певних межах, та всі підінтервали, визначені цілими значеннями в межах цього інтервалу. Якщо щось інше не є очевидним із контексту, термін "приблизно" охоплює значення в межах середньої квадратичної похибки (СКП) встановленого значення. Особа перебуває під підвищеним ризиком розвитку захворювання, якщо суб'єкт має щонайменше один з відомих факторів ризику (напр., генетичний, біохімічний, позитивний родинний анамнез, ситуаційна експозиція), що дає підставу відносити особи, що перебувають під цим фактором ризику, до групи осіб з істотно вищим ризиком розвитку захворювання, ніж особи, що не мають цього фактора ризику. Термін "симптом" стосується суб'єктивних даних (доказів) щодо захворювання, таких як змінена хода, у сприйнятті пацієнта. "Ознака" стосується суб'єктивних даних (доказів) захворювання у сприйнятті лікаря. Статистична значущість означає p0,05. "Когнітивна функція" стосується ментальних процесів, таких як будь-який або всі процеси, що пов'язані з увагою, запам'ятовуванням, відтворюванням та розумінням мови, вирішенням проблем і виявленням інтересу до власного оточення та здатність себе обслуговувати. "Підсилення когнітивної функції" або "покращення когнітивної функції" стосується покращення відносно початкового значення, наприклад, часу встановлення діагнозу або початку лікування. "Погіршення когнітивної функції" стосується зниження функції відносно того ж початкового значення. У тваринних модельних системах, таких як щур або миша, когнітивна функція може бути виміряна за допомогою методів, включачи ті, що базуються на використанні лабіринта, в якому суб'єкти використовують просторову інформацію (напр., водний лабіринт Морріса, круглий лабіринт Барнеса, піднятий радіальний лабіринт, T-подібний лабіринт та інші), система Fear conditioning для дослідження страху, cистема для вивчення активного уникнення, освітлене відкрите поле, прилад для вимірювання активності в темноті, піднятий хрестоподібний лабіринт, тест з використанням двохкамерної установки або тест на вимушене плавання. У людини оцінка когнітивної функції може бути проведена за допомогою одного або декількох стандартизованих тестів. Приклади тестів або аналізів для оцінки когнітивної функцій були описані (Ruoppila, l. and Suutama, T. Scand. J. Soc. Med. Suppl. 53,44-65, 1997) і включають стандартизовані психометричні тести (напр., шкалу оцінки пам'яті Векслера, шкалу оцінки інтелекту для дорослих Векслера (Wechsler Adult Intelligence Scale), прогресивні матриці Равенна (Raven's Standard Progressive Matrices), тест Шайє-Терстоуна для оцінки розумових здібностей у дорослих (Schaie-Thurstone Adult Mental Abilities Test), нейропсихологічні тести 9 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (напр., Лурії-Небраска), самооцінку метакогнітивної активності (напр., опитувальник для діагностики рівня розвитку метапам'яті (Metamemory Questionnaire)), візуально-просторові скринінг-тести (напр., "фігури Поппельрейтера" (зображення, що перекриваються), розпізнавання годинника, рисунок у вигляді бджолиних стільників та викреслювання), когнітивні скринінг-тести (напр., короткий тест оцінки психічного стану Фольштейна (Folstein's Mini Mental State Test) і тест на час реакції. Інші стандартні тести для оцінки когнітивної функції включають оціночну шкалу порушень при хворобі Альцгеймера (ADAS-cog, когнітивна субшкала); шкалу оцінки змін клініцистом на основі опитувань та даних помічника пацієнта (шкала CIBIC-plus); шкалу оцінки повсякденної діяльності при хворобі Альцгеймера в ході сумісного дослідження (ADCS-ADL); коротку шкалу оцінки психічного статусу (MMSE); нейропсихіатричне опитування (Neuropsychiatric Inventory, NPI); клінічну шкалу стадій розвитку деменцій (CDR); Кембриджську нейропсихологічну автоматизовану батарею тестів (CANTAB) або геріатричну шкалу клінічної оцінки фірми Сандос (SCAG), тест Струпа (Stroop Test), тест стеження (Trail Making), вербальний тест Векслера (Wechsler Digit Span) та комп'ютеризований когнітивний тест CogState. Крім того, оцінка когнітивної функції може бути здійснена за допомогою методик нейровізуалізації, таких як позитронно-емісійна томографія (PET), функціональна магнітнорезонансна томографія (fMRI), однофотонна емісійна комп'ютерна томографія (SPECT), або будь-яких інших методик цифрової візуалізації, що дають змогу будь-кому провести визначення функції мозку. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ I. ЗАГАЛЬНА ЧАСТИНА Винахід забезпечує гуманізовані 1H7 антитіла (Hu1H7 антитіла). Антитіла використовуються для лікування та діагностики захворювання з тільцями Леві. II. МОЛЕКУЛИ-МІШЕНІ Природний альфа-синуклеїн дикого типу людини становить собою пептид, що складається зі 140 амінокислот, розташованих у наступній послідовності: MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL GKNEEGAPQE GILEDMPVDP DNEAYEMPSE EGYQDYEPEA (SEQ ID №:1) (Uéda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11282-6, 1993; інвентаризаційний номер GenBank: P37840). Білок має три розпізнані домени, домен KTKE повторів охоплює амінокислоти 1-61, домен NAC (неамілоїдний компонент) простягається уздовж 60-95 амінокислот, а C-термінальний кислотний домен простягається приблизно від 98 до 140 амінокислоти. Jensen et al. було виявлено, що NAC має наступну амінокислотну послідовність: EQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFV (SEQ ID №: 2) (Jensen et al., Biochem. J. 310 (Pt 1): 91-94, 1995; інвентаризаційний номер GenBank S56746). Uéda et al. було виявлено, що NAC має амінокислотну послідовність: KEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGS (SEQ ID №: 3) (Uéda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11282-6, 1993). Якщо щось протилежне не випливає із контексту, посилання на альфа-синуклеїн або його фрагменти включає амінокислотні послідовності дикого природного типу людини, визначені вище, та їх людські алельні варіанти, насамперед ті, що пов'язані з хворобою тілець Леві (напр., E46K, A30P і A53T, перша літера означає амінокислоту в послідовності SEQ ID №:1, номер – це положення кодону в послідовності SEQ ID №:1, а друга літера – це амінокислота в алельному варіанті). Такі варіанти можуть необов'язково бути присутні поодинці або у будь-якій комбінації. Індуковані мутації E83Q, A90V, A76T, які посилюють агрегацію альфа-синуклеїну, можуть також бути присутні окремо або у комбінації одна з одною та/або в алельних варіантах людини E46K, A30P та A53T. III. Захворювання, що супроводжуються утворенням тілець Леві Захворювання з утворенням тілець Леві (LBD) характеризується дегенерацією допамінергічної системи, змінами моторики, когнітивними порушеннями та утворенням тілець Леві (LB) (McKeith et al., Neurology (1996) 47:1113-24). Тільця Леві – це сферичні білкові відкладення, які виявляють у нервових клітинах. Їх присутність у мозку порушує нормальне функціонування мозку, перериваючи дію хімічних месенджерів, включаючи ацетилхолін та допамін. Захворювання тілець Леві включають хворобу Паркінсона (в т.ч. ідіопатичну хворобу Паркінсона), хворобу дифузних тілець Леві (DLBD), відому також як деменція з тільцями Леві (DLB), варіант хвороби Альцгеймера, що супроводжується утворенням тілець Леві (LBV), комбіновану хворобу Альцгеймера та Паркінсона та мультисистемну атрофію (MSA; напр., оливопонтоцеребелярна атрофія, стріатонегральна дегенерація і синдром Шая—Дрейджера). DLBD має симптоми як хвороби Альцгеймера, так і хвороби Паркінсона. DLBD відрізняється від хвороби Паркінсона головним чином локалізацією тілець Леві. У випадку DLBD тільця Леві 10 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 утворюються головним чином в корі. При хворобі Паркінсона вони утворюються головним чином у чорній речовині (субстанція нігра). Інші типи деменції з тільцями Леві включають первинну автономну недостатність, дисфагію, обумовлену деменцією з тільцями Леві, спорадичну деменцію з тільцями Леві, спадкову деменцію з тільцями Леві (напр., мутації гену альфасинуклеїну, PARK3 та PARK4). IV. Антитіла винаходу A. Специфічність зв'язування та функціональні властивості Гуманізовані антитіла винаходу специфічно зв'язуються з людським альфа-синуклеїном. Афінність деяких гуманізованих антитіл (тобто, Ka) може бути, наприклад, у п'ять разів або вдвічі перевищувати афінність мишачого антитіла (m1H7). Деякі гуманізовані антитіла мають ту ж афінність (в межах стандартної похибки експерименту), що й m1H7. Деякі гуманізовані антитіла мають вищу афінність, ніж мишаче антитіло m1H7. Кращі гуманізовані антитіла зв'язуються з тим же епітопом та/або конкурують з мишачим антитілом m1H7 за зв'язування з альфа-синуклеїном людини. B. Гуманізовані антитіла Гуманізоване антитіло – це генетично сконструйоване антитіло, в якому CDR ділянки, які походять від "донорного" антитіла, що не належить людині, "прищеплюються" до "акцепторних" послідовностей антитіла людини (див., напр., Queen et al., US5,530,101 та 5,585,089; Winter et al., US 5,225,539, Carter, US 6,407,213, Adair, US 5,859,205 та 6,881,557, і Foote, US 6,881,557). Акцепторною послідовністю антитіла може бути, наприклад, послідовність зрілої варіабельної ділянки антитіла людини, поєднання цих послідовностей, консенсусна послідовність послідовностей варіабельної ділянки антитіла людини (напр., консенсусні послідовності за Кабат варіабельної ділянки легкого та важкого ланцюгів, 1991, вище), або послідовність варіабельної ділянки ембріональної лінії. Прикладом акцепторної послідовності для важкого ланцюга є зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга людини з інвентарним номером NCBI BAC02037 (GI: 21670055). Ця акцепторна послідовність включає дві гіперваріабельні ділянки CDR, що мають ті ж канонічні форми, що й важкий ланцюг мишачого 1H7, і мають ідентичність послідовності, що становить 65,8 % у каркасі варіабельної ділянки важкого ланцюга. Якщо використовуються різні акцепторні послідовності, такою акцепторною послідовністю може бути, наприклад, інша зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга, що походить від зародкової лінії VH1-18, або послідовність зрілої варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає одну з цих послідовностей зародкових ліній. Краща акцепторна послідовність для важкого ланцюга – це зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга з інвентарним номером NCBI-AAC50998 (GI: 1791009) або інша зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга, що походить від ембріональної лінії IGHV3-7'01 або IGHV3-7'02 (назви клонів V3-7 або VH3-11) (Glas et al., Clin Exp Immunol. 107:372-80, 1997) або послідовність зрілої варіабельної ділянки важкого ланцюга, що включає одну з цих ембріональних послідовностей. Для легкого ланцюга, прикладом акцепторної послідовності є зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга з інвентарним номером NCBI-AAY33358 (GI:63102905). Ця акцепторна послідовність включає дві гіперваріабельні ділянки CDR, що мають ті ж канонічні форми, що й легкий ланцюг мишачого 1H7, і мають ідентичність послідовності, що становить 65,4 % у каркасі варіабельної ділянки легкого ланцюга. Якщо використовуються різні акцепторні послідовності, такою акцепторною послідовністю є, переважно, інша зріла послідовність легкого ланцюга, що походить від зародкової лінії A30 або послідовність зрілої варіабельної ділянки легкого ланцюга, що включає одну з цих послідовностей зародкових ліній. Гуманізоване антитіло винаходу – це антитіло, що має три CDR ділянки легкого ланцюга та важкого ланцюга, як визначено за Кабат, від донорного антитіла 9E4, і каркасну послідовність зрілої варіабельної ділянки та константніділянки, якщо присутні, що повністю або значною мірою повністю походять від антитіла людини. Гуманізоване антитіло винаходу – це антитіло, що має три CDR ділянки легкого ланцюга та важкого ланцюга, як визначено за Кабат, які повністю або значною мірою повністю походять від донорного мишачого антитіла 1H7, та каркасні послідовності зрілої варіабельної ділянки та константні ділянки, якщо присутні, що повністю або значною мірою повністю походять від послідовностей антитіла людини. Аналогічним чином, гуманізований важкий ланцюг являє собою важкий ланцюг, що має три CDR ділянки важкого ланцюга, як визначено за Кабат, що повністю або значною мірою повністю походять від важкого ланцюга мишачого антитіла 1H7, і зрілу варіабельну послідовність важкого ланцюга та послідовність константної ділянки важкого ланцюга, якщо присутня, що повністю або значною мірою повністю походять від послідовності важкого ланцюга антитіла людини. Подібним чином, гуманізований легкий ланцюг являє собою легкий ланцюг, що має три CDR 11 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ділянки легкого ланцюга, за визначенням Кабат, що повністю або значною мірою повністю походять від легкого ланцюга антитіла m1H7, зрілу варіабельну послідовність легкого ланцюга та послідовність константної ділянки легкого ланцюга, якщо присутня, що повністю або значною мірою повністю походять від послідовності легкого ланцюга антитіла людини. Ділянка CDR значною мірою походить від m1H7, якщо щонайменше 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % залишків є ідентичними до відповідних залишків у відповідній CDR антитіла m1H7. Зріла каркасна послідовність варіабельної ділянки ланцюга антитіла або послідовність константної ділянки ланцюга антитіла значною мірою походять з каркасної послідовності зрілої варіабельної ділянки людини або послідовності константної ділянки людини, відповідно, причому, щонайменше 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % відповідних залишків, визначених за Кабат, є ідентичними. Дослідження такого можливого впливу здійснюється шляхом моделювання, вивченням характерних особливостей амінокислот у конкретному положенні або емпіричними спостереженнями впливу заміщення або мутагенезу конкретних амінокислот. Деякі амінокислоти з каркасних залишків зрілої варіабельної ділянки людини можуть бути відібрані для заміщення, ґрунтуючись на їх можливому впливові на конформацію CDR та/або на зв'язування з антигеном, опосередкуванні взаємодії між важкими та легкими ланцюгами, взаємодії з константною ділянкою; залишки, що є місцем для бажаної або небажаної посттрансляційної модифікації; залишки, які займають незвичне положення в послідовності варіабельної ділянки, а, отже є потенційно імуногенними, серед інших чинників. Наступні 11 положень каркасної частини варіабельної ділянки були розглянуті як кандидати для заміщень через один або більше цих чинників, що додатково конкретизовано в Прикладах (L46F, Y49C, F83A, V11L, T28S, R38K, M48I, V67A, M69L, T71A, Y91F). Тут, як і в будь-якому іншому місці, перший вищезгаданий залишок гуманізованого антитіла, утвореного "прищепленням" гіперваріабельних ділянок CDR за Kabat в каркасну частину акцепторної послідовності людини, а другий вищезгаданий залишок – це залишок, що розглядається для заміщення такого залишка. Таким чином, в межах каркасних частин варіабельної ділянки, перший зазначений залишок належить людині, а в межах гіперваріабельних ділянок перший зазначений залишок – мишачий (напр., C97S). Амінокислотні заміщення можуть бути проведені в CDR ділянках. Одна із можливих замін полягає у заміщенні певних залишків у CDR ділянках мишачого антитіла 1H7 відповідними залишками послідовностей CDR ділянок людини, як правило, з CDR ділянок акцепторних послідовностей людини, використаних при конструюванні типових гуманізованих антитіл. У деяких антитілах лише частина CDR ділянок, а саме сукупність залишків CDR для зв'язування, які називаються SDR (амінокислотні залишки CDR, що визначають специфічність взаємодії з антигеном) необхідні для того, щоб зберегти у гуманізованого антитіла здатність до зв'язування. Залишки CDR ділянок, які не контактують з антигеном, і не знаходяться в межах SDR ділянок, можуть бути ідентифіковані, ґрунтуючись на результатах попередніх досліджень (наприклад, залишки H60-H65 в CDR H2 часто непотрібні), з ділянок CDR за Kabat, які лежать поза межами "гіперваріабельних петель" згідно з Chothia (Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987), шляхом молекулярного моделювання та/або емпіричним шляхом, або, як описано у Gonzales et al., Mol. Immunol. 41:863 (2004). В таких гуманізованих антитілах у положеннях, в яких один або більше залишків донорних CDR відсутні, або втрачається ціла донорна CDR, амінокислота, яка займає положення, може бути амінокислотою, що займає відповідне положення (за нумерацією Kabat) в акцепторній послідовності антитіла. Кількість таких заміщень в акцепторній послідовності, що можуть бути включені в донорні амінокислотні послідовності CDR ділянок, відображає рівновагу (баланс) конкурентної здатності. Такі заміщення мають потенційну перевагу, яка полягає у зменшенні кількості мишачих амінокислот у гуманізованому антитілі, а відтак і у зниженні потенційної імуногенності. Однак, можуть також викликати зміни афінності, а бажаним є уникнення істотного зниження афінності. Положення для заміщення в межах гіперваріабельних ділянок та амінокислот, які мають бути заміщені, можуть бути відібрані емпіричним шляхом. Однією з причин для проведення заміщення в межах CDR є те, що мишачий залишок являє собою сайт посттрансляційної модифікації, яка може впливати на експресію або "збирання" антитіла. Так, положення H97 в межах CDRH3 ділянки, яке зайняте C в мишачому антитілі 1H7, було ідентифіковане як місце для заміщення. Одинадцять зворотних мутацій в каркасі варіабельної ділянки та 1 заміщення в межах CDR ділянки, відмічені вище, можуть бути введені в гуманізовані антитіла 1H7 в різних варіантах. Варіабельна ділянка важкого ланцюга таких антитіл може бути представлена послідовністю, яка включає QVQLVQSGAE-X1-KKPGASVKVSCKASGY-X2-FTSYYIHWV-X3-QAPGQGLEW-X4GWIYPGSGNTKYSEKFKGR-X5-T-X6-T-X7-DTSTSTAYMELRSLRSDDTAVY-X8-CARDG-X9 12 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 YGFAYWGQGTLVTVSS, де -X1- являє собою V або L; -X2- являє собою S або T; -X3- являє собою R або K; -X4- являє собою M або I; -X5- являє собою V або A; -X6- являє собою M або L; X7- являє собою T або A; -X8- являє собою Y або F; -X9- являє собою C, M, S, або T (SEQ ID №:46). У деяких варіабельних ділянках важких ланцюгів, -X9- являє собою C. Деякі варіабельні ділянки легкого ланцюга можуть бути представлені послідовністю, що включає DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPK-Z1-LI-Z2AASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPED-Z3-ATYYCQQSNEDPFTFGQGTKLEIK, де -Z1являє собою L або F; -Z2- являє собою Y або C; -Z3- являє собою F або A (SEQ ID №:47). У деяких антитілах варіабельна ділянка важкого ланцюга включає SEQ ID №: 46, а варіабельна ділянка легкого ланцюга включає SEQ ID №:47. Наприклад, залишки X 1 та X3 послідовності SEQ ID №: 48 є V та R, відповідно. Наприклад, залишки, X 5- та X7 послідовності SEQ ID №:46 є A, а залишок Z1 послідовності SEQ ID №:47 являє собою F. Наприклад, залишки, -X4, X6, та X8 послідовності SEQ ID №:46 є M, M, та Y, відповідно, а залишок Z 2 та Z 3 SEQ ID №:47-C та F, відповідно. Наприклад, залишки X2 та X9 послідовності SEQ ID №: 48 становлять T і C, відповідно. Деякі антитіла містять заміщення в обох важких ланцюгах та в обох легких ланцюгах. Наприклад, положення H67 зайняте A, H71 зайняте A, положення L46 зайняте F, a положення L49 зайняте C. У деяких антитілах, зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:23. У деяких антитілах, зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:37. Наприклад, у H3L3 (Hu1H7VHv3 (SEQ ID №:23-Hu1H7VLv3 (SEQ ID №:37)), зріла варіабельна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:23, a зріла варіабельна ділянка легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:37. Винахід забезпечує варіанти гуманізованого антитіла H3L3, в якому зріла варіабельна ділянка гуманізованого важкого ланцюга виявляє щонайменше 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичності послідовнності до SEQ ID №:23, а зріла варіабельна ділянка гуманізованого легкого ланцюга виявляє щонайменше 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичності послідовності до SEQ ID №:37. Деякі такі гуманізовані антитіла включають три варіабельні ділянки CDR важкого та легкого ланцюгів, які повністю або істотно ідентичні CDR ділянкам H3L3, що є такими ж, як і в мишачому донорному антитілі. CDR ділянки можуть бути визначені за допомогою будь-якого з традиційних визначень (напр., згідно з Chothia), однак, переважно, вони можуть бути визначені за Kabat. Деякі варіанти H3L3 гуманізованого антитіла зберігають деякі або всі зворотні мутації в H3L3. Іншими словами, щонайменше, 1, 2, 3 або краще всі 4 з наступних є прийнятними: H67 зайняте A, H71 зайняте A, L46 зайняте F, а положення L49 зайняте C. Крім зберігання щонайменше 1, 2, 3 або, переважно, всіх 4 зворотніх мутацій в H3L3, гуманізовані 1H7 антитіла можуть також містити додаткові зворотні мутації в каркасах варіабельної ділянки. Приклади таких зворотних мутації включають: H11 займає L, H28 займає S, H38 займає K, H48 займає I, H69 займає L, H91 займає F, та/або L83 займає A. Для відбору зворотних мутацій для терапевтичного або діагностичного продукту, кожен повинен мати на увазі ступінь, до якого вони загалом не покращують афінність та ступінь, до якого, введення якомога більшої кількості мишачих залишків може призвести до підвищення ризику імуногенності. Наприклад, H3L1 включає зрілу варіабельну ділянку важкого ланцюга SEQ ID №:23, і легкого ланцюга - SEQ ID №:33. Наприклад, H4L1 включає зрілу варіабельну ділянку важкого ланцюга SEQ ID №:25, та легкого ланцюга - SEQ ID №:33. Іншою можливістю для варіювання є використання різних акцепторних послідовностей людини, як обговорювалось вище. Заміщення в гіперваріабельних ділянках CDR можливе, як описано вище, наприклад, в положенні H97, однак перед відбором таких заміщень для терапевтичного або діагностичного продукту, слід мати на увазі потенційний вплив на афінність та експресію антитіла. Якщо положення H97 в мишачих CDRH3 зайняте іншим залишком, ніж цистеїн, воно переважно зайняте M, S або T. Деякі антитіла включають гуманізований важкий ланцюг, який містить Kabat CDR1-SEQ ID №:12: SYYIH; Kabat CDR2-SEQ ID №:13: WIYPGSGNTKYSEKFKG; Kabat CDR3-SEQ ID №:48: DG-X9-YGFAY, де –X9– являє собою C, M, S, або T, більш переважно, C. Деякі антитіла включають гуманізований легкий ланцюг, який містить Kabat CDR1-SEQ ID №:15: KASQSVDYDGDSYMN; Kabat CDR2-SEQ ID №:16: AASNLES; Kabat CDR3-SEQ ID №:17: QQSNEDPFT. Деякі антитіла включають гуманізований важкий ланцюг, який містить три CDR ділянки за Kabat: SEQ ID №:15-17. У деяких таких антитілах, гуманізований важкий ланцюг 13 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 містить три CDR ділянки за Kabat: SEQ ID №:12-14 і гуманізований легкий ланцюг містить три CDR ділянки за Kabat: SEQ ID №:15-17. Винахід також забезпечує гуманізовані 1H7 антитіла, в яких зріла варіабельна ділянка гуманізованого важкого ланцюга виявляє щонайменше 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичності послідовності або є на 100 % ідентичною до SEQ ID №: 19, 21, 23, 25, та 27, а зріла варіабельна ділянка гуманізованого легкого ланцюга виявляє щонайменше 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичності послідовності або є на 100 % ідентичною до будь-якої з послідовностей SEQ ID №: 33, 35, 37 і 39. Різні зміни (переміщення) 11 зворотних мутацій каркасної частини варіабельної ділянки і 1 мутації в межах CDR ділянки, описані вище, можуть бути введені в гуманізовані антитіла 1H7. У деяких таких антитілах, положення L46 зайняте L або F (переважно F) та/або положення L49 зайняте Y або C (переважно C), та/або положення L83 зайняте F або A, та/або положення H11 зайняте V або L, та/або положення H28 зайняте T або S, та/або положення H38 зайняте R або K, та/або положення H48 зайняте M або I, та/або положення H67 зайняте V або A (переважно A), та/або положення H69 зайняте M або L, та/або положення H71 зайняте T або A (переважно A), та/або положення H91 зайняте Y або F, та/або положення H28 зайняте S або T, та/або положення H97 зайняте C або M, або S, або T (переважно C). У деяких таких антитілах, деякі або всі зворотні мутації в Hu1H7VLv1-v4 та Hu1H7VHv1-v5 зберігаються. Переважно, зберігаються зворотні мутації в положеннях L46, H67 та H71. Іншими словами, положення L46 зайняте F, положення H67 зайняте A, a положення H71 зайняте A. Більш переважно, зберігаються зворотні мутації в положеннях L46, L49, H67 та H71. Іншими словами, положення L46 зайняте F, положення L49 зайняте C, положення H67 зайняте A, а положення H71 зайняте A. У деяких антитілах, деякі або всі положення у важкому ланцюзі H11, H28, H38, H48, H67, H69, H71, та/або H91 зайняті L, S, K, I, A, L, A та F відповідно. Аналогічним чином, у деяких антитілах деякі або всі положення L46, L49 та/або L83 в легкому ланцюзі зайняті F, C та A відповідно. У деяких антитілах, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або всі 10 положень H11, H28, H38, H48, H67, H69, H71, H91, L46, L49 та L83 зайняті L, S, K, I, A, L, A, F, F, C та A, відповідно. У деяких антитілах, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, або 7 положень змінюються у каркасі зрілої варіабельної ділянки важкого ланцюга порівняно з SEQ ID №:44, і 0, 1, 2, або 3 положення змінюються у каркасі зрілої варіабельної ділянки легкого ланцюга порівняно з SEQ ID №:45. У деяких таких антитілах, положення H97 зайняте C. Переважно, гуманізоване антитіло має K Д для альфа-синуклеїну, що становить приблизно від 0,5 до 2,0 цього значення для мишачого або химерного антитіла 1H7. У деяких антитілах, положення L46 зайняте F, положення H67 зайняте A, положення H71 зайняте A, положення H11 зайняте V, а положення H38 зайняте R. У деяких таких антитілах положення L49 зайняте Y. Більш переважно, у деяких таких антитілах положення L49 зайняте C. У деяких таких антитілах положення L83 зайняте F. У деяких таких антитілах положення L83 зайняте A. У деяких таких антитілах положення H97 зайняте C. У деяких таких антитілах положення H28 зайняте T або S, положення H48 зайняте M, положення H69 зайняте M, а положення H91 зайняте Y. У деяких таких антитілах положення H28 зайняте T або S, положення H48 зайняте M, положення H69 зайняте M, а положення H91 зайняте F. У деяких таких антитілах положення H28 зайняте T або S, положення H48 зайняте M, положення H69 зайняте L, а положення H91 зайняте Y. У деяких таких антитілах положення H28 зайняте T або S, положення H48 зайняте M, положення H69 зайняте L, а положення H91 зайняте F. У деяких таких антитілах положення H28 зайняте T або S, положення H48 зайняте I, положення H69 зайняте M, а положення H91 зайняте Y. У деяких таких антитілах положення H28 зайняте T або S, положення H48 зайняте I, положення H69 зайняте M, а положення H91 зайняте F. У деяких таких антитілах положення H28 зайняте T або S, положення H48 зайняте I, положення H69 зайняте L, а положення H91 зайняте Y. У деяких таких антитілах положення H28 зайняте T або S, положення H48 зайняте I, положення H69 зайняте L, а положення H91 зайняте F. У деяких таких антитілах положення H11 зайняте L, та/або положення H38 зайняте K, та/або положення H97 зайняте S. У будь-якому з вищенаведених антитіл інші амінокислотні заміщення можуть бути проведені в каркасі зрілої варіабельної ділянки, наприклад, у залишках, що не контактують з гіперваріабельними ділянками CDR. Часто заміщення, здійснені у варіантах гуманізованих послідовностей, є консервативними стосовно заміщених амінокислот. У деяких антитілах, заміщення стосовно Hu1H7VLv1-v4 та Hu1H7VHv1-v5 (консервативні або неконсервативні) не виявляють істотного впливу на зв'язуючу афінність або здатність отриманого антитіла стосовно Hu1H7VLv1-v4 та Hu1H7VHv1-v5, а отже і на їх здатність зв'язувати альфа-синуклеїн людини. 14 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Варіанти антитіл, як правило, відрізняються від послідовностей зрілих варіабельних ділянок важкого та легкого ланцюгів Hu1H7VLv1-v4 та Hu1H7VHv1-v5 меншою кількістю (напр., зазвичай не більше, ніж 1, 2, 3, 5 або 10 в каркасній частині зрілої варіабельної ділянки легкого або важкого ланцюга, або обох ланцюгів) заміщень, делецій або інсерцій. C. Відбір константної ділянки Варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів гуманізованих антитіл можуть бути зшиті щонайменше з частиною константної ділянки людини. Вибір константної ділянки залежить, частково, від того, або є бажаними антитілозалежна клітинно-опосередкована цитотоксичність, антитілозалежний клітинний фагоцитоз та/або комплемент-залежна цитотоксичність. Наприклад, ізотипи антитіл людини IgG1 та IgG3 мають комплемент-залежну цитотоксичність, натомість ізотипи антитіл людини IgG2 та IgG4 її не мають. Людські IgG1 та IgG3 також індукують сильніші клітинно-опосередковані ефекторні функції, ніж людські IgG2 та IgG4. Константні ділянки легких ланцюгів можуть бути лямбда і каппа. Типова константна ділянка легкого ланцюга каппа має амінокислотну послідовність SEQ ID №:49. Аргінін на Nтермінальному кінці послідовності SEQ ID №:49 можна не брати до уваги, у цьому випадку константна ділянка легкого каппа-ланцюга має амінокислотну послідовність SEQ ID №:51. Константна ділянка важкого ланцюга типового антитіла людини IgG1 має амінокислотну послідовність SEQ ID №:50. Константна ділянка важкого ланцюга типового антитіла людини IgG2 має амінокислотну послідовність SEQ ID №:57. Антитіла можуть експресуватись як тетрамери, що складаються з двох легких та двох важких ланцюгів, як окремі важкі ланцюги, легкі ланцюги, як Fab, Fab', F(ab')2 та Fv або як одноланцюгові антитіла, у яких зрілі варіабельні домени важкого та легкого ланцюгів зшиті через спайсер. Константні ділянки людини виявляють алотипову та ізоалотипову варіацію між різними особинами, тобто константні ділянки можуть відрізнятися у різних особин за одним або більше поліморфними положеннями. Ізоалотипи відрізняються від алотипів тим, що сироватки, які розпізнають ізоалотип, зв'язуються з неполіморфною ділянкою одного або більше інших ізотипів. Таким чином, наприклад, константні ділянки важкого ланцюга можуть бути від IgG1 G1m1 або IgG1 G1m3 алотипів та мати амінокислотну послідовність SEQ ID №:52 або SEQ ID №:55. Ще інша константна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність SEQ ID №:52 або SEQ ID №:55, за винятком того, що вона втрачає лізин на C-термінальному кінці. Одна або декілька амінокислот на аміно- або карбокситермінальному кінцях легкого та/або важкого ланцюга, такі як лізин на C-термінальному кінці, можуть бути втрачені або дериватизовані у певної частини або у всіх молекул. Заміщення можуть бути проведені у константних ділянках, для того щоб зменшити або підвищити ефекторні функції, такі як комплемент-опосередковану цитотоксичність або ADCC (див., напр., Winter et al., Патент США № 5,624,821; Tso et al., Патент США № 5,834,597; та Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), або подовжити період напіврозпаду у людей(див., напр., Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004). Типові заміщення включають глутамін (Gln) у положенні 250 та/або лейцин (Leu) у положенні 428 (у цьому абзаці застосовується система нумерації EU для константної ділянки) для підвищення періоду напіврозпаду антитіла. Заміщення в будь-якому або у всіх положеннях 234, 235, 236 та/або 237 знижують афінність до Fcγ рецепторів, зокрема, до FcγRI рецептора (див., напр., US 6,624,821). Такі антитіла мають заміщення аланіну в положеннях 234, 235 і 237 людського IgG1 для зниження ефекторних функцій. Необов'язково, положення 234, 236 та/або 237 в антитілі IgG2 людини заміщуються аланіном, а в положенні 235 – глутаміном (див., напр., US 5,624,821). У деяких антитілах, константна ділянка легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:49. У деяких антитілах, константна ділянка важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, позначену як SEQ ID №:52. Легкі ланцюги типового антитіла Hu1H7 мають SEQ ID №:53 або SEQ ID №:54. Важкі ланцюги типового антитіла Hu1H7 мають амінокислотну послідовність SEQ ID №:55 або SEQ ID №:56. У деяких антитілах, послідовність легкого ланцюга являє собою SEQ ID №:53. У деяких антитілах, послідовність важкого ланцюга являє собою SEQ ID №:56. D. Експресія рекомбінантних антитіл Антитіла можна отримувати шляхом рекомбінантної експресії. Нуклеїнові кислоти, які кодують антитіла, можуть бути кодон-оптимізовані для експресії в бажаних типах клітин (напр., CHO або Sp2/0). Рекомбінантні конструкції нуклеїнової кислоти зазвичай включають послідовність контролю експресії, функціонально зв'язану з кодуючими послідовностями ланцюгів антитіла, включаючи природні або гетерологічні промоторні ділянки. Послідовності контролю експресії можуть бути еукаріотичними промоторними системами у векторах, здатних трансформувати або трансфікувати еукаріотичні клітини-господарі. Після вбудовування вектора 15 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в прийнятного господаря, господар підтримується за умов, що є прийнятними для високого рівня експресії нуклеотидних послідовностей, накопичення та очищення перехресно-реагуючих антитіл. Вектор або вектори, що кодують ланцюги антитіла, можуть також містити селективний ген, такий як ген дигідрофолатредуктази, для того щоб забезпечити ампліфікацію численних копій нуклеїнової кислоти, яка кодує ланцюги антитіла. E. coli – це прокаріотичний господар, який особливо широко використовується для експресії антитіла, зокрема, фрагментів антитіла. Мікроорганізми, такі як дріжджі, також можуть бути використані для експресії. Saccharomyces являють собою приклад дріжджів-господарів з прийнятними векторами, що мають послідовності, які контролюють експресію, сайт ініціації реплікації, послідовність термінації реплікації тощо, якщо бажано. Типові промотори включають 3-фосфогліцераткіназу та інші гліколітичні ферменти. Промотори індуцибельних дріжджів включають, серед інших, промотор алкогольдегідрогенази, ізоцитохром C та ферменти, відповідальні за утилізацію мальтози та галактози. Клітини ссавців можуть бути використані для експресії нуклеотидних сегментів, які кодують імуноглобуліни або їх фрагменти. Див. Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). В галузі була розроблена ціла низка прийнятних клітинних ліній-господарів, здатних секретувати інтактні гетерологічні білки, яка включає клітинні лінії CHO, різні клітинні лінії COS, клітини HeLa, клітини HEK293, L-клітини та мієломні лінії, які не продукують антитіл, що включають Sp2/0 та NS0. Використання клітин, які не належать людині, має переваги. Експресуючі вектори для цих клітин можуть включати послідовності контролю експресії, такі як сайт ініціації реплікації, промотор та енхансер (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), необхідні сайти процесингу інформації, такі як сайти зв'язування рибосоми, сайти сплайсингу РНК, сайти поліаденілювання, послідовності термінації транскрипції. Прийнятні послідовності контролю експресії є промоторами, що походять з ендогенних генів, цитомегаловірусу, SV40, аденовірусу, коров'ячого папіломавірусу тощо. Див. Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992). Після вбудовування вектора (ів), який кодує важкі та легкі ланцюги антитіла в клітинну культуру, може бути проведений скринінг клітинного пулу на продуктивність росту та якість продукту на безсироваткових середовищах. Пул клітин з найвищою здатністю до продукування антитіл може після цього бути підданий флуоресцентному сортингу (FACS) клонованих окремих клітин на здатність генерувати моноклональні лінії. Специфічна продуктивність, яка становить понад 50 пг або 100 пг клітин на 1 день, що відповідає титру продукту, який перевищує 7,5 г/л культури, може бути такою, якій слід надати перевагу. Антитіла, що продукуються клонами окремих клітин, можуть також бути протестовані на турбідність, фільтраційні властивості, з використанням PAGE, IEF, УФ-сканування, HP–SEC, вуглеводно-олігосахаридного картування, мас-спектрометрії, а також за допомогою реакції на зв'язування, такої як ELISA або Biacore. Після цього відібраний клон може зберігатись у численних віалах та утримуватись у замороженому вигляді для подальшого використання. Після експресії антитіла можуть бути очищені згідно з методиками, загальноприйнятими в галузі, включаючи використання імобілізованого білка A, колонкову хроматографію (напр., гідрофобну або іонообмінну хроматографію), низькі значення pH для інактивації вірусів тощо (див. загалом Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)). Методологія комерційного виробництва антитіл, включаючи оптимізацію кодону, вибір промоторів, елементів транскрипції та термінаторів, клонованих поодиноких клітин, вільних від сироватки, створення банку клітин, використання селективних маркерів для ампліфікації числа копій, CHO термінатора, підвищення титру антитіл (див., напр., US 5,786,464, US 5,888,809, US 6,063,598, US 6,114,148, US 7,569,339, WO2004/050884, WO2005/019442, WO2008/012142, WO2008/012142, WO2008/107388 та WO2009/027471). E. Нуклеїнові кислоти Винахід також забезпечує нуклеїнові кислоти, що кодують будь-який з важких або легких ланцюгів, які описано вище. Зазвичай, нуклеїнові кислоти також кодують сигнальний пептид, злитий зі зрілими важкими або легкими ланцюгами (напр., сигнальні пептиди, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID №: 29, 31 та 41, які можуть бути закодовані SEQ ID №: 28, 30 і 40). Кодуючі послідовності нуклеїнових кислот можуть бути функціонально зв'язані з регуляторними послідовностями, для того щоб забезпечити експресію кодуючих послідовностей, таких як промотор, енхансер, сайт зв'язування рибосоми, сигнальної послідовності термінації транскрипції тощо. Нуклеїнові кислоти, що кодують важкі та легкі ланцюги, можуть траплятись в ізольованій формі або клонуватись в одному або більше векторах. Нуклеїнові кислоти можуть також бути синтезовані шляхом, наприклад, твердофазного синтезу або полімеразно-ланцюгової реакції олігонуклеотидів, які перекриваються. Нуклеїнові кислоти, що кодують важкі та легкі ланцюги, можуть бути з'єднані у 16 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вигляді однієї неперервної нуклеїнової кислоти, напр., в межах експресуючого вектора або можуть бути відокремлені, напр., кожна клонована у своєму власному експресуючому векторі. V. Терапевтичне застосування Винахід забезпечує декілька способів лікування або здійснення профілактики хвороби з тільцями Леві у пацієнтів, що потерпають від цього захворювання або перебувають під ризиком розвитку такого захворювання. Пацієнти, які підлягають лікуванню, - це особи, що перебувають під ризиком розвитку хвороби з тільцями Леві, але не виявляють симптомів захворювання, а також пацієнти, які наразі виявляють симптоми або ранні загрозливі ознаки синуклеїнопатій, наприклад, уповільнення електроенцефалограми (EEG), нейропсихіатричні прояви (депресія, деменція, галюцинації, тривога, апатія, ангедонія), автономні зміни (ортостатична гіпотензія, порушення функцій сечового міхура, закріп, нетримання калу, гіперсалівація, дисфагія, статева дисфункція, зміни церебрального кровообігу), сенсорні зміни (нюхові, больові, порушене розпізнавання кольорів), розлади сну (порушення поведінки під час сну зі швидким рухом очей (RBD), синдром неспокійних ніг/періодичні рухи кінцівок, гіперсомнія, безсоння) та змішані інші прояви та симптоми (стомлюваність, диплопія, нечіткість зору "пелена перед очима"), себорея, втрата ваги або надмірна вага). Відповідно, ці способи можуть бути застосовані з профілактичною метою стосовно осіб, які мають відомий генетичний ризик розвитку захворювання з тільцями Леві (LBD). Такі особи включають тих, хто має родичів, які потерпають від цього захворювання, а також тих осіб, для яких ризик був визначений за допомогою генетичних або біохімічних маркерів. Генетичні маркери ризику щодо розвитку хвороби Паркінсона включають мутації генів альфа-синуклеїну або Паркіна, UCHLI і CYP2D6 генів; зокрема, мутації в положеннях 30 і 53 гена альфа-синуклеїну. Осіб, які в даний час страждають від хвороби Паркінсона, можна розпізнати за притаманними їм клінічними маніфестаціями, включаючи наявність тремору в стані спокою, м'язову ригідність, брадикінезію або постуральну нестабільність. У асимптоматичних пацієнтів лікування можна розпочинати у будь-якому віці (напр., 10, 20, 30 років). Зазвичай, однак, не потрібно розпочинати лікування до досягнення пацієнтом віку 40, 50, 60 або 70 років. Типове лікування передбачає введення множинних доз протягом тривалого періоду. Моніторинг лікування може здійснюватись шляхом аналізу антитіла або реакції активованих T-клітин або B-клітин на терапевтичний засіб (напр., усічена форма альфасинуклеїнового пептиду) протягом певного проміжку часу. Якщо відповідь знижується, призначається бустерна доза. Антитіла можуть бути використані для лікування або здійснення профілактики хвороби тілець Леві шляхом введення за умов, що генерують сприятливу терапевтичну відповідь у пацієнта (напр., зменшення невритичних та/або аксональних агрегатів альфа-синуклеїну, зменшення невритичної дистрофії, покращення когнітивної функції, та/або реверсію, лікування або попередження когнітивного погіршення) у пацієнта. У деяких способах, площа невритичної дистрофії у нейропілі неокортексу та/або базальних гангліях може бути зменшена, щонайменше на 10 %, 20 %, 30 %, або 40 % у пацієнтів, що отримували лікування, у порівнянні з контрольною популяцією. Когнітивні порушення, прогресуюче зниження когнітивних функцій, морфологічні зміни мозку та зміни цереброваскулярних функцій здебільшого спостерігаються у пацієнтів, що потерпають від деменції з тільцями Леві або перебувають під ризиком захворювання на неї. Застосування антитіл цього винаходу може інгібувати або уповільнити зниження когнітивної функції у таких пацієнтів. Винахід також забезпечує способи для збереження або підвищення щільності синапсів та/або щільності дендритів. Індекс змін у щільності синапсів або дендритів може бути виміряний за допомогою маркерів утворення синапсів (синаптофізин) та/або дендритів (MAP2). У деяких способах, синаптична або дендритна щільність може бути збережена на рівні синаптичної або дендритної щільності у здорового суб'єкта. У деяких способах, середній рівень синаптичної або дендритної щільності у пацієнтів, що отримували лікування, може підніматись на 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 % або більше у порівнянні з популяцією контрольних пацієнтів, які лікування не отримували. VI. Фармацевтичні композиції та способи лікування При профілактичному застосуванні, антитіло або засіб для індукції антитіла або фармацевтична композиція вводиться пацієнту, який сприйнятливий або тим або іншим чином перебуває під ризиком розвитку цього захворювання, в режимі (доза, частота та спосіб застосування), що є ефективним для зменшення ризику, зменшення серйозності прояву захворювання або затримки настання щонайменше одного симптому захворювання. При деяких видах профілактичного застосування, режим є ефективним для інгібування або уповільнення 17 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 акумулювання альфа-синуклеїну або його усічених фрагментів в мозку та/або інгібування або уповільнення його токсичного ефекту та/або інгібування розвитку поведінкового дефіциту. При терапевтичному застосуванні, антитіло або засіб для індукції утворення антитіла вводится пацієнтові, що перебуває під ризиком захворювання або вже потерпає від хвороби з тільцями Леві, у режимі (доза, частота і спосіб застосування), ефективному для полегшення або щонайменше iнгібування подальшого погіршення щонайменше однієї ознаки або симптому захворювання. При деяких терапевтичних застосуваннях, режим є ефективним для зниження або щонайменше інгібування подальшого зростання рівнів альфа-синуклеїну та його усічених фрагментів, пов'язаної з цим токсичності та/або поведінкового дефіциту. Режим вважається терапевтично або профілактично ефективним, якщо пацієнт, який отримує індивідуальне лікування, досягає результату, більш сприятливого, ніж середній результат у контрольній популяції порівнянних пацієнтів, що не отримували лікування за допомогою способів цього винаходу, або якщо більш сприятливий результат демонструють пацієнти, які отримують лікування, порівняно з контрольними пацієнтами в контрольованих клінічних дослідженнях (напр., фазі II, фазі II/III або фазі III клінічного дослідження) при рівнях p Hu1H7Vκ Версія 2 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKfLIYAASNLESGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDaATYYCQQSNEDPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID №: 35) >Hu1H7Vκ Версія 3 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKFLICAASNLESGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID №: 37) >Hu1H7Vκ Версія 4 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKFLIYAASNLESGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID №: 39) >Hu1H7vh Версія 1 QVQLVQSGAElKKPGASVKVSCKASGYsFTSYYIHWVkQAPGQGLEWiGWIYPGSGNTKYSEKFK GRaTlTaDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYfCARDGCYGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID №: 19) >Hu1H7vh Версія 2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYsFTSYYIHWVRQAPGQGLEWiGWIYPGSGNTKYSEKF KGRaTlTaDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYfCARDGCYGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID №: 21) >Hu1H7vh Версія 3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGSGNTKYSEK FKGRATMTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDGCYGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID №: 23) >Hu1H7vh Версія 4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYSEK FKGRATLTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYFCARDGSYGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID №: 25) >Hu1H7vh Версія 5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGSGNTKYSEK FKGRATMTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDGSYGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID №: 27) Приклад II. Аналіз кінетики зв'язування мишачого, химерного та гуманізованого антитіл 1H7 Була охарактеризована кінетика зв'язування гуманізованих антитіл 1H7, що включають важкий ланцюг, відібраний з Hu1H7VHv1-5, та легкий ланцюг, який походить від Hu1H7VLv1-4. Повний аналіз кінетики зв'язування антитіл (Biacore) було проведено за допомогою аналітичної системи Biacore. Детальні параметри кінетики зв'язування (швидкість асоціації, константа асоціації (кa), швидкість дисоціації, константа дисоціації - кд, та константа афінності, KД) були визначені для мишачого 1H7 (Фіг. 3A), химерного 1H7 (Фіг. 3B) та гуманізованого 1H7 (Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv3, Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv1, Hu1H7VHv4-Hu1H7VLv1) антитіл (Фіг. 3C). Параметри кінетики зв'язування гуманізованого 1H7, зокрема Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv3, є порівнянними з показниками, характерними для мишачого 1H7. Таблиця 3 Кінетичні параметри зв'язування мишачого 1H7, химерного 1H7 та гуманізованого 1H7 (Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv3, Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv1, Hu1H7VHv4-Hu1H7VLv1) Антитіло ка (1/Mс) кд (1/с) KД (нM) Мишаче 1H7 1,0e6 9,6e-3 9,5 Химерне1H7 1,7e6 1,3e-2 7.4 Гуманізоване 1H7 H3L3 (Hu1H7VHv3Hu1H7VLv3) Гуманізоване 1H7 H3L1 (Hu1H7VHv3Hu1H7VLv1) Гуманізоване 1H7 H4L1 (Hu1H7VHv4Hu1H7VLv1) Гуманізоване 1H7 H5L1 (Hu1H7VHv5Hu1H7VLv1) Гуманізоване 1H7 H4L4 (Hu1H7VHv4Hu1H7VLv4) 1,3e6 1,1e-2 9,0 1,1e6 1,3e-2 12 9,7e5 3,3e-2 33,9 8,8e5 5,6e-2 64,0 N/A 23 * N/A * N/A * UA 115439 C2 * 5 10 Параметри кінетики зв'язування не можуть бути визначені для Hu1H7VHv4-Hu1H7VLv4 при концентраціях, порівнянних з тими, що були використані в аналізі для інших гуманізованих 1H7 антитіл або мишачих/химерних 1H7. Кінетика зв'язування гуманізованих антитіл 1H7 також була визначена за допомогою біошарової інтерферометрії (BLI) з використанням аналітичної системи ForteBio Octet QK (ForteBio, Menlo Park, CA). Детальні параметри кінетики зв'язування (швидкість асоціації, уявна ("apparent") константа асоціації - кa, швидкість дисоціації, уявна константа дисоціації - кд, константа афінності, уявна KД) були визначені для химерного 1H7 та для різноманітних гуманізованих 1H7 антитіл (Таблиці 6-7, Фігури 4A-C). Уявна константа асоціації кa, уявна константа дисоціації кд та уявна KД являють собою кінетичні параметри, отримані за допомогою аналізу у форматі аналітичної системи ForteBio. Ці параметри відрізняються від кa, кд та KД, визначені за допомогою аналітичної системи Biocore, завдяки тому, що, наприклад, з форматами аналітичних систем ForteBio пов'язаний вплив авідності. Таблиця 4 Кінетичні параметри зв'язування химерного 1H7 та гуманізованого 1H7 (Hu1H7VHv1Hu1H7VLv1, Hu1H7VHv1-Hu1H7VLv2, Hu1H7VHv1-Hu1H7VLv3, Hu1H7VHv1-Hu1H7VLv4, Hu1H7VHv2-Hu1H7VLv1, Hu1H7VHv2-Hu1H7VLv2) Антитіло Химерне 1H7 Гуманізоване 1H7 H1L1 (Hu1H7VHv1-Hu1H7VLv1) Гуманізоване 1H7 H1L2 (Hu1H7VHv1-Hu1H7VLv2) Гуманізоване 1H7 H1L3 (Hu1H7VHv1-Hu1H7VLv3) Уявна ка (1/Mс) 4,7e5 2,5e5 1,6e6 2,2e5 Уявна кд (1/с) 1,1e-6 1,2e-3 9e-3 6,4e-4 Уявна KД (нM) 2,3e-3 4.8 5,8 2,9 Гуманізоване 1H7 H1L4 (Hu1H7VHv1-Hu1H7VLv4) Гуманізоване 1H7 H2L1 (Hu1H7VHv2-Hu1H7VLv1) Гуманізоване 1H7 H2L2 (Hu1H7VHv2-Hu1H7VLv2) 1,8e6 5,8e5 2,3e6 5,8e-3 4,2e-6 4,6e-3 3,3 7,2e-3 2 15 Таблиця 5 Параметри кінетики зв'язування химерного 1H7 та гуманізованого 1H7 (Hu1H7VHv4Hu1H7VLv2, Hu1H7VHv4-Hu1H7VLv3, Hu1H7VHv4-Hu1H7VLv4, Hu1H7VHv5-Hu1H7VLv2, Hu1H7VHv5-Hu1H7VLv3, Hu1H7VHv5-Hu1H7VLv4) Антитіло Уявна ка (1/Mс) 8,3e5 Уявна кд (1/с) 8,7e-4 Уявна KД (нM) 1,0 Гуманізоване 1H7 H4L2 (Hu1H7VHv4-Hu1H7VLv2) Гуманізоване 1H7 H4L3 (Hu1H7VHv4-Hu1H7VLv3) Гуманізоване 1H7 H4L4 (Hu1H7VHv4-Hu1H7VLv4) 1,2e6 7.4e5 5,2e5 2,1e-3 2,0e-3 2,3e-3 1,7 2,7 4,4 Гуманізоване 1H7 H5L2 (Hu1H7VHv5-Hu1H7VLv2) Гуманізоване 1H7 H5L3 (Hu1H7VHv5-Hu1H7VLv3) Гуманізоване 1H7 H5L4 (Hu1H7VHv5-Hu1H7VLv4) 5,2e5 7,6e5 1,6e6 2,1e-3 2,0e-3 1,9e-3 4,0 2,6 1,2 Химерне 1H7 20 25 Гуманізовані антитіла 1H7, зокрема Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv3 та Hu1H7VHv3-Hu1H7VLv1, виявляли характер забарвлювання різних ділянок (напр., смугастого тіла, шару пірамідальних клітин, кори, субстанції нігра) мозку трансгенних або нетрансгенних мишей, аналогічний тому, що було відмічено для мишачого 1H7. ПРИКЛАД II. Пасивна імунізація α-синуклеїновими антитілами Мета цього експерименту полягає у визначенні ефективності α-синуклеїнових антитіл в культурі in vitro та при дослідженнях in vivo, а також при фенотипуванні поведінки. Ми використовували лінії трансгенних за геном α-синуклеїну (Лінія 61) і нокаутних за геном αсинуклеїну мишей та мишей-самок дикого типу, 3-4-місячного віку на початок досліду, n=14/в групі. Протестовані антитіла включали 9E4 (IgG1, епітоп: амінокислоти 118-126 альфасинуклеїну), 5C1 (IgG1, епітоп: амінокислоти 118-126 альфасинуклеїну, c-лінкер), 5D12, 24 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 IgG2 (SN118-126), 1H7, IgG1 (SN 91-99) та IgG1 контрольне антитіло 27-1. Миша отримувала дозу 10 мг/кг протягом 5-місячного періоду, загалом 21 ін'єкцію. Крім того, тваринам вводили ін'єкції лентивірусу (LV), що експресує α-синуклеїн людини (дт) шляхом унілатерального введення α-синуклеїну людини (дт) у гіпокамп. Зчитування антитіл включають дані, отримані з антитіл Chemicon (епітоп: непроцесований альфасинуклеїн), антитіл Millipore (епітоп: непроцесований альфасинуклеїн), і Neotope, ELADW 105 (епітоп: амінокислоти 121-124 непроцесованого альфасинуклеїну). Кінцеві результати: Титр антитіл визначали протягом прижиттєвої фази дослідження. Дослідження, пов'язані з фенотипуванням поведінки, включають тест з водним лабіринтом Морріса (MWW) та тест з горизонтальною перекладиною. Тест з круглою перекладиною – це тест на локомоторну активність - баланс, координацію, особливості ходи, виконаний за допомогою двох перекладин різного діаметру. Перекладина A має більший діаметр (простіша, вважається тренувальною перекладиною), а перекладина D – має менший діаметр (складніша, вважається тестовою перекладиною). Дані представляються як "похибки" (число зісковзувань /10cм) та "швидкість" (час, потрібний для подолання 10см/сек). Проходження "водного лабіринту" було проведено на десятий тиждень та після завершення експерименту. Були виконані наступні невропатологічні вимірювання: агрегація альфа-синуклеїну, вміст синаптофізину та MAP2. Були виконані наступні біохімічні дослідження: альфа-синуклеїн, PSD95, синаптофізин. Було проведено селективне множинне мічення та конфокальне мічення за допомогою синаптичних, нейрональних та гліальних маркерів. Результати свідчать, що всі антитіла, за винятком 5D12, викликали істотне зменшення накопичення α-синуклеїну і збереження щільності синапсів та дендритів, а також позитивні результати при проходженні "водного лабіринту Морріса". 9E4 антитіло є ефективним в дослідженнях in vitro та in vivo, а також у фенотипування поведінки. Зчитування показів приладу свідчить про те, що антитіло може зменшувати накопичення невритичних/аксональних агрегатів альфа-синуклеїну. Результати фенотипування поведінки: 1H7 антитіло (а також 9E4 і 5C1 антитіла) покращувало проходження водного лабіринту у α-синуклеїнтрансгенних мишей, натомість 5D12 антитіла не покращували. 9E4 та 1H7 антитіла покращували проходження тесту на перекладині, виміряні як за швидкістю, так і за "похибками", натомість 5D12 та 5C1 антитіла результатів не покращували (Фіг. 6). Результати невропатологічних досліджень: Антитіла 9E4, 1H7 і 5C1 зменшили ELADW-105 позитивну невритичну дистрофію, натомість 5D12 антитіло не чинить такої дії. У альфасинуклеїн трансгенних мишей, 9E4 антитіла зменшили площу нейропілю до 43 % у неокортексі і до 40 % у базальних гангліях, порівняно з контролем. 9E4 антитіло також зберігало синаптофізин та MAP2 в неокортексі та базальних гангліях. ДЕПОНУВАННЯ Наступні моноклональні антитіло-продукуючі клітинні лінії були депоновані відповідно до Будапештської угоди про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів з Американською колекцією типових культур (ATCC, P.O. Box 1549, Манассас, Вайомінг, 20108), у вказану дату: Моноклональне антитіло 1H7 45 50 55 Клітинна лінія JH17.1H7.4.24.34 Епітоп/ Специфічність Залишки 9199 синуклеїну Ізотоп IgG1 Дата депонування Лютий, 26, 2007 Інвентарний № PTA-8220 Будь-якому фахівцю зі звичайним досвідом роботи в галузі буде очевидним, що багато змін та модифікацій можуть бути внесені тут без відхилення від суті винаходу або меж формули винаходу. Якщо щось очевидно не випливає із констексту, будь-який етап, особливість, втілення або аспект можуть бути використані з будь-якими іншими. Всі публікації, заявки на патент, що згадуються в цьому описі, включені тут як посилання тією ж мірою, ніби-то кожна окрема публікація або патент були специфічно та індивідуально відзначені для включення шляхом посилання. ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ SEQ ID №:1 природний дикого типу альфа-синуклеїн людини MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQV TNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPS EEGYQDYEPEA SEQ ID №:2 домен неамілоїдного компонента (NAC) альфа-синуклеїну згідно з Jensen et al. EQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFV 25 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID №:3 домен неамілоїдного компонента (NAC) альфа-синуклеїну згідно з Uéda et al. KEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGS SEQ ID №:4 нуклеотидна послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла m1H7 (сигнальний пептид підкреслений; CDR ділянки виділені жирним шрифтом та підкреслені) ATGGGATGGAGCTGGGTCTTTATCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCATTGCCAGGT CCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGACTTCAGTGAAGATATCCTGCAAG GCTTCTGGCTACAGCTTCACAAGCTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGTCCTGGACAGGGAC TTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAGTGGTAATACTAAGTACAGTGAGAAGTTCAAGGGC AAGGCCACACTGACTGCAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACAT CTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAGATGGTTGCTACGGGTTTGCTTACTGGGGCCAA GGGACTCTGGTCACTGTCTCT SEQ ID №:5 амінокислотна послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла m1H7 (сигнальний пептид підкреслений; CDR ділянки виділені жирним шрифтом та підкреслені) MGWSWVFIFLLSGTAGVHCQVQLQQSGPELVKPGTSVKISCKASGYSFTSYYIHWVKQSPGQGL EWIGWIYPGSGNTKYSEKFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDGCYGFAYWGQGT LVTVS SEQ ID №:6 нуклеотидна послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла m1H7 (сигнальний пептид підкреслений; CDR ділянки виділені жирним шрифтом та підкреслені) ATGGAGACAGACACACTCCTGTTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGCTCCACTGGTGA CATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCT GCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCA GGACAGCCACCCAAATTCCTCATCTGTGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTT TAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCT GCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGA AATAAAA SEQ ID №:7 амінокислотна послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла m1H7 (сигнальний пептид підкреслений; CDR ділянки виділені жирним шрифтом та підкреслені) METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKP GQPPKFLICAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIK SEQ ID №:8 нуклеотидна послідовність зрілої варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла m1H7 (CDR ділянки виділені жирним шрифтом та підкреслені) GTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGACTTCAGTGAAGATATCCT GCAAGGCTTCTGGCTACAGCTTCACAAGCTACTATATACACTGGGTGAAGCAGAGTCCTGGACA GGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGGAAGTGGTAATACTAAGTACAGTGAGAAGTTCA AGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCT GACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAGATGGTTGCTACGGGTTTGCTTACTGGG GCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCT SEQ ID №:9 амінокислотна послідовність зрілої варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла m1H7 (CDR ділянки виділені жирним шрифтом та підкреслені) VQLQQSGPELVKPGTSVKISCKASGYSFTSYYIHWVKQSPGQGLEWIG WIYPGSGNTKYSEKFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARDGCYGFAYWGQGTLV TVS SEQ ID №:10 нуклеотидна послідовність зрілої варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла m1H7 (CDR ділянки виділені жирним шрифтом та підкреслені) GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCAT CTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGA AACCAGGACAGCCACCCAAATTCCTCATCTGTGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCC AGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGG ATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAG TTGGAAATAAAA SEQ ID №:11 амінокислотна послідовність зрілої варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла m1H7 (CDR ділянки виділені жирним шрифтом та підкреслені) DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKFLICAASNLESGIPAR FSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPFTFGSGTKLEIK SEQ ID №:12 CDR1 важкого ланцюга антитіла m1H7 (визначення за Kabat) SYYIH SEQ ID №:13 CDR2 важкого ланцюга антитіла m1H7 (визначення за Kabat) WIYPGSGNTKYSEKFKG SEQ ID №:14 CDR3 важкого ланцюга антитіла m1H7 (визначення за Kabat) DGCYGFAY 26 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 SEQ ID №:15 CDR1 легкого ланцюга антитіла m1H7 (визначення за Kabat) KASQSVDYDGDSYMN SEQ ID №:16 CDR2 легкого ланцюга антитіла m1H7 (визначення за Kabat) AASNLES SEQ ID №:17 CDR3 легкого ланцюга антитіла m1H7 (визначення за Kabat) QQSNEDPFT SEQ ID №:18 Hu1H7VHv1 (нуклеотидна послідовність) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGCTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTG TCCTGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCTCCTACTACATCCACTGGGTGAAGCAGGCCCCCG GCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTGGATCTACCCCGGCTCCGGCAACACCAAGTACTCCGAGA AGTTCAAGGGCCGCGCCACCCTGACCGCCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGC GCTCCCTGCGCTCCGACGACACCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCGACGGCTGCTACGGCTTCG CCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCA SEQ ID №:19 Hu1H7VHv1 (амінокислотна посл.) (CDR ділянки виділені жирним шрифтом та підкреслені) QVQLVQSGAElKKPGASVKVSCKASGYsFTSYYIHWVkQAPGQGLEWiGWIYPGSGNTKYSEKFK GRaTlTaDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYfCARDGCYGFAYWGQGTLVTVSS SEQ ID №:20 Hu1H7VHv2 (нуклеотидна послідовність) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTG TCCTGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCTCCTACTACATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCG GCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTGGATCTACCCCGGCTCCGGCAACACCAAGTACTCCGAGA AGTTCAAGGGCCGCGCCACCCTGACCGCCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGC GCTCCCTGCGCTCCGACGACACCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCGACGGCTGCTACGGCTTCG CCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCA SEQ ID №:21 Hu1H7VHv2 (амінокислотна посл.) (CDR ділянки виділені жирним шрифтом та підкреслені) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYsFTSYYIHWVRQAPGQGLEWiGWIYPGSGNTKYSEKF KGRaTlTaDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYfCARDGCYGFAYWGQGTLVTVSS SEQ ID №:22 Hu1H7VHv3 (нуклеотидна послідовність) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTG TCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCTCCTACTACATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCG GCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTGGATCTACCCCGGCTCCGGCAACACCAAGTACTCCGAGA AGTTCAAGGGCCGCGCCACCATGACCGCCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGC GCTCCCTGCGCTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGACGGCTGCTACGGCTTCG CCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCA SEQ ID №:23 Hu1H7VHv3 (амінокислотна посл.) (CDR ділянки виділені жирним шрифтом та підкреслені) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGSGNTKYSEK FKGRATMTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDGCYGFAYWGQGTLVTVSS SEQ ID №:24 Hu1H7VHv4 (нуклеотидна послідовність) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTG TCCTGCAAGGCCTCCGGCTACTCCTTCACCTCCTACTACATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCG GCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTGGATCTACCCCGGCTCCGGCAACACCAAGTACTCCGAGA AGTTCAAGGGCCGCGCCACCCTGACCGCCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGC GCTCCCTGCGCTCCGACGACACCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCGACGGCTcCTACGGCTTCG CCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCA SEQ ID №:25 Hu1H7VHv4 (амінокислотна посл.) (CDR ділянки виділені жирним шрифтом та підкреслені) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYSEK FKGRATLTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYFCARDGSYGFAYWGQGTLVTVSS SEQ ID №:26 Hu1H7VHv5 (нуклеотидна послідовність) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTG TCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCTCCTACTACATCCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCG GCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCTGGATCTACCCCGGCTCCGGCAACACCAAGTACTCCGAGA AGTTCAAGGGCCGCGCCACCATGACCGCCGACACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGC GCTCCCTGCGCTCCGACGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGACGGCTcCTACGGCTTCG CCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCA SEQ ID №:27 Hu1H7VHv5 (амінокислотна посл.) (CDR ділянки виділені жирним шрифтом та підкреслені) 27 UA 115439 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWMGWIYPGSGNTKYSEK FKGRATMTADTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDGSYGFAYWGQGTLVTVSS SEQ ID №:28 сигнальний пептид Hu1H7VH (нуклеотидна послідовність) ATGGAGTTCGGCCTGTCCTGGCTGTTCCTGGTGGCCATCCTGAAGGGCGTGCAGTGC SEQ ID №:29 сигнальний пептид Hu1H7VH (амінокислотна посл.) MEFGLSWLFLVAILKGVQC SEQ ID №:30 сигнальний пептид Hu1H7VH (нуклеотидна послідовність) atggactggacctggagcatccttttcttggtggcagcagcaacaggtgcccactcc SEQ ID №:31 0 Hu1H7VH (амінокислотна посл.) MDWTWSILFLVAAATGAHS SEQ ID №:32 Hu1H7VLv1 (нуклеотидна послідовність) GACATCCAGCTGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGCGTGACCA TCACCTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCA GAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGTTCCTGATCTGCGCCGCCTCCAACCTGGAGTCCGGCGTGCC CTCCCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCC GAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTCCAACGAGGACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGC ACCAAGCTGGAGATCAAG SEQ ID №:33 Hu1H7VLv1 (амінокислотна посл.) (CDR ділянки виділені жирним шрифтом та підкреслені) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKfLIcAASNLESGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDaATYYCQQSNEDPFTFGQGTKLEIK SEQ ID №:34 Hu1H7VLv2 (нуклеотидна послідовність) GACATCCAGCTGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGCGTGACCA TCACCTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCA GAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGTTCCTGATCTaCGCCGCCTCCAACCTGGAGTCCGGCGTGCC CTCCCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCC GAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTCCAACGAGGACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGC ACCAAGCTGGAGATCAAG SEQ ID №:35 Hu1H7VLv2 (амінокислотна посл.) (CDR ділянки виділені жирним шрифтом та підкреслені) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKfLIYAASNLESGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDaATYYCQQSNEDPFTFGQGTKLEIK SEQ ID №:36 Hu1H7VLv3 (нуклеотидна послідовність) GACATCCAGCTGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGCGTGACCA TCACCTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCA GAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGTTCCTGATCTGCGCCGCCTCCAACCTGGAGTCCGGCGTGCC CTCCCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCC GAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTCCAACGAGGACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCA CCAAGCTGGAGATCAAG SEQ ID №:37 Hu1H7VLv3 (амінокислотна посл.) (CDR ділянки виділені жирним шрифтом та підкреслені) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKFLICAASNLESGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPFTFGQGTKLEIK SEQ ID №:38 Hu1H7VLv4 (нуклеотидна послідовність) GACATCCAGCTGACCCAGTCCCCCTCCTCCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGCGTGACCA TCACCTGCAAGGCCTCCCAGTCCGTGGACTACGACGGCGACTCCTACATGAACTGGTACCAGCA GAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGTTCCTGATCTaCGCCGCCTCCAACCTGGAGTCCGGCGTGCC CTCCCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCC GAGGACttCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTCCAACGAGGACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCA CCAAGCTGGAGATCAAG SEQ ID №:39 Hu1H7VLv4 (амінокислотна посл.) (CDR ділянки виділені жирним шрифтом та підкреслені) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKFLIYAASNLESGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPFTFGQGTKLEIK SEQ ID №:40 сигнальний пептид Hu1H7VL (нуклеотидна послідовність) ATGGACATGCGCGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGATGCTGTGGGTGTCCGGCTCCT CCGGC SEQ ID №:41 сигнальний пептид Hu1H7VL (амінокислотна послідовність) MDMRVPAQLLGLLMLWVSGSSG 28