Гомологічна рекомбінація, опосередкована нуклеазами з цинковими пальцями

Реферат: Винахід належить до способу введення екзогенної послідовності в геном рослинної клітини, причому спосіб включає стадії: (a) приведення клітини в контакт з вектором донорної ДНК, що містить першу, другу і п'яту послідовності ДНК, де вказана п'ята послідовність містить вказану екзогенну послідовність вектора ДНК, що підлягає введенню, і розташована між вказаними першою і другою послідовностями вектора донорної ДНК; де перша послідовність гомологічна щонайменше на 90-95 % третій послідовності в геномі рослинної клітини, друга послідовність гомологічна щонайменше на 90-95 % четвертій послідовності в геномі рослинної клітини, де вказані третя і четверта послідовності в геномі рослинної клітини являють собою послідовності хромосомної ДНК, і ближчі один до одного кінці вказаних третьої і четвертої послідовностей розділені щонайменше однією нуклеотидною парою; і (b) експресії однієї або більше нуклеаз в клітині, де кожна з вказаних однієї або більше нуклеаз являє собою пару злитих білків, де кожен UA 106193 C2 (12) UA 106193 C2 злитий білок являє собою злиття між доменом розщеплення ендонуклеази рестрикції Fok І і сконструйованим зв'язувальним доменом типу цинкового пальця, і де вказані одна або більше нуклеаз розщеплюють хромосомну ДНК в одній або більше відповідних послідовностях-мішенях між третьою і четвертою послідовностями, де вказані одна або більше нуклеаз розщеплюють хромосомну ДНК в місці, віддаленому на 0,4-3 тисяч пар основ від вказаних третьої або четвертої послідовностей в геномі рослинної клітини; так що розщеплення хромосомної ДНК на стадії (b) стимулює вбудовування п'ятої послідовності ДНК в геном за допомогою гомологічної рекомбінації. UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД Даний опис належить до галузей геномної інженерії, таргетингу генів, цілеспрямованої інтеграції в хромосоми і експресії білка у рослин. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Основною галуззю в сільському господарстві, що представляє інтерес, особливо в світлі визначення повних нуклеотидних послідовностей цілого ряду рослинних геномів, є цілеспрямована зміна геномних послідовностей. Зокрема, можливість перетворення ендогенних послідовностей рослин могла б полегшити численні застосування, такі як, наприклад, оптимізація ознак сільськогосподарських культур, що впливають на харчову цінність, врожайність, стійкість до стресів, резистентність до патогенів і резистентність до агрохімікатів і/або адаптацію рослин для застосування як біологічних фабрик з виробництва фармацевтичних сполук або хімічних речовин для виробничих потреб. У еукаріот були зроблені спроби змінити геномні послідовності в клітинах, що культивуються, використовуючи переваги природного явища гомологічної рекомбінації. Див., наприклад, Capecchi (1989) Science 244: 1288-1292; патенти США №6528313 і 6528314. Якщо полінуклеотид має достатню гомологію з ділянкою геному, що містить послідовність, яку необхідно змінити, то можна частиною або всією послідовністю полінуклеотиду замінити геномну послідовність за допомогою гомологічної рекомбінації. Однак частота гомологічної рекомбінації в таких умовах надзвичайно низька. Крім того, частота інсерції екзогенного полінуклеотиду в положення геному, в яких відсутня гомологія послідовностей, перевищує частоту гомологічної рекомбінації на декілька порядків величин. Показано, що введення двониткового розриву в геномну ДНК в ділянку геному, що має гомологію з екзогенним полінуклеотидом, стимулює гомологічну рекомбінацію на такій ділянці в клітинах, що культивуються в декілька тисяч разів. Rouet et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14: 80968106; Choulika et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15: 1968-1973; Donoho et al. (1998) Mol. Cell. Biol. 18: 4070-4078. Див., також Johnson et al. (2001) Biochem. Soc. Trans. 29: 196-201; і Yanez et al. (1998) Gene Therapy 5: 149-159. В таких способах розщеплення ДНК в необхідній геномній ділянці супроводжувалося інсерцією сайту впізнавання мегануклеазою (тобто ендонуклеазою, послідовність впізнавання якої настільки велика, що вона не зустрічається або тільки рідко зустрічається в геномі, що представляє інтерес) в необхідну геномну ділянку. Однак гомологічна рекомбінація, що стимулюється розщепленням мегануклеазою, основана або на випадковій присутності, або на прямій інсерції відповідного сайту впізнавання мегануклеазою поблизу ділянки геному, яку необхідно змінити. Оскільки сайти впізнавання мегануклеазою є рідкими (або таких не існує) в типовому геномі рослин і інсерція відповідного сайту впізнавання мегануклеазою пов'язана з деякими труднощами, які пов'язані з іншими змінами геному, такі способи широко не застосовуються. Таким чином, залишається необхідність в композиціях і способах цілеспрямованої зміни послідовностей в геномі рослин і в композиціях і способах цілеспрямованого введення екзогенних послідовностей в геном. СУТЬ ВИНАХОДУ Даний опис стосується композицій і способів цілеспрямованого розщеплення клітинного хроматину в представляючій інтерес ділянці і/або гомологічній рекомбінації в представляючій інтерес ділянці, що заздалегідь визначається в рослинних клітинах. Рослинні клітини можуть бути з односім'ядольних або двосім'ядольних видів рослин, а також включають клітини, що культивуються, клітини в рослині на будь-якій стадії розвитку і рослинні клітини, які були виділені з цілої рослини і які (або їх нащадки) будуть повернені в рослину. Представляючою інтерес ділянкою в клітинному хроматині може бути, наприклад, геномна послідовність або її частина. Композиції містять злиті поліпептиди, що містять сконструйований зв'язуючий домен типу цинкового пальця (наприклад, зв'язуючий домен типу цинкового пальця, що має нову специфічність) і домен розщеплення, і злиті поліпептиди, що містять сконструйований зв'язуючий домен типу цинкового пальця і напівдомен розщеплення. Домени розщеплення і напівдомени розщеплення можуть бути одержані, наприклад, з різних ендонуклеаз рестрикції і/або хомінг-ендонуклеаз. В одному аспекті в даному описі пропонується вектор, що містить першу і другу послідовності ДНК, при цьому (i) перша послідовність гомологічна третій послідовності, а друга послідовність гомологічна четвертій послідовності; (ii) третя і четверта послідовності являють собою послідовності хромосомної ДНК; і (iii) сусідні кінці третьої і четвертої послідовностей розділені щонайменше 1 парою основ. У деяких варіантах третя і четверта послідовності є ендогенними послідовностями. 1 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У будь-якому з векторів, описаних в даній публікації щонайменше одна з першої або другої послідовностей має довжину 100 нуклеотидів. Крім того, будь-який з векторів, описаних в даній публікації, може додатково містити п'яту послідовність, при цьому п'ята послідовність: (a) вміщена між першою і другою послідовностями; і (b) є екзогенною послідовністю. У деяких варіантах п'ята послідовність має розмір щонайменше в 1 пару основ, але може складати до 22 тисяч пар основ. Вектори (наприклад, п'ята послідовність) також можуть містити послідовності, що кодують білок або частини білка. У деяких варіантах кодуюча білок послідовність кодує селектований маркер (наприклад, зелений флуоресціюючий білок (GFP), β-глюкуронідазу (GUS), фосфінотрицин-N-ацетилтрансферазу (PAT, BAR), неоміцинфосфотрансферазу, β-лактамазу, катехолдіоксигеназу, α-амілазу, тирозиназу, β-галактозидазу, люциферазу, екворин, EPSPсинтазу, нітрилазу, ацетолактатсинтазу (ALS), дигідрофолатредуктазу (DHFR), далапондегалогеназу і антранілатсинтазу). В інших варіантах кодуюча білок послідовність (наприклад, п'ята послідовність) кодує білок або частину білка, наприклад послідовність, яка гомологічна хромосомним послідовностям. У наступних варіантах вектори (наприклад, п'ята послідовність) містять одну або більше послідовностей регуляції транскрипції. У наступних варіантах вектори (наприклад, п'ята послідовність) можуть містити копію дикого типу мутантної хромосомної послідовності або альтернативно мутантну копію хромосомної послідовності дикого типу. У будь-якому з векторів, описаних в даній публікації, перша послідовність може мати щонайменше 35 % гомологію з третьою послідовністю. Подібним чином, в будь-якому з векторів, описаних в даній публікації, друга послідовність може мати щонайменше 35 % гомологію з четвертою послідовністю. У деяких варіантах перша послідовність має щонайменше від 35 % до 50 % щонайменше від 50 % до 70 % щонайменше від 70 % до 80 % щонайменше від 80 % до 85 % щонайменше від 85 % до 90 % щонайменше від 90 % до 95 % щонайменше 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % гомологію з третьою послідовністю. У деяких варіантах друга послідовність має щонайменше від 35 % до 50 % щонайменше від 50 % до 70 % щонайменше від 70 % до 80 % щонайменше від 80 % до 85 % щонайменше від 85 % до 90 % щонайменше від 90 % до 95 % щонайменше 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % гомологію з четвертою послідовністю. В іншому аспекті, описаному в даній публікації, пропонується спосіб введення екзогенної послідовності в геном рослинної клітини, при цьому спосіб включає в себе стадії: (a) здійснення контакту клітини з будь-яким з векторів, описаних вище; і (b) експресії однієї або більше нуклеаз в клітині, в якій одна або більше нуклеаз розщеплюють хромосомну ДНК в межах від 0,4 до 3 тисячами пар основ або третьої, або четвертої послідовностей; за умови, що розщеплення хромосомної ДНК на стадії (b) стимулює вбудовування направленого до мішені вектора в геном за допомогою гомологічної рекомбінації. У деяких варіантах одна або більше нуклеаз є злиттям між доменом розщеплення ендонуклеази рестрикції типу IIS і сконструйованим зв'язуючим доменом типу цинкового пальця. В іншому аспекті в даному описі пропонується спосіб експресії білка в рослинній клітині, при цьому спосіб включає в себе стадії: (a) здійснення контакту клітини з вектором, який описаний в даній публікації; і (b) експресії однієї або більше нуклеаз в клітині, в якій одна або більше нуклеаз розщеплюють хромосомну ДНК в межах від 0,1 до 3 тисяч пар основ або третьої, або четвертої послідовностей; за умови, що розщеплення хромосомної ДНК на стадії (b) стимулює вбудовування вектора в геном за допомогою гомологічної рекомбінації. У деяких варіантах одна або більше нуклеаз є злиттям між доменом розщеплення ендонуклеази рестрикції типу IIS і сконструйованим зв'язуючим доменом типу цинкового пальця. В іншому аспекті, описаному в даній публікації, пропонується направлений до мішені вектор, що містить: (a) першу і другу кодуючі послідовності; і (b) першу, другу і третю послідовностімішені; при цьому послідовності розташовані в наступному порядку: перша послідовністьмішень, перша кодуюча послідовність, друга послідовність-мішень, друга кодуюча послідовність, третя послідовність-мішень; крім того, при цьому перша послідовність-мішень гомологічна першій хромосомній послідовності, і третя послідовність-мішень гомологічна другій хромосомній послідовності. Перша і/або друга кодуюча послідовність може кодувати селектований маркер, або альтернативно перша і/або друга кодуюча послідовність може кодувати білок, який не є селектованим маркером. Перша і друга хромосомні послідовності можуть бути ендогенними хромосомними послідовностями. Крім того, вектори можуть містити один або більше повторів першої, другої і/або третьої послідовності-мішені. В іншому аспекті пропонується спосіб введення екзогенної послідовності в геном рослинної клітини, при цьому спосіб включає в себе стадії: (a) здійснення контакту клітини з направленим 2 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 до мішені вектором, який описаний в попередньому абзаці; і (b) експресії однієї або більше нуклеаз в клітині, в якій одна або більше нуклеаз розщеплюють хромосомну ДНК в межах від 0,1 до 3 тисяч пар основ або першої, або другої хромосомних послідовностей; за умови, що розщеплення хромосомної ДНК на стадії (b) стимулює вбудовування направленого до мішені вектора в геном за допомогою гомологічної рекомбінації. У деяких варіантах одна або більше нуклеаз містять напівдомен розщеплення; наприклад, нуклеаза є злиттям між доменом розщеплення ендонуклеази рестрикції типу IIS і сконструйованим доменом типу цинкового пальця. В іншому аспекті пропонується спосіб експресії білка в рослинній клітині, при цьому спосіб включає в себе стадії: (a) здійснення контакту клітини з направленим до мішені вектором, який описаний в двох наведених вище абзацах; і (b) експресії однієї або більше нуклеаз в клітині, в якій одна або більше нуклеаз розщеплюють хромосомну ДНК в межах від 0,1 до 3 тисяч пар основ або першої, або другої хромосомної послідовності; за умови, що розщеплення хромосомної ДНК на стадії (b) стимулює вбудовування направленого до мішені вектора в геном за допомогою гомологічної рекомбінації. У деяких варіантах одна або більше нуклеаз являють собою злиття між доменом розщеплення ендонуклеази рестрикції типу IIS і сконструйованим зв'язуючим доменом типу цинкового пальця. У ще одному аспекті пропонується трансгенна рослинна клітина, одержана згідно з будьяким зі способів, описаних в даній публікації. В іншому аспекті даного винаходу пропонується рослина, що містить трансгенну рослинну клітину, одержану як описано в даній публікації. Також пропонується спосіб делетування послідовностей з геному трансгенної рослинної клітини, що містить першу і другу кодуючі послідовності і першу, другу і третю послідовностімішені; при цьому послідовності розташовані в наступному порядку: перша послідовністьмішень, перша кодуюча послідовність, друга послідовність-мішень, друга кодуюча послідовність, третя послідовність-мішень, при цьому спосіб включає в себе: (a) одержання трансгенної рослинної клітини, яка описана в даній публікації; і (b) експресію першої і другої нуклеаз в клітині, при цьому перша нуклеаза розщеплює першу послідовність-мішень, а друга нуклеаза розщеплює другу послідовність-мішень. У наступному аспекті в даному описі розкритий спосіб делетування послідовностей з геному трансгенної рослинної клітини, що містить першу і другу кодуючі послідовності і першу, другу і третю послідовності-мішені; при цьому послідовності розташовані в наступному порядку: перша послідовність-мішень, перша кодуюча послідовність, друга послідовність-мішень, друга кодуюча послідовність, третя послідовність-мішень, при цьому спосіб включає в себе: (a) одержання трансгенної рослинної клітини, яка описана в даній публікації; і (b) експресію першої і другої нуклеаз в клітині, при цьому перша нуклеаза розщеплює другу послідовність-мішень, а друга нуклеаза розщеплює третю послідовність-мішень. У ще одному аспекті даного винаходу пропонується спосіб делетування послідовностей з геному трансгенної рослинної клітини, що містить першу і другу кодуючі послідовності і першу, другу і третю послідовності-мішені; при цьому послідовності розташовані в наступному порядку: перша послідовність-мішень, перша кодуюча послідовність, друга послідовність-мішень, друга кодуюча послідовність, третя послідовність-мішень, при цьому спосіб включає в себе: (a) одержання трансгенної рослинної клітини, яка описана в даній публікації; і (b) експресію першої і другої нуклеаз в клітині, при цьому перша нуклеаза розщеплює першу послідовність-мішень, а друга нуклеаза розщеплює третю послідовність-мішень. В іншому аспекті пропонується спосіб внутрішньомолекулярної гомологічної рекомбінації в геномі клітини (наприклад, рослинної клітини), при цьому спосіб включає в себе стадії: (a) одержання фрагмента ДНК, що містить першу послідовність, яка гомологічна другій послідовності; і (b) здійснення контакту вказаного фрагмента ДНК з нуклеазою, при цьому нуклеаза розщеплює фрагмент ДНК в третій послідовності. У деяких варіантах фрагмент ДНК є ендогенним для клітини. У деяких варіантах гомологічна рекомбінація відбувається в хромосомі, наприклад, коли їх хромосоми делетують ДНК між першою і другою послідовностями. Послідовності, делетовані з хромосоми, можуть кодувати, наприклад, весь або частину селектованого маркера. Делетована ДНК може бути замінена екзогенною послідовністю, при цьому наприклад спосіб додатково включає в себе: введення полінуклеотиду в клітину, і такий полінуклеотид містить: (a) четверту і п'яту послідовності, при цьому четверта послідовність гомологічна неделетованим послідовностям поблизу першої послідовності, а п'ята послідовність гомологічна неделетованим послідовностям поблизу другої послідовності; і (b) екзогенну послідовність (наприклад, селектований маркер, білок або частину білка, відмінного від селектованого маркера, РНК, таку як міРНК, і т.д.). У будь-якому зі способів, що 3 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пропонуються у винаході, селектованим маркером може бути, наприклад, зелений флуоресціюючий білок (GFP), β-глюкуронідаза (GUS), фосфінотрицин-N-ацетилтрансфераза (PAT, BAR), неоміцинфосфотрансфераза, β-лактамаза, катехолдіоксигеназа, α-амілаза, тирозиназа, β-галактозидаза, люцифераза, екворин, EPSP-синтаза, нітрилаза, ацетолактатсинтаза (ALS), дигідрофолатредуктаза (DHFR), далапондегалогеназа і антранілатсинтаза. У будь-якому зі способів третя послідовність (тобто послідовність, що розщеплюється нуклеазою) може бути унікальною в геномі, і/або нуклеаза може являти собою пару злитих білків, в якій кожний злитий білок є злиттям між напівдоменом розщеплення (наприклад, доменом розщеплення ендонуклеази рестрикції типу IIS) і сконструйованим зв'язуючим доменом типу цинкового пальця. Крім того, третя послідовність може являти собою послідовність між першою і другою послідовностями (тобто гомологічніми послідовностями) і/або бути щонайменше на 1 пару основ з першої і/або другої послідовності. У будь-якому зі способів, описаних в даній публікації, одна або обидві перша і друга послідовності можуть бути екзогенними для організму. Таким чином, даний опис охоплює без обмеження наступні пронумеровані варіанти: 1. Донорний вектор, що містить першу і другу послідовності ДНК; де перша послідовність гомологічна третій послідовності, і друга послідовність гомологічна четвертій послідовності; де третя і четверта послідовності є послідовностями хромосомної ДНК; і де сусідні кінці третьої і четвертої послідовностей розділені щонайменше 1 парою основ. 2. Вектор за п. 1, де третя і четверта послідовності є ендогенними послідовностями. 3. Вектор за п. 1 або 2, де щонайменше одна з першої і другої послідовностей має довжину 100 нуклеотидів. 4. Вектор за будь-яким з пп. 1-3, що додатково містить п'яту послідовність, де п'ята послідовність: (a) розташована між першою і другою послідовностями; і (b) є екзогенною послідовністю. 5. Вектор за п. 4, де п'ята послідовність має розмір, що становить щонайменше 1 парі основ. 6. Вектор за п. 4, де п'ята послідовність містить послідовності, що кодують селектований маркер. 7. Вектор за п. 6, де селектований маркер вибраний з групи, яка складається із зеленого флуоресціюючого білка (GFP), β-глюкуронідази (GUS), фосфінотрицин-N-ацетилтрансферази (PAT, BAR), неоміцинфосфотрансферази, β-лактамази, катехолдіоксигенази, α-амілази, тирозинази, β-галактозидази, люциферази, екворину, EPSP-синтази, нітрилази, ацетолактатсинтази (ALS), дигідрофолатредуктази (DHFR), далапондегалогенази і антранілатсинтази. 8. Вектор за п. 4, де п'ята послідовність містить послідовності, що кодують інший білок, відмінний від селектованого маркера. 9. Вектор за п. 4, де п'ята послідовність містить одну або більше послідовностей регуляції транскрипції. 10. Вектор за п. 4, де п'ята послідовність містить послідовності, що кодують частину білка. 11. Вектор за п. 10, де послідовності, що кодують частину білка, містять послідовності, гомологічні хромосомним послідовностям. 12. Вектор за п. 4, де п'ята послідовність містить копію дикого типу мутантної хромосомної послідовності. 13. Вектор за п. 4, де п'ята послідовність містить мутантну копію хромосомної послідовності дикого типу. 14. Вектор за будь-яким з пп. 1-13, де перша послідовність має щонайменше 35 % гомологію з третьою послідовністю. 15. Вектор за п. 1-14, де друга послідовність має щонайменше 35 % гомологію з четвертою послідовністю. 16. Вектор за п. 14, де друга послідовність має щонайменше 35 % гомологію з четвертою послідовністю. 17. Спосіб введення екзогенної послідовності в геном рослинної клітини, де спосіб включає в себе стадії: (a) приведення клітини в контакт з направленим до мішені вектором за будь-яким з пп. 1-16; і (b) експресії однієї або більше нуклеаз в клітині, де одна або більше нуклеаз розщеплюють хромосомну ДНК в межах 3 тисяч пар основ або третьої, або четвертої послідовності; 4 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 за умови, що розщеплення хромосомної ДНК на стадії (b) стимулює вбудовування направленого до мішені вектора в геном за допомогою гомологічної рекомбінації. 18. Спосіб за п. 17, де одна або більше нуклеаз є злиттям між доменом розщеплення ендонуклеази рестрикції типу IIS і сконструйованим зв'язуючим доменом типу цинкового пальця. 19. Спосіб експресії білка в рослинній клітині, де спосіб включає в себе стадії: (a) приведення клітини в контакт з направленим до мішені вектором за п. 8; і (b) експресії однієї або більше нуклеаз в клітині, де одна або більше нуклеаз розщеплюють хромосомну ДНК в межах 3 тисяч пар основ або третьої, або четвертої послідовності; за умови, що розщеплення хромосомної ДНК на стадії (b) стимулює вбудовування направленого до мішені вектора в геном за допомогою гомологічної рекомбінації. 20. Спосіб за п. 19, де одна або більше нуклеаз є злиттям між доменом розщеплення ендонуклеази рестрикції типу IIS і сконструйованим зв'язуючим доменом типу цинкового пальця. 21. Трансгенна рослинна клітина, одержана згідно зі способом за п. 17, 18, 19 або 20. 22. Рослина, що містить трансгенну рослинну клітину за п. 21. 23. Спосіб внутрішньомолекулярної гомологічної рекомбінації в геномі клітини, де спосіб включає в себе стадії: (a) одержання фрагмента ДНК, що містить першу послідовність, яка гомологічна другій послідовності; і (b) здійснення контакту вказаного фрагмента ДНК з нуклеазою, де нуклеаза розщеплює фрагмент ДНК в третій послідовності. 24. Спосіб за п. 23, де фрагмент ДНК є ендогенним для клітини. 25. Спосіб за п. 23 або 24, де гомологічна рекомбінація відбувається в хромосомі. 26. Спосіб за п. 25, де ДНК між першою і другою послідовностями виключена з хромосоми. 27. Спосіб за п. 23, 24, 25 або 26, де третя послідовність є унікальною в геномі. 28. Спосіб за будь-яким з пп. 23-26, де клітина є рослинною клітиною. 29. Спосіб за будь-яким з п. 23-28, де нуклеаза являє собою пару злитих білків, де кожний злитий білок є злиттям між доменом розщеплення ендонуклеази рестрикції типу IIS і сконструйованим зв'язуючим доменом типу цинкового пальця. 30. Спосіб за будь-яким з пп. 23-29, де третя послідовність є віддаленою щонайменше на 100 пар основ від першої послідовності. 31. Спосіб за будь-яким з пп. 23-30, де третя послідовність є віддаленою щонайменше на 100 пар основ від другої послідовності. 32. Спосіб за будь-яким з пп. 23-31, де третя послідовність розташована між першою і другою послідовностями. 33. Спосіб за будь-яким з пп. 23-32, де одна з двох послідовностей перша або друга є екзогенною для організму. 34. Спосіб за будь-яким з пп. 23-32, де і перша і друга послідовності є екзогенними для організму. 35. Спосіб за п. 26, де послідовності, делетовані з хромосоми, кодують весь або частину селектованого маркера. 36. Спосіб за п. 35, де селектований маркер вибраний з групи, що складається із зеленого флуоресціюючого білка (GFP), β-глюкуронідази (GUS), фосфінотрицин-N-ацетилтрансферази (PAT, BAR), неоміцинфосфотрансферази, β-лактамази, катехолдіоксигенази, α-амілази, тирозинази, β-галактозидази, люциферази, екворину, EPSP-синтази, нітрилази, ацетолактатсинтази (ALS), дигідрофолатредуктази (DHFR), далапондегалогенази і антранілатсинтази. 37. Спосіб за п. 26, де виключену ДНК замінюють екзогенною послідовністю, де спосіб додатково включає в себе: введення полінуклеотиду в клітину, де полінуклеотид містить: (a) четверту і п'яту послідовності, де четверта послідовність гомологічна невиключеним послідовностям поблизу першої послідовності, і п'ята послідовність гомологічна невиключеним послідовностям поблизу другої послідовності; і (b) екзогенну послідовність. 38. Спосіб за п. 37, де екзогенна послідовність є селектованим маркером. 39. Спосіб за п. 38, де селектований маркер вибраний з групи, що складається із зеленого флуоресціюючого білка (GFP), β-глюкуронідази (GUS), фосфінотрицин-N-ацетилтрансферази (PAT, BAR), неоміцинфосфотрансферази, β-лактамази, катехолдіоксигенази, α-амілази, тирозинази, β-галактозидази, люциферази, екворину, EPSP-синтази, нітрилази, ацетолактатсинтази (ALS), дигідрофолатредуктази (DHFR), далапондегалогенази і антранілатсинтази. 5 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 40. Спосіб за будь-яким з пп. 23-39, де екзогенна послідовність кодує інший білок, відмінний від селектованого маркера. 41. Спосіб за будь-яким з пп. 23-39, де екзогенна послідовність кодує РНК. 42. Спосіб за п. 41, де РНК являє собою міРНК. 43. Направлений до мішені вектор, що містить: (a) першу і другу кодуючі послідовності; і (b) першу, другу і третю послідовності-мішені; де послідовності розташовані в наступному порядку: перша послідовність-мішень, перша кодуюча послідовність, друга послідовність-мішень, друга кодуюча послідовність, третя послідовність-мішень; крім того, перша послідовність-мішень гомологічна першій хромосомній послідовності, і третя послідовність-мішень гомологічна другій хромосомній послідовності. 44. Вектор за п. 43, де перша кодуюча послідовність кодує селектований маркер. 45. Вектор за п. 43 або 44, де друга кодуюча послідовність кодує селектований маркер. 46. Вектор за п. 43 або 45, де перша кодуюча послідовність кодує білок, який не є селектованим маркером. 47. Вектор за п. 43, 44 або 46, де друга кодуюча послідовність кодує білок, який не є селектованим маркером. 48. Вектор за будь-яким з пп. 43-47, де перша і друга хромосомні послідовності є ендогенними хромосомними послідовностями. 49. Вектор за будь-яким з пп. 43-48, що додатково містить один або більше повторів першої послідовності-мішені. 50. Вектор за будь-яким з пп. 43-49, що додатково містить один або більше повторів другої послідовності-мішені. 51. Вектор за будь-яким з пп. 43-50, що додатково містить один або більше повторів третьої послідовності-мішені. 52. Спосіб введення екзогенної послідовності в геном рослинної клітини, де спосіб включає в себе стадії: (a) здійснення контакту клітини з направленим до мішені вектором за будь-яким з пп. 43-51; і (b) експресії однієї або більше нуклеаз в клітині, де одна або більше нуклеаз розщеплюють хромосомну ДНК в межах від 0,1 до 3 тисяч пар основ або від першої, або від другої хромосомної послідовності; за умови, що розщеплення хромосомної ДНК на стадії (b) стимулює вбудовування направленого до мішені вектора в геном за допомогою гомологічної рекомбінації. 53. Спосіб за п. 52, де одна або більше нуклеаз є злиттям між доменом розщеплення ендонуклеази рестрикції типу IIS і сконструйованим зв'язуючим доменом типу цинкового пальця. 54. Спосіб експресії білка в рослинній клітині, де спосіб включає в себе стадії: (a) здійснення контакту клітини з направленим до мішені вектором за будь-яким з пп. 43-51; і (b) експресії однієї або більше нуклеаз в клітині, де одна або більше нуклеаз розщеплюють хромосомну ДНК в межах від 0,1 до 3 тисяч пар основ або від першої або від другої хромосомної послідовності; за умови, що розщеплення хромосомної ДНК на стадії (b) стимулює вбудовування направленого до мішені вектора в геном за допомогою гомологічної рекомбінації. 55. Спосіб за п. 54, де одна або більше нуклеаз є злиттям між доменом розщеплення ендонуклеази рестрикції типу IIS і сконструйованим зв'язуючим доменом типу цинкового пальця. 56. Трансгенна рослинна клітина, одержана згідно зі способом за п. 52 або 53. 57. Рослина, що містить трансгенну рослинну клітину за п. 56. 58. Спосіб виключення послідовностей з геному трансгенної рослинної клітини, де спосіб включає в себе: (a) одержання трансгенної рослинної клітини за п. 56; і (b) експресію першої і другої нуклеаз в клітині, де перша нуклеаза розщеплює першу послідовність-мішень, і друга нуклеаза розщеплює другу послідовність-мішень. 59. Спосіб виключення послідовностей з геному трансгенної рослинної клітини, де спосіб включає в себе: (a) одержання трансгенної рослинної клітини за п. 56; і (b) експресію першої і другої нуклеаз в клітині, де перша нуклеаза розщеплює другу послідовність-мішень, і друга нуклеаза розщеплює третю послідовність-мішень. 60. Спосіб виключення послідовностей з геному трансгенної рослинної клітини, де спосіб включає в себе: (a) одержання трансгенної рослинної клітини за п. 56; і 6 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (b) експресію першої і другої нуклеаз в клітині, де перша нуклеаза розщеплює першу послідовність-мішень, і друга нуклеаза розщеплює третю послідовність-мішень. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фігури 1A і 1B є схематичним представленням направленої до мішені конструкції, названої pDAB1585. Фігура 1A є лінійним зображенням різних елементів конструкції. Фігура 1B є зображенням кільцевої конструкції. На фігурах 2A і 2B зображені приклади ZFN і їх сайти-мішені. На фігурі 2A зображені ZFN і області зв'язування. На фігурі 2B зображені сайти-мішені. Фігура 3 є схематичним уявленням плазміди pDAB1400. Фігура 4 є схематичним уявленням плазміди pDAB782. Фігура 5 є схематичним уявленням плазміди pDAB1582. Фігура 6 є схематичним уявленням плазміди pDAB354. Фігура 7 є схематичним уявленням плазміди pDAB1583. Фігура 8 є схематичним уявленням плазміди pDAB2407. Фігура 9 є схематичним уявленням плазміди pDAB1584. Фігура 10 є схематичним уявленням плазміди pDAB2418. Фігура 11 є схематичним уявленням плазміди pDAB4045. Фігура 12 є схематичним уявленням плазміди pDAB1575. Фігура 13 є схематичним уявленням плазміди pDAB1577. Фігура 14 є схематичним уявленням плазміди pDAB1579. Фігура 15 є схематичним уявленням плазміди pDAB1580. Фігура 16 є схематичним уявленням плазміди pDAB3401. Фігура 17 є схематичним уявленням плазміди pDAB1570. Фігура 18 є схематичним уявленням плазміди pDAB1572. Фігура 19 є схематичним уявленням плазміди pDAB4003. Фігура 20 є схематичним уявленням плазміди pDAB1571. Фігура 21 є схематичним уявленням плазміди pDAB7204. Фігура 22 є схематичним уявленням плазміди pDAB1573. Фігура 23 є схематичним уявленням плазміди pDAB1574. Фігура 24 є схематичним уявленням плазміди pDAB1581. Фігура 25 є схематичним уявленням плазміди pDAB1576. Фігури 26A і 26B є схематичним представленням направленого до мішені плазмідного вектора, названого pDAB1600. Фігура 26A є лінійним зображенням різних елементів плазміди. Фігура 26B є зображенням кільцевий плазміди. Фігура 27 є схематичним уявленням плазміди pDAB7002. Фігура 28 є схематичним уявленням плазміди pDAB7025. Фігура 29 є схематичним уявленням плазміди pDAB1591. Фігура 30 є схематичним уявленням плазміди pcDNA3.1-IL1-L0-FokI. Фігура 31 є схематичним уявленням плазміди pcDNA3.1-SCD27-L0-FokI. Фігура 32 є схематичним уявленням плазміди pDAB1592. Фігура 33 є схематичним уявленням плазміди pDAB1594. Фігури 34 А, В і С є схематичним уявленням плазмід pDAB1596 і pDAB1598. Фігура 34A є схемою лінеаризованих плазмід. На фігурі 34B показана pDAB1596. На фігурі 34C показана pDAB1598. Фігура 35 є схематичним уявленням плазміди pDAB1577. Фігура 36 є схематичним уявленням плазміди pDAB1578. Фігури 37A і В є схематичним уявленням плазміди pDAB1601. На фігурі 37A показані різні елементи в лінійній формі. На фігурі 37B показана кільцева плазміда. Фігура 38 є схематичним зображенням міжхромосомної гомологічної прогнозованої рекомбінації, яка стимулюється злиттям IL-1 ZFN-FokI. Фігура 39 є схематичним зображенням міжхромосомної гомологічної прогнозованої рекомбінації, що стимулюється злиттям Scd27 ZFN-FokI. На фігурі 40 показаний ПЛР-аналіз рекомбінантів. На доріжках, позначених 1-20, показані події гомологічної рекомбінації внаслідок трансформації NT1-240 конструкцією злитого білка SCD27-FokI. На доріжках, позначених 21 і 22, показані події гомологічної рекомбінації внаслідок трансформації NT1-240 конструкцією злитого білка SCD27-FokI. Контрольні доріжки показані у вигляді 3 розташованих зліва доріжок. На фігурі 41 показаний Саузерн-блот-аналіз рекомбінантів. На доріжках, позначених 1-20, показані події гомологічної рекомбінації внаслідок трансформації NT1-240 конструкцією злитого білка SCD27-FokI. На доріжках, позначених 21 і 22, показані події гомологічної рекомбінації 7 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 внаслідок трансформації NT1-240 конструкцією злитого білка SCD27-FokI. Контрольні доріжки показані у вигляді 2 розташованих зліва доріжок. Фігура 42 є схематичним зображенням внутрішньохромосомної гомологічної прогнозованої рекомбінації, що стимулюється злиттям IL-1 ZFN-FokI. На фігурі 43 показаний ПЛР-аналіз, який підтверджує, що GFP реконструюється у флуоресціюючих тканинах, що експресують злитий білок IL-1-FokI. Фігура 44 є схематичним уявленням плазміди pSB11. Фігура 45 є схематичним уявленням плазміди pSB1. Фігура 46 є схематичним уявленням плазміди pDAB3872. Фігура 47 є схематичним уявленням плазміди pDAB4365. ДОКЛАДНИЙ ОПИС У даному описі розкриті композиції і способи, застосовні для цілеспрямованого розщеплення хроматину рослинної клітини і для цілеспрямованої зміни нуклеотидної послідовності рослинної клітини, наприклад, за допомогою цілеспрямованого розщеплення з подальшою внутрішньохромосомною гомологічною рекомбінацією або цілеспрямованим розщепленням з подальшою гомологічною рекомбінацією між екзогенним полінуклеотидом (що містить одну або більше ділянок гомології з клітинною нуклеотидною послідовністю) і геномною послідовністю. Геномні послідовності включають послідовності, присутні в хромосомах, епісомах, геномах органел (наприклад, мітохондрій, хлоропластів), штучних хромосомах і будь-якому іншому типі нуклеїнової кислоти, присутньої в клітині, наприклад такої, як ампліфіковані послідовності, подвійні мікрохромосоми і геноми ендогенних або інфікуючих бактерій і вірусів. Геномні послідовності можуть бути нормальними (тобто, дикого типу) або мутантними; мутантні послідовності можуть містити, наприклад, інсерції, делеції, транслокації, перебудови і/або точкові мутації. Геномна послідовність також може містити один з декількох різних алелей. Композиції, застосовні для цілеспрямованого розщеплення і рекомбінації, містять злиті білки, що містять домен розщеплення (або напівдомен розщеплення) і зв'язуючий домен типу цинкового пальця, полінуклеотиди, що кодують такі білки, і комбінацію поліпептидів і кодуючу поліпептиди полінуклеотидів. Зв'язуючий домен типу цинкового пальця може містити один або більше цинкових пальців (наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або більше цинкових пальців) і може бути сконструйований так, щоб він зв'язувався з будь-якою геномною послідовністю. Таким чином, ідентифікуючи представляючу інтерес геномну область-мішень, в якій потрібне розщеплення або рекомбінація, можна згідно зі способами, розкритими в даному описі, сконструювати один або більше злитих білків, що містять домен розщеплення (або напівдомен розщеплення) і домен цинкового пальця, сконструйовану для впізнавання послідовності-мішені у вказаній геномній області. Присутність такого злитого білка (або білків) в клітині призведе до зв'язування злитого білка (білків) з сайтом (сайтами) його (їх) зв'язування і розщеплення в межах або поблизу вказаної області геному. Крім того, якщо в такій клітині також присутній екзогенний полінуклеотид, гомологічній геномній області, то з високою імовірністю відбувається гомологічна рекомбінація між геномною областю і екзогенним полінуклеотидом. Загальне Для практичного здійснення способів, а також для одержання і застосування композицій, розкритих в даному описі, якщо не вказане інше, використовують звичайні методики молекулярної біології, біохімії, аналізу структури хроматину, обчислювальної хімії, культивування клітин, рекомбінантної ДНК і близьких галузей, які відомі фахівцям в даній галузі. Такі методики повно описані літературі. Див., наприклад, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: А LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sorts, New York, 1987 and periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; and METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999. Визначення Терміни "нуклеїнова кислота", "полінуклеотид" і "олігонуклеотид" використовують взаємозамінно, і вони стосуються дезоксирибонуклеотидного або рибонуклеотидного полімеру в лінійній або кільцевій конформації і або в однонитковій, або в двонитковій формі. З метою даного опису такі терміни не треба вважати обмежувальними відносно довжини полімеру. Терміни можуть охоплювати відомі аналоги природних нуклеотидів, а також нуклеотидів, які модифіковані за основою, залишками цукру і/або фосфату (наприклад, фосфоротіоатний 8 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 скелет). Загалом, аналог конкретного нуклеотиду має таку ж специфічність в спарюванні основ; тобто аналог А буде спарюватися з Т. Терміни "поліпептид", "пептид" і "білок" використовують взаємозамінно по відношенню до полімеру, що складається з амінокислотних залишків. Термін також застосовний до полімерів, що складаються з амінокислот, в яких одна або більше амінокислот є хімічними аналогами або модифікованими похідними відповідних амінокислот, що зустрічаються в природі. "Зв'язування" стосується специфічної для послідовності, нековалентної взаємодії між макромолекулами (наприклад, між білком і нуклеїновою кислотою). Не всі компоненти, що беруть участь у взаємодії при зв'язуванні повинні бути специфічними для послідовності (наприклад, контакти із залишками фосфату в скелету ДНК), за умови, що взаємодія загалом є специфічною для послідовності. Такі взаємодії зазвичай характеризують константою дисоціації -6 -1 (Kd) 10 M або нижче. "Афінність" стосується сили зв'язування: більш висока афінність зв'язування корелює з більш низькою Kd. "Зв'язуючий білок" являє собою білок, який здатний нековалентно зв'язуватися з іншою молекулою. Зв'язуючий білок може зв'язуватися, наприклад, з молекулою ДНК (DNA-зв'язуючий білок), молекулою РНК (РНК-зв'язуючий білок) і/або молекулою білка (білок-зв'язуючий білок). У випадку білок-зв'язуючого білка він може зв'язуватися з таким же білком (з утворенням гомодимеру, гомотримеру і т.д.) і/або він може зв'язуватися з однією або декількома молекулами іншого білка або білків. Зв'язуючий білок може мати більше ніж один тип активності зв'язування. Наприклад, білки з цинковими пальцями мають ДНК-зв'язуючу, РНК-зв'язуючу і білок-зв'язуючу активність. "Зв'язуючий ДНК білок з цинковими пальцями" (або зв'язуючий домен) являє собою білок або домен в більш великому білку, який зв'язує ДНК специфічним для послідовності чином за допомогою одного або декількох цинкових пальців, які є областями амінокислотної послідовності в зв'язуючому домені, структура яких стабілізується внаслідок координаційного зв'язування іона цинку. Термін зв'язуючий ДНК білок з цинковими пальцями часто скорочують і називають білком з цинковими пальцями або ZFP. Зв'язуючі домени типу цинкового пальця можуть бути "сконструйовані" так, щоб вони зв'язувалися з нуклеотидною послідовністю, що заздалегідь визначається. Не обмежуючі прикладами способів створення білків з цинковими пальцями є конструювання і відбір. Сконструйований білок з цинковими пальцями являє собою білок, що не зустрічається в природі, дизайн/склад якого, головним чином, оснований на раціональних критеріях. Раціональні критерії для конструювання включають застосування правил заміни і комп'ютеризовані алгоритми для обробки інформації в базі даних, що зберігає інформацію про існуючі конструкції ZFP і дані про зв'язування. Див., наприклад, патенти США 6140081, 6453242, 6534261 і 6785613; див., також WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 і WO 03/016496; і патенти США 6746838, 6866997 і 7030215. "Відібраний" при селекції білок з цинковими пальцями являє собою білок, що не зустрічається в природі, одержання якого, головним чином, основане на емпіричному процесі, такому як фаговий дисплей, пастка взаємодії або селекція гідридів. Див., наприклад, US 5789538, US 5925523, US 6007988, US 6013453, US 6200759, US 6733970, US RE39229 і WO 95/19431, WO 96/06166, WO 98/53057, WO 98/54311, WO 00/27878, WO 01/60970, WO 01/88197 і WO 02/099084. Термін "послідовність" стосується нуклеотидної послідовності будь-якої довжини, яка може являти собою ДНК або РНК; може бути лінійною, кільцевою або розгалуженою і може бути або однонитковою, або двонитковою. Термін "донорна послідовність" стосується нуклеотидної послідовності, яку вбудовують в геном. Донорна послідовність може бути будь-якої довжини, наприклад, довжиною від 2 до 25000 нуклеотидів (або будь-яке ціле значення між ними або вище), переважно довжиною приблизно від 100 до 5000 нуклеотидів (або будь-яке ціле число між ними), більш переважно довжиною приблизно від 200 до 2500 нуклеотидів. "Гомологічна послідовність" стосується першої послідовності, яка має певну міру ідентичності за послідовністю з другою послідовністю, і послідовність якої може бути ідентична другій послідовності. "Гомологічна неідентична послідовність" стосується першої послідовності, яка має певну міру ідентичності за послідовністю з другою послідовністю, але послідовність якої повністю не ідентична другій послідовності. Наприклад, полінуклеотид, що містить послідовність дикого типу, що відповідає мутантному гену, гомологічна, але не ідентична послідовності мутантного гена. У деяких варіантах міра гомології між двома послідовностями достатня для забезпечення гомологічної рекомбінації між ними з використанням звичайних клітинних механізмів. Дві гомологічні неідентичні послідовності можуть бути будь-якої довжини і ступені відхилення від їх гомології може складати всього один нуклеотид (наприклад, для корекції 9 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 геномної точкової мутації за допомогою цілеспрямованої гомологічної рекомбінації) або може складати до 10 або більше тисяч нуклеотидів (наприклад, для інсерції гена в ділянку хромосоми, що заздалегідь визначається). Два полінуклеотиди, що містять гомологічні неідентичні послідовності не повинні бути обов'язково однієї і тієї ж довжини. Наприклад, можна використовувати екзогенний полінуклеотид (тобто донорний полінуклеотид) довжиною від 20 до 10000 нуклеотидів або пар основ. Способи визначення ідентичності послідовностей нуклеїнових кислот і амінокислотних послідовностей відомі в даній галузі. Зазвичай такі способи включають в себе визначення нуклеотидної послідовності мРНК для гена і/або визначення амінокислотної послідовності, що кодується при цьому і порівняння таких послідовностей з другою нуклеотидною або амінокислотною послідовністю. Геномні послідовності також можна визначити і порівняти подібним способом. Загалом, ідентичність стосується точної відповідності нуклеотиду з нуклеотидом або амінокислоти з амінокислотою в двох полінуклеотидах або поліпептидних послідовностях, відповідно. Дві або більше послідовностей (полінуклеотидних або амінокислотних) можна порівнювати за допомогою визначення їх ідентичності в процентах. Ідентичність двох послідовностей в процентах, або послідовностей нуклеїнових кислот, або амінокислотних послідовностей, являє собою кількість точних збігів між двома вирівняними послідовностями, поділену на довжину більш коротких послідовностей і помножену на 100. Наближене вирівнювання послідовностей нуклеїнових кислот здійснюють з використанням алгоритму локальної гомології Сміта і Уотермана, Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981). Такий алгоритм можна застосовувати до амінокислотних послідовностей, використовуючи матрицю підрахунку, розроблену Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure. M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, і нормалізовану Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6): 6745-6763 (1986). Ілюстративне застосування такого алгоритму для визначення ідентичності послідовностей в процентах пропонується Genetics Computer Group (Madison, WI) в заявці на застосування "BestFit". Параметри, що використовуються за замовчуванням в такому способі, описані в керівництві до пакету програм для аналізу послідовностей Wisconsin, версія 8 (1995) (доступному з Genetics Computer Group, Madison, WI). Переважним способом встановлення ідентичності в процентах в контексті даного опису є використання пакету програм MPSRCH, авторські права на який належать University of Edinburgh, який розроблений John F. Collins і Shane S. Sturrok і розповсюджується IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). З вказаного комплекту програм можна застосовувати алгоритм Сміта-Уотермана, де використовують параметри за замовчуванням для таблиці підрахунку (наприклад, штраф за внесення пробілу 12, штраф за продовження пробілу одиниця, і пробіл шість). Одержане на підставі даних значення "Збіг" відображає ідентичність послідовностей. Інші відповідні програми для розрахунку ідентичності в процентах або схожості між послідовностями загалом відомі в даній галузі, наприклад, програмою, основаною на іншому алгоритмі, є BLAST, що використовується з параметрами за замовчуванням. Наприклад, BLASTN і BLASTP можна застосовувати, використовуючи наступні параметри за замовчуванням: генетичний код = стандартний; фільтр = немає; нитка = обидві; межа відсікання = 60; очікування = 10; матриця = BLOSUM62; описи = 50 послідовностей; відбір = за максимальною схожістю HIGH SCORE; бази даних = Non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. Докладний опис таких програм можна знайти в Інтернеті. Що стосується послідовностей, описаних в даній публікації, то діапазон необхідної міри ідентичності послідовностей складає приблизно від 35 % до 100 % і будь-яке ціле значення між ними. Зазвичай ідентичність в процентах між послідовностями становить щонайменше 35 %-40 %; 40 %-45 %; 45 %-50 %; 50 %-60 %; 60 %70 %; 70-75 %, переважне 80-82 %, більш переважно, 85-90 %, ще більш переважно, 92 %, ще більш переважно, 95 % і, найбільш переважно, 98 % ідентичність послідовностей. Альтернативно міра схожості за послідовністю між полінуклеотидами можна визначити за допомогою гібридизації полінуклеотидів в умовах, які забезпечують можливість утворення стабільних дуплексів між гомологічніми областями, з подальшим розщепленням специфічною для однониткової молекули нуклеази (нуклеаз) і визначенням розміру розщеплених фрагментів. Дві послідовності нуклеїнових кислот або дві поліпептидні послідовності, по суті, гомологічні одна одній, коли послідовності мають щонайменше приблизно 70 %-75 %, переважно, 80 %82 %, більш переважно, 85 %-90 %, ще більш переважно, 92 %, ще більш переважно 95 % і найбільш переважно 98 % ідентичність послідовностей протягом певної довжини молекул, яку визначають, використовуючи описані вище способи. У використовуваному в даному описі значенні "по суті гомологічні" також стосується послідовностей, що мають повну ідентичність з конкретною послідовністю ДНК або поліпептиду. Послідовності ДНК, які по суті гомологічні, 10 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можуть бути ідентифіковані в експерименті з Саузерн-гібридизації, наприклад, в жорстких умовах, які визначені для такої конкретної системи. Визначення відповідних умов гібридизації відоме фахівцям в даній галузі. Див., наприклад, Sambrook et al., вище; Nucleic Acid Hybridization: А Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press). Селективна гібридизація двох фрагментів нуклеїнової кислоти може бути визначена таким чином. Ступінь ідентичності послідовностей між двома молекулами нуклеїнових кислот впливає на ефективність і силу подій гібридизації між такими молекулами. Частково ідентична послідовність нуклеїнової кислоти буде щонайменше частково інгібувати гібридизацію повністю ідентичної послідовності з молекулою-мішенню. Інгібування гібридизації повністю ідентичної послідовності можна оцінити, використовуючи аналізи гібридизації, які добре відомі в даній галузі (наприклад, Саузерн-блот-гібридизація (ДНК), Нозерн-блот-гібридизація (РНК), гібридизація в розчині або тому подібне, див. Sambrook, et al., Molecular Cloning: - А Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Такі аналізи можна провести, використовуючи різні міри вибірковості, наприклад, використовуючи умови, що варіюють від низької до високої жорсткості. Якщо використовують умови низької жорсткості, то відсутність неспецифічного зв'язування можна оцінити, використовуючи другий зонд, який не має навіть часткової міри ідентичності послідовностей (наприклад, зонд, що має приблизно менше 30 % ідентичність послідовності з молекулою-мішенню), так що у відсутність подій неспецифічного зв'язування другий зонд не буде гібридизуватися з мішенню. При використанні основаної на гібридизації системи реєстрації вибирають такий зонд нуклеїнової кислоти, який комплементарний еталонній послідовності нуклеїнової кислоти, і потім у випадку вибору відповідних умов зонд і еталонна послідовність вибірково гібридизуются або зв'язуються один з одним з утворенням дуплексної молекули. Молекула нуклеїнової кислоти, яка здатна вибірково гібридизуватися з еталонною послідовністю в умовах гібридизації помірної жорсткості, зазвичай гібридизуется в умовах, які забезпечують можливість виявлення послідовності нуклеїнової кислоти-мішені довжиною щонайменше приблизно 10-14 нуклеотидів, що має щонайменше приблизно 70 % ідентичність послідовності з послідовністю вибраною нуклеїновою кислоти-зонда. Жорсткі умови гібридизації зазвичай дозволяють виявляти послідовності нуклеїнових кислот-мішеней довжиною щонайменше приблизно 10-14 нуклеотидів, що мають ідентичність послідовності більше ніж приблизно 90-95 % з послідовністю вибраної нуклеїнової кислоти-зонда. Умови гібридизації, застосовні для гібридизації зонд/еталонна послідовність, коли зонд і еталонна послідовність мають певну міру ідентичності послідовностей, можна визначити, як відомо в даній галузі (див., наприклад, Nucleic Acid Hybridization: А Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press). Умови гібридизації добре відомі фахівцям в даній галузі. Жорсткість гібридизації належить до ступені, в якій умови гібридизації не сприяють утворенню гібридів, що містять помилково спарені нуклеотиди, при цьому більш висока жорсткість корелює з меншою імовірністю допуску гібридів з помилковими спарюваннями. Фактори, які впливають на жорсткість гібридизації, добре відомі фахівцям в даній галузі і включають без обмеження температуру, pH, іонну силу і концентрацію органічних розчинників, таких як, наприклад, формамід і диметилсульфоксид. Як відомо фахівцям в даній галузі, жорсткість гібридизації підвищується при більш високих температурах, більш низькій іонній силі і більш низьких концентраціях розчинників. Що стосується умов жорсткості для гібридизації, то в даній галузі добре відомо, що можна використовувати численні еквівалентні умови, щоб встановити конкретну жорсткість, варіюючи, наприклад, наступні фактори: довжину і природу послідовностей, склад основ різних послідовностей, концентрації солей і інших компонентів в розчині для гібридизації, наявність або відсутність блокуючих агентів в розчинах для гібридизації (наприклад, сульфат декстрану і поліетиленгліколь), температуру реакції гібридизації і часові параметри, а також варіюючи умови промивки. Вибір конкретного набору умов гібридизації здійснюють, слідуючи стандартним для даної галузі способам (див., наприклад, Sambrook, et al., Molecular Cloning: А Laboratory Manual. Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). "Рекомбінація" стосується процесу обміну генетичною інформацією між двома полінуклеотидами. З метою даного опису термін "гомологічна рекомбінація (HR)» стосується спеціалізованої форми такого обміну, який має місце, наприклад, під час репарації двониткових розривів в клітинах. Для такого процесу потрібна гомологія нуклеотидних послідовностей, використовується "донорна" молекула як матриця для репарації молекули-"мішені" (тобто молекули, в якій стався двонитковий розрив), і процес інакше називають "некросоверною генною конверсією" або "генною конверсією на короткій ділянці", оскільки він призводить до 11 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 перенесення генетичної інформації з донорної молекули в мішень. Не маючи наміру бути пов'язаними з будь-якою конкретною теорією, вважають, що в таке перенесення може бути залучена корекція помилкового спарювання в гетеродуплексі ДНК, який утворюється між мішенню, що має розрив, і донором і/або "залежний від синтезу відпал ниток", в якому донор використовується для ресинтезу генетичної інформації, яка стане частиною мішені, і/або споріднені процеси. Така специфічна HR часто призводить до зміни послідовності молекулимішені, так що частина або вся послідовність донорного полінуклеотиду включається в полінуклеотид-мішень. "Розщеплення" стосується розриву ковалентного скелета молекули ДНК. Розщеплення може бути ініційоване різними способами, включаючи без обмеження ферментативний або хімічний гідроліз фосфодіефірного зв'язку. Можливо розщеплення і однієї нитки і обох ниток, і двониткове розщеплення може відбуватися внаслідок двох окремих подій однониткового розщеплення. Розщеплення ДНК може призводити до утворення або тупих кінців, або виступаючих кінців. У деяких варіантах використовують злиті поліпептиди для цілеспрямованого двониткового розщеплення ДНК. "Домен розщеплення" містить одну або більше поліпептидних послідовностей, які мають каталітичну активність у відношенні розщеплення ДНК. Домен розщеплення може входити до складу одного поліпептидного ланцюга або активність в розщепленні може бути результатом асоціації двох (або більше) поліпептидів. "Напівдомен розщеплення" являє собою поліпептидну послідовність, яка разом з другим поліпептидом (або ідентичним, або відмінним від нього) утворює комплекс, що має активність в розщепленні (переважно активність в двонитковому розщепленні). "Хроматин" являє собою нуклеопротеїдну структуру, що містить клітинний геном. Клітинний хроматин містить нуклеїнову кислоту, головним чином ДНК, і білок, включаючи гістони і негістонові хромосомні білки. Велика частина хроматину еукаріотичних клітин існує в формі нуклеосом, при цьому кор нуклеосоми містить приблизно 150 пар основ ДНК, асоційованих з октамером, що містить по два кожного з гістонів H2A, H2B, H3 і H4; і лінкерна ДНК (різної довжини залежно від організму) розташовується між нуклеосомними корами. Молекула гістону H1 зазвичай асоційована з лінкерною ДНК. З метою даного опису розуміється, що термін "хроматин" охоплює всі типи клітинного нуклеопротеїду, як прокаріотичного, так і еукаріотичного. Клітинний хроматин включає як хромосомний, так і епісомний хроматин. "Хромосома" означає хроматиновий комплекс, що містить весь або частина геному клітини. Геном клітини часто характеризують каріотипом, який являє собою набір всіх хромосом, що містить геном клітини. Геном клітини може містити одну або більше хромосоми. "Епісома" являє собою реплікувальну нуклеїнову кислоту, нуклеопротеїдний комплекс або іншу структуру, що містить нуклеїнову кислоту, яка не є частиною хромосомного каріотипу клітини. Приклади епісом включають плазміди і деякі вірусні геноми. "Доступна ділянка" означає ділянку клітинного хроматину, в якій сайт-мішень, присутній в нуклеїновій кислоті, може бути пов'язаний екзогенною молекулою, яка впізнає сайт-мішень. Не маючи наміру бути пов'язаними з будь-якою конкретною теорією, вважають, що доступна область є областю, яка не упакована в нуклеосомну структуру. Відмінну структуру доступної області часто можна виявити за її чутливістю до хімічних і ферментативних зондів, наприклад, нуклеаз. "Сайт-мішень" або "послідовність-мішень" являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, яка визначає частину нуклеїнової кислоти, з якою буде зв'язуватися зв'язуюча молекула, за умови, що існують достатні умови для зв'язування. Наприклад, послідовність 5'-GAATTC-3' є сайтом-мішенню для ендонуклеази рестрикції Eco RI. "Екзогенною" молекулою є молекула, яка в нормі не присутня в клітині, але може бути введена в клітину одним або декількома генетичними, біохімічними або іншими способами. "Присутність в клітині в нормі" визначають по відношенню до конкретної стадії розвитку і умов навколишнього середовища для клітини. Таким чином, наприклад, молекула, яка присутня тільки під час ембріонального розвитку м'яза, є екзогенною молекулою для м'язової клітини у дорослому стані. Подібним чином молекула, що індукується тепловим шоком, є екзогенною молекулою по відношенню до не індукованої тепловим шоком клітини. Екзогенна молекула може містити, наприклад, функціонуючий варіант непрацюючої ендогенної молекули або непрацюючого варіант функціонуючої в нормі ендогенної молекули. Екзогенна молекула нарівні з іншими формами може являти собою малу молекулу, таку як молекула, створена способом комбінаторної хімії, або макромолекулу, таку як білок, нуклеїнова кислота, вуглевод, ліпід, глікопротеїд, ліпопротеїд, полісахарид, будь-яке модифіковане похідне вказаних вище молекул або будь-який комплекс, що містить одну або більше вказаних вище 12 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 молекул. Нуклеїнові кислоти включають ДНК і РНК, можуть бути одно- або двонитковими; можуть бути нерозгалуженими, розгалуженими або кільцевими; і можуть мати будь-яку довжину. Нуклеїнові кислоти включають такі нуклеїнові кислоти, які здатні утворювати дуплекси, а також нуклеїнові кислоти, що утворюють триплекси. Див., наприклад, патенти США №5176996 і 5422251. Білки включають без обмеження ДНК-зв'язуючі білки, транскрипційні фактори, фактори ремоделювання хроматину, білки, що зв'язують метильовану ДНК, полімерази, метилази, деметилази, ацетилази, деацетилази, кінази, фосфатази, інтегрази, рекомбінази, лігази, топоізомерази, гірази і гелікази. Екзогенна молекула може стосуватися того ж типу молекул, що і ендогенна молекула, наприклад, екзогенний білок або нуклеїнова кислота. Наприклад, екзогенна нуклеїнова кислота може містити геном інфікуючого вірусу, Т-нитку Agrogacterium tumefacians, плазміду або епісому, введену в клітину, або хромосому, який в нормі не присутній в клітині. Способи введення екзогенних молекул в клітини відомі фахівцям в даній галузі і включають без обмеження опосередковане ліпідами перенесення (тобто ліпосоми, що містять нейтральні і катіонні ліпіди), електропорацію, пряму ін'єкцію, злиття клітин, бомбардування частинками, копреципітацію фосфатом кальцію, опосередковане DEAE-декстраном перенесення і перенесення, опосередковане вірусними векторами. Навпаки, "ендогенна" молекула є молекулою, яка в нормі присутня в конкретній клітині на конкретній стадії розвитку в конкретних умовах навколишнього середовища. Наприклад, ендогенна нуклеїнова кислота може включати хромосому, геном мітохондрії, хлоропласту або іншого органоїду, або епісомну нуклеїнову кислоту, що зустрічається в природі. Додаткові ендогенні молекули можуть включати білки, наприклад, фактори транскрипції і ферменти. "Злита" молекула є молекулою, в якій зв'язані дві або більше молекул-субодиниць, переважно ковалентно. Субодиничні молекули можуть являти собою молекули одного і того ж хімічного типу або можуть бути молекулами різних хімічних типів. Приклади злитої молекули першого типу включають без обмеження злиті білки (наприклад, злиття між ДНК-зв'язуючим доменом ZFP і доменом розщеплення) і злиті нуклеїнові кислоти (наприклад, нуклеїнова кислота, що кодує злитий білок, описаний вище). Приклади злитої молекули другого типу включають без обмеження злиття між нуклеїновою кислотою, що утворює триплекс, і поліпептидом, і злиттяміж агентом, що зв'язує малу борозенку, і нуклеїновою кислотою. Експресія злитого білка в клітині може бути результатом доставки злитого білка до клітини або доставки полінуклеотиду, що кодує злитий білок, до клітини, при цьому полінуклеотид транскрибується, і транскрипт транслюється з утворенням злитого білка. Транс-сплайсинг, розщеплення поліпептиду і лігування поліпептидів також можуть бути залучені до експресії білка в клітині. Способи доставки полінуклеотидів і поліпептидів в клітини описані далі в даному описі. Термін "генів" з метою даного опису включає область ДНК, що кодує генний продукт (див. нижче), а також області ДНК, які регулюють продукцію генного продукту, незалежно від того, чи є такі регуляторні послідовності сусідніми по відношенню до кодуючих і/або транскрибуючих послідовностей. Відповідно, ген включає, але не обов'язково обмежений, промоторними послідовностями, термінаторами, послідовностями регуляції трансляції, такими як сайти зв'язування рибосом і внутрішні сайти зв'язування рибосом, енхансери, сайленсери, інсулятори, суміжні елементи, початки реплікації, ділянки зв'язування з матриксом і області регуляції локусу. "Генна експресія" стосується перетворення інформації, що знаходиться в гені, на генний продукт. Генний продукт може бути безпосереднім продуктом транскрипції гена (наприклад, мРНК, тРНК, рРНК, антисмислова РНК, рибозим, структурна РНК або будь-який інший тип РНК) або білком, що утворюється при трансляції мРНК. Генні продукти також включають РНК, які модифіковані внаслідок таких процесів, як кепування, поліаденілування, метилування і редагування, і білки, модифіковані, наприклад, метилуванням, ацетилуванням, фософорилуванням, убіквітинуванням, АДФ-рибозилуванням, міристилуванням і глікозилуванням. "Модулювання" генної експресії стосується зміни активності гена. Модулювання експресії може включати без обмеження активацію гена і репресію гена. "Рослинні" клітини включають без обмеження клітини односім'ядольних або двосім'ядольних рослин. Не обмежуючі приклади односім'ядольних включають сільськогосподарські рослини, такі як кукурудза, рис, ячмінь, овес, пшениця, сорго, жито, цукрова тростина, ананас, цибуля, банан і кокос. Не обмежуючі приклади двосім'ядольних включають тютюн, томат, соняшник, бавовну, цукровий буряк, картоплю, латук, диню, канолу (рапс) і люцерну. Рослинні клітини можуть бути з будь-якої частини рослини і/або будь-якої стадії розвитку рослини. 13 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "представляюча інтерес область" означає будь-яку область клітинного хроматину, таку як, наприклад, ген або некодуюча послідовність в гені або поблизу гена, в якій потрібно зв'язати екзогенну молекулу. Зв'язування може бути здійснене для цілеспрямованого розщеплення ДНК і/або цілеспрямованої рекомбінації. Представляюча інтерес область може бути присутньою в хромосомі, епісомі, геномі органоїду (наприклад, мітохондрії, хлоропласту), або, наприклад, в геномі інфікуючого вірусу. Представляюча інтерес область може знаходитися в кодуючій області гена, в транскрибованих некодуючих областях, таких як, наприклад, лідерні послідовності, трейлерні послідовності або інтрони, або в нетранскрибованих областях, або вище, або нижче кодуючої області. Представляюча інтерес область може мати найменшу довжину в одну пару основ або довжину до 25000 пар основ, або будь-яке ціле число пар основ. Терміни "оперативне зв'язування" і "оперативно зв'язаний" використовують взаємозамінні відносно взаємного положення двох або більше компонентів (таких як елементи послідовності), при якому компоненти розташовані так, що обидва компоненти нормально функціонують і забезпечують можливість того, що щонайменше один з компонентів може опосередковувати функцію, на яку впливає щонайменше один з інших компонентів. З метою ілюстрації послідовності регуляції транскрипції, така як промотор, оперативно зв'язана з кодуючою послідовністю, якщо послідовність регуляції транскрипції регулює рівень транскрипції кодуючої послідовності у відповідь на присутність або відсутність одного або декількох факторів регуляції транскрипції. Послідовність регуляції транскрипції зазвичай оперативно зв'язана в цисположенні з кодуючою послідовністю, але не обов'язково в безпосередній близькості з нею. Наприклад, енхансер являє собою послідовність регуляції транскрипції, яка оперативно зв'язана з кодуючою послідовністю, хоча вони не є сусідніми. Що стосується злитих поліпептидів, то термін "оперативно зв'язаний" може належати до того факту, що кожний з компонентів здійснює одну і ту ж функцію, знаходячись в зв'язку з іншим компонентом, так само як він виконував би її, будучи не пов'язаним. Наприклад, по відношенню до злитого поліпептиду, в якому ДНК-зв'язуючий домен ZFP злитий з доменом розщеплення, ДНК-зв'язуючий домен ZFP і домен розщеплення знаходяться в оперативному зв'язку, якщо в злитому поліпептиді частина, представлена ДНК-зв'язуючим доменом ZFP, здатна зв'язувати сайт-мішень і/або сайт-зв'язування, тоді як домен розщеплення здатний розщеплювати ДНК поблизу сайту-мішені. "Функціональний фрагмент" білка, поліпептиду або нуклеїнової кислоти являє собою білок, поліпептид або нуклеїнову кислоту, послідовність яких не ідентична до повнорозмірного білка, поліпептиду або нуклеїнової кислоти, але все ще зберігає таку ж функцію, як і повнорозмірний білок, поліпептид або нуклеїнова кислота. Функціональний фрагмент може мати більше, менше або таку ж кількість залишків, як і відповідна нативна молекула, і/або може містити одну або більше амінокислотних або нуклеотидних замін. Способи визначення функції нуклеїнової кислоти (наприклад, кодуючої функції, здатності гібридизуватися з іншою нуклеїновою кислотою) добре відомі в даній галузі. Подібним чином добре відомі способи визначення функції білка. Наприклад, ДНК-зв'язуючу функцію поліпептиду можна визначити, наприклад, зв'язуванням на фільтрі, за зсувом електрофоретичної рухливості або в аналізах імунопреципітації. Розщеплення ДНК можна оцінити з використанням гель-електрофорезу. Див. Ausubel et al., вище. Здатність білка взаємодіяти з іншим білком можна визначити, наприклад, спільною імунопреципітацією, двогібридним аналізом або аналізом комплементації, як генетичної, так і біохімічної. Див., наприклад, Fields et al. (1989) Nature 340: 245-246; патент США No. 5585245 і PCT WO 98/44350. Сайти-мішені Розкриті способи і композиції включають злиті білки, що містять домен розщеплення (або напівдомен розщеплення) і домен типу цинкового пальця, в яких домен типу цинкового пальця при зв'язуванні з послідовністю в клітинному хроматині (наприклад, сайтом-мішенню або сайтом зв'язування) управляє активністю домену розщеплення (або напівдомену розщеплення) на ділянці поблизу послідовності і, отже, індукує розщеплення поблизу послідовності-мішені. Як указано в даному описі домен типу цинкового пальця може бути сконструйований так, щоб він зв'язувався фактично з будь-якою необхідною послідовністю. Відповідно, після ідентифікації представляючої інтерес області, що містить послідовність, в якій потрібне розщеплення або рекомбінація, може бути сконструйований один або більш зв'язуючих доменів типу цинкового пальця для зв'язування з однією або декількома послідовностями в представляючій інтерес області. Експресія злитого білка, що містить зв'язуючий домен типу цинкового пальця і домен розщеплення (або два злитих білки, кожний з яких містить зв'язуючий домен типу цинкового пальця і напівдомен розщеплення), в клітині призводить до розщеплення в представляючій інтерес області. 14 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відбір послідовності в клітинному хроматині для зв'язування доменом типу цинкового пальця (наприклад, сайту-мішені) можна здійснити, наприклад, згідно зі способами, розкритими в патенті США того ж автора No. 6453242 (17 вересня, 2002), в якому також описані способи конструювання ZFP для зв'язування з вибраною послідовністю. Фахівцям в даній галузі буде зрозуміло, що простий візуальний перегляд нуклеотидної послідовності також можна використовувати для відбору сайту-мішені. Відповідно, в заявлених способах можна використовувати будь-які способи відбору сайту-мішені. Сайти-мішені загалом складаються з множини сусідніх підсайтів-мішеней. Підсайт-мішень стосується послідовності (зазвичай або до триплету нуклеотидів, або до квадруплету нуклеотидів, який може перекриватися одним нуклеотидом з сусіднім квадруплетом), що зв'язується окремим цинковим пальцем. Див., наприклад, WO 02/077227. Якщо нитка, з якою білок з цинковими пальцями має найбільші контакти, назвати ниткою-мішенню, "основною ниткою впізнавання" або "основною ниткою для контакту", то деякі білки з цинковими пальцями зв'язуються з триплетом з три нуклеотидів в нитці-мішені і четвертому нуклеотидом на нитці, що не є мішенню. Сайт-мішень зазвичай має довжину, що складає щонайменше 9 нуклеотидів і, відповідно, зв'язується зв'язуючим доменом типу цинкових пальців, що містить щонайменше три цинкових пальці. Однак також може бути зв'язування, наприклад, 4-пальцевого зв'язуючого домену з 12-нуклеотидним сайтом-мішенню, 5-пальцевого зв'язуючого домену з 15нуклеотидним сайтом-мішенню або 6-пальцевого зв'язуючого домену з 18-нуклеотидним сайтом-мішенню. Буде зрозуміло, що також можливе зв'язування більш великих зв'язуючих доменів (наприклад, 7-, 8-, 9-пальцевих і більше) з більш довгими сайтами-мішенями. Сайт-мішень не обов'язково повинен являти собою множину триплетів, що складаються з три нуклеотидів. Наприклад, в тих випадках, коли відбуваються взаємодії, що стосуються обох ниток (див., наприклад, патент США 6453242 і WO 02/077227), один або більше окремі цинкові пальці багатопальцевого зв'язуючого домену можуть зв'язуватися з квадруплетними підсайтами, що перекриваються. Внаслідок білок з трьома пальцями може зв'язувати 10нуклеотидну послідовність, при цьому десятий нуклеотид є частиною квадруплету, що зв'язується кінцевим пальцем, білок, що має чотири пальці, може зв'язувати 13-нуклеотидну послідовність, при цьому тринадцятий нуклеотид є частиною квадруплету, що зв'язується кінцевим пальцем, і т.д. Довжина і природа амінокислотних лінкерних послідовностей між окремими цинковими пальцями в багатопальцевому зв'язуючому домені також впливає на зв'язування з послідовністю-мішенню. Наприклад, присутність так званого "неканонічного лінкеру", "довгого лінкеру" або "структурованого лінкеру" між сусідніми цинковими пальцями в багатопальцевому зв'язуючому домені може забезпечити зв'язування таких пальців з підсайтами, які не є безпосередньо сусідніми один з одним. Не обмежуючі приклади таких лінкерів описані, наприклад, в патенті США №6479626 і WO 01/53480. Відповідно, один або більше підсайтів в сайті-мішені для зв'язуючого домену типу цинкових пальців можуть бути відділені один від одного 1, 2, 3, 4, 5 або більше нуклеотидами. Як один приклад чотирипальцевий зв'язуючий домен може зв'язуватися з 13-нуклеотидним сайтом-мішенню, що містить в послідовності два сусідніх 3-нуклеотидних підсайти, проміжний нуклеотид і два сусідні триплетні підсайти. Відстань між послідовностями (наприклад, сайтами-мішенями) стосується певної кількості нуклеотидів або пари основ, в проміжку між двома послідовностями, який вимірюють від кінців послідовностей, найближчих один до одного. У деяких варіантах, в яких розщеплення залежить від зв'язування двох злитих молекул домену типу цинкового пальця/напівдомену розщеплення, для того, що розділити сайти-мішені, два сайту-мішені можуть розташовуватися на протилежних нитках ДНК. В інших варіантах обидва сайту-мішені знаходяться на одній і тій же нитці ДНК. Зв'язуючі домени типу цинкових пальців Зв'язуючий домен типу цинкового пальця містить один або більше цинкових пальців. Miller et al. (1985) EMBO J. 4: 1609-1614; Rhodes (1993) Scientific American Feb.: 56-65; патент США №6453242. Зазвичай один домен типу цинкового пальця має довжину приблизно 30 амінокислот. Структурні дослідження показали, що кожний домен типу цинкового пальця (мотив) містить два бета-шари (що містяться в беті-складці, яка містить два постійних залишки цистеїну) і альфа-спіраль (що містить два постійних залишки гістидину), які містяться в конкретній конформації за допомогою координування атома цинку двома цистеїнами і двох гістидинами. Цинкові пальці включають як канонічні C2H2-цинкові пальці (тобто цинкові пальці, в яких іон цинку координований двома залишками цистеїну і двома залишками гістидину) і неканонічні цинкові пальці, такі як, наприклад, C 3H-цинкові пальці (цинкові пальці, в яких іон цинку 15 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 координований трьома залишками цистеїну і одним залишком гістидину) і C 4-цинкові пальці (цинкові пальці, в яких іон цинку координований чотирма залишками цистеїну). Див., також WO 02/057293. Зв'язуючі домени типу цинкових пальців можуть бути сконструйовані для зв'язування з вибраною послідовністю. Див., наприклад, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70: 313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19: 656660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12: 632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10: 411-416. Сконструйований зв'язуючий домен типу цинкового пальця може мати нову специфічність зв'язування в порівнянні з білком, що зустрічається в природі з цинковими пальцями. Способи конструювання включають без обмеження конструктивну розробку і різні типи селекції. Конструктивна розробка включає, наприклад, використання баз даних, що містять триплетні (або квадруплетні) нуклеотидні послідовності і окремі амінокислотні послідовності цинкових пальців, в яких кожна триплетна або квадруплетна нуклеотидна послідовність асоційована з однією або декількома амінокислотнимипослідовностями цинкових пальців, які зв'язують конкретну триплетну або квадруплетну послідовність. Див., наприклад, патенти США тих же авторів 6453242 і 6534261. Додаткові способи конструктивної розробки описані, наприклад, в патентах США 6746838, 6785613, 6866997 і 7030215. Зразкові способи відбору, включаючи фаговий дисплей і двогібридні системи, описані в патентах США 5789538, 5925523, 6007988, 6013453, 6410248, 6140466, 6200759 і 6242568, а також в WO 98/37186, WO 98/53057, WO 00/27878, WO 01/88197 і GB 2338237. Посилення специфічності зв'язування для зв'язуючих доменів типу цинкового пальця описане, наприклад, в патенті США тих же авторів №6794136. Оскільки окремий цинковий палець зв'язується з тринуклеотидною послідовністю (тобто триплетом) (або чотиринуклеотидною послідовністю, яка може перекриватися одним нуклеотидом з чотиринуклеотидним сайтом зв'язування сусіднього цинкового пальця), то довжина послідовності, для зв'язування з якою конструюють зв'язуючий домен типу цинкового пальця (наприклад, послідовність-мішень), буде визначати кількість цинкових пальців в сконструйованому зв'язуючому домені типу цинкового пальця. Наприклад, у випадку ZFP, в яких пальцеві мотиви не зв'язуються з підсайтами, що перекриваються, шестинуклеотидна послідовність-мішень зв'язується двопальцевим зв'язуючим доменом; девятинуклеотидна послідовність-мішень зв'язується трипальцевим зв'язуючим доменом, і т.д. Як вказано в даному описі сайти зв'язування для окремих цинкових пальців (тобто підсайти) в сайті-мішені не повинні бути сусідніми, а можуть бути розділені одним або декількома нуклеотидами, залежно від довжини і природи амінокислотних послідовностей між цинковими пальцями (тобто міжпальцевий лінкер) в багатопальцевому зв'язуючому домені. У багатопальцевому зв'язуючому домені типу цинкового пальця, сусідні цинкові пальці можуть бути розділені амінокислотними лінкерними послідовностями довжиною приблизно 5 амінокислот (так звані "канонічні" міжпальцеві лінкери) або альтернативно одним або декількома неканонічними лінкерами. Див., наприклад, патенти США тих же авторів №6453242 і 6534261. У випадку сконструйованих зв'язуючих доменів типу цинкових пальців, що містять більше три пальців, може бути переважна інсерція більш довгих ("неканонічних") міжпальцевих лінкерів між деякими цинковими пальцями, оскільки вона може збільшити афінність і/або специфічність зв'язування зв'язуючим доменом. Див., наприклад, патент США №6479626 і WO 01/53480. Відповідно, багатопальцеві зв'язуючі домени типу цинкових пальців також можуть бути охарактеризовані відносно наявності і положення неканонічних міжпальцевих лінкерів. Наприклад, шестипальцевий зв'язуючий домен типу цинкового пальця, що містить три пальці (зв'язані двома канонічними міжпальцевими лінкерами), довгий лінкер і три додаткових пальці (зв'язані двома канонічними міжпальцевими лінкерами), названий конфігурацією 2 × 3. Подібним чином, зв'язуючий домен, що містить два пальці (з канонічним лінкером між ними), довгий лінкер і два додаткових пальцях (зв'язаних канонічним лінкером), названий білком 2 × 2. Білок, що містить три двухпальцеві одиниці (в кожній з яких два пальці зв'язані канонічним лінкером), і в якому кожна двопальцева одиниця зв'язана з сусідньою двопальцевою одиницею довгим лінкером, названий білком 3 × 2. Наявність довгого або неканонічного міжпальцевого лінкеру між двома сусідніми цинковими пальцями в багатопальцевому зв'язуючому домені часто дозволяє двом пальцям зв'язуватися з підсайтами, які не є безпосередньо сусідніми один з одним в послідовності-мішені. Відповідно, можуть бути пропуски в один або більше нуклеотидів між підсайтами в сайті-мішені; тобто сайтмішень може містити один або більше нуклеотидів, які не контактують з цинковим пальцем. Наприклад, зв'язуючий домен типу цинкового пальця 2 × 2 може зв'язуватися з двома шестинуклеотидними послідовностями, розділеними одним нуклеотидом, тобто він зв'язується з 16 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 13-нуклеотидним сайтом-мішенню. Див. також Moore et al. (2001a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1432-1436; Moore et al. (2001b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1437-1441 і WO 01/53480. Як вказано раніше, підсайт-мішень являє собою три- або чотиринуклеотидну послідовність, яка зв'язується одним цинковим пальцем. Для деяких цілей двопальцеву одиницю називають зв'язуючим модулем. Зв'язуючий модуль може бути одержаний, наприклад, відбором двох сусідніх пальців в контексті багатопальцевого білка (зазвичай три пальці), які зв'язують конкретну шестинуклеотидну послідовність-мішень. Альтернативно, модулі можуть бути сконструйовані за допомогою збирання з окремих цинкових пальців. Див. також WO 98/53057 і WO 01/53480. Домени розщеплення Частина описаних в даній публікації злитих білків, представлена доменом розщеплення, може бути одержана з будь-якої ендонуклеази або екзонуклеази. Приклади ендонуклеаз, з яких можна одержувати домен розщеплення, включають без обмеження рестрикційні ендонуклеази і хомінг-ендонуклеази. Див., наприклад, каталог 2002-2003, New England Biolabs, Beverly, MA; і Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3379-3388. Відомі додаткові ферменти, які розщеплюють ДНК (наприклад, S1-нуклеаза; нуклеаза золотистої квасолі; панкреатична ДНКаза I; нуклеаза мікрококу; ендонуклеаза HO дріжджів; див. також Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Один або більше таких ферментів (або їх функціональних фрагментів) можна використовувати як джерело доменів розщеплення і напівдоменів розщеплення. Подібним чином, напівдомен розщеплення (наприклад, злиті білки, що містять зв'язуючий домен типу цинкового пальця і напівдомен розщеплення) може бути одержаний з будь-якої нуклеази або її частини, які вказані вище, що вимагає димеризації для активності в розщепленні. Загалом, для розщеплення потрібно два злитих білки, якщо злиті білки містять напівдомени розщеплення. Альтернативно можна використовувати один білок, що містить два напівдомени розщеплення. Два напівдомени розщеплення можуть бути одержані з однієї і тієї ж ендонуклеази (або її функціональних фрагментів), або напівдомени розщеплення можуть бути одержані з різних ендонуклеаз (або їх функціональних фрагментів). Крім того, сайти-мішені для двох злитих білків переважно розташовані відносно один одного таким чином, що зв'язування двох злитих білків з відповідними сайтами-мішенями вміщує напівдомени розщеплення в такій просторовій орієнтації за відношенням один до одного, яка дозволяє напівдоменам розщеплення утворювати функціональну домен розщеплення, наприклад, за допомогою димеризації. Таким чином, в деяких варіантах найближчі кінці сайтів-мішеней розділені 5-8 нуклеотидами або 15-18 нуклеотидами. Однак будь-яке ціле число нуклеотидів або пара основ може знаходитися між двома сайтами-мішенями (наприклад, від 2 до 50 нуклеотидів або більше). Загалом, точка розщеплення лежить між сайтами-мішенями. Ендонуклеази рестрикції (ферменти рестрикції) є у багатьох видів і здатні до специфічного для послідовності зв'язування ДНК (в сайті впізнавання) і розщеплення ДНК в сайті зв'язування або поблизу нього. Деякі рестрикційні ферменти (наприклад, типу IIS) розщеплюють ДНК в сайтах, віддалених від сайту впізнавання, і мають окремі домени зв'язування і розщеплення. Наприклад, фермент типу IIS Fok I каталізує двониткове розщеплення ДНК в межах 9 нуклеотидів від сайту впізнавання на одній нитці і 13 нуклеотидів від сайту впізнавання на іншій нитці. Див., наприклад, патенти США 5356802, 5436150 і 5487994; а також Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269: 3197831982. Таким чином, в одному варіанті злиті білки містять домен розщеплення (або напівдомен розщеплення) щонайменше з одного ферменту рестрикції типу IIS і один або більше зв'язуючих доменів типу цинкового пальця, які можуть бути сконструйованими або природними. Прикладом ферменту рестрикції типу IIS, домен розщеплення якого є таким, що відділяється від зв'язуючого домену, є Fok I. Вказаний конкретний фермент є активним у вигляді димеру. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-10575. Відповідно, з метою даного опису частина ферменту Fok I, що використовується в описаних злитих білках є напівдоменом розщеплення. Таким чином, для цілеспрямованого двониткового розщеплення і/або цілеспрямованої заміни клітинних послідовностей з використанням злиття цинковий палець-Fok I можна використовувати два злитих білки, кожний з яких містить напівдомен розщеплення Fok I, для реконструювання каталітично активного домену розщеплення. Альтернативно також можна використовувати одну поліпептидну молекулу, що містить зв'язуючий домен типу цинкового пальця і два напівдомени розщеплення Fok I. Параметри цілеспрямованого розщеплення і цілеспрямованої зміни послідовностей з використанням злиття цинковий палець-Fok I наведені в даному описі. 17 UA 106193 C2 5 Домен розщеплення або напівдомен розщеплення може бути будь-якою частиною білка, який зберігає активність в розщепленні або який зберігає здатність до мультимеризації (наприклад, димеризації) з утворенням функціонального домену розщеплення. Приклади ферментів рестрикції типу IIS перераховані в таблиці 1. Додаткові ферменти рестрикції також містять окремі домени зв'язування і розщеплення, і такі ферменти включені в обсяг даного опису. Див., наприклад, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 418-420. Таблиця 1 Aar I Ace III Aci I Alo I Bae I Bbr7 I Bbv I Bbv II BbvC I Bcc I Bce83 I BceA I Bcef I Bcg I BciV I Bfi I Bin I Bmg I Bpu10 I BsaX I Bsb I BscA I BscG I BseR I BseY I Bsi I Bsm I BsmA I BsmF I Bsp24 I BspG I BspM I BspNC I Bsr I 10 15 20 Деякі ферменти рестрикції типу IIS BsrB I BsrD I BstF5 I Btr I Bts I Cdi I CjeP I Drd II Eci I Eco31 I Eco57 I Eco57M I Esp3 I Fau I Fin I Fok I Gdi II Gsu I Hga I Нin4 II Hph I Ksp632 I Mbo II Mly I Mme I Mnl I Pfl1108 I Ple I Ppi I Psr I RleA I Sap I SfaN I Sim I SspD5 I Sth132 I Sts I TspDT I TspGW I Тth111 II UbaP I Bsa I BsmB I Злиття домену типу цинкового пальця-домен розщеплення Способи проектування і конструювання злитих білків (і кодуючих їх полінуклеотидів) відомі фахівцям в даній галузі. Наприклад, способи проектування і конструювання злитого білка, що містить білки цинкових пальців (і кодуючих їх полінуклеотидів) описані в патентах США тих же авторів 6453242 і 6534261. У деяких варіантах конструюють полінуклеотиди, що кодують такі злиті білки. Такі полінуклеотиди можуть бути вбудовані у вектор, і вектор може бути введений в клітину (див. нижче додатковий опис, що стосується векторів і способів введення полінуклеотидів в клітини). У деяких варіантах способів, описаних в даній публікації, злитий білок містить зв'язуючий домен типу цинкового пальця і напівдомен розщеплення з ферменту рестрикції Fok I, і два таких злитих білка експресуються в клітині. Експресія двох злитих білків в клітині може відбуватися внаслідок доставки двох білків в клітину; доставки одного білка і однієї нуклеїнової кислоти, що кодує один з білків, в клітину; доставки двох нуклеїнових кислот, кожна з яких кодує один з 18 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 білків, в клітину; або внаслідок доставки однієї нуклеїнової кислоти, що кодує обидва білки, в клітину. У додаткових варіантах злитий білок містить один поліпептидну ланцюг, що містить два напівдомени розщеплення і зв'язуючий домен типу цинкового пальця. У такому випадку в клітині експресується один злитий білок, і не маючи наміру бути пов'язаними з будь-якою теорією, вважають, що розщеплення ДНК є результатом утворення внутрішньомолекулярного димеру з напівдоменів розщеплення. У деяких варіантах компоненти злитих білків (наприклад, злиття ZFP-Fok I) розташовані таким чином, що домен типу цинкового пальця знаходиться ближче усього до аміно-кінця злитого білка, а напівдомен розщеплення знаходиться ближче усього до карбоксильного кінця. Таке положення відображає відносну орієнтацію домену розщеплення у доменах розщеплення, що зустрічаються в природі, які димеризуються, таких як домени розщеплення з ферменту Fok I, в якому ДНК-зв'язуючий домен знаходиться ближче усього до аміно-кінця, а напівдомен розщеплення знаходиться ближче усього до карбоксильного кінця. У вказаних варіантах димеризація напівдоменів розщеплення з утворенням функціональної нуклеази відбувається внаслідок зв'язування злитих білків з сайтами на протилежних нитках ДНК, при цьому 5'-кінці сайтів зв'язування знаходяться проксимально за відношенням один до одного. У додаткових варіантах компоненти злитих білків (наприклад, злиття ZFP-Fok I) розташовані таким чином, що напівдомен розщеплення знаходиться ближче усього до аміно-кінця злитого білка, а домен типу цинкового пальця знаходиться ближче усього до карбоксильному кінця. У вказаних варіантах димеризація напівдоменів розщеплення з утворенням функціональної нуклеази відбувається внаслідок зв'язування злитих білків з сайтами на протилежних нитках ДНК, при цьому 3'-кінці сайтів зв'язування знаходяться проксимально за відношенням один до одного. У наступних додаткових варіантах перший злитий білок містить напівдомен розщеплення поблизу аміно-кінця злитого білка і домен типу цинкового пальця поблизу карбоксильного кінця, а другий злитий білок має такий розподіл, що домен типу цинкового пальця знаходиться ближче усього до аміно-кінця злитого білка, а напівдомен розщеплення знаходиться ближче усього до карбоксильному кінця. У вказаних варіантах обидва злитих білка зв'язуються з однією і тією ж ниткою ДНК, при цьому сайт зв'язування першого злитого білка містить домен типу цинкового пальця поблизу карбоксильного кінця, розташованого з 5'-сторони від сайту зв'язування другого злитого білка, що містить домен типу цинкового пальця поблизу аміно-кінця. У деяких варіантах описаних злитих білків амінокислотна послідовність між доменом типу цинкового пальця і доменом розщеплення (або напівдоменом розщеплення) позначена як "ZCлінкер". ZC-лінкер потрібно відрізняти від міжпальцевих лінкерів, що обговорюються вище. Див.,наприклад, публікації патентів США 20050064474A1 і 20030232410, і міжнародну публікацію патенту WO05/084190, де детально описане одержання ZC-лінкерів, які оптимізують розщеплення. Способи цілеспрямованого розщеплення Описані способи і композиції можна застосовувати для розщеплення ДНК в представляючій інтерес області клітинного хроматину (наприклад, в необхідній або ділянці геному, що заздалегідь визначається, наприклад, в гені, або мутантном, або дикого типу). Для такого цілеспрямованого розщеплення ДНК зв'язуючий домен типу цинкового пальця конструюють так, щоб він зв'язував сайт-мішень в сайті розщеплення, що заздалегідь визначається, або поблизу нього, і злитий білок, що містить сконструйований зв'язуючий домен типу цинкового пальця і домен розщеплення, експресується в клітині. Після зв'язування частини злитого білка, представленої цинковим пальцем, з сайтом-мішенню ДНК розщеплюється поблизу сайту-мішені доменом розщеплення. Точне місце розщеплення може залежати від довжини ZC-лінкеру. Альтернативно два злитих білки, кожний з яких містить зв'язуючий домен типу цинкового пальця і напівдомен розщеплення, експресуються в клітині і зв'язуються з сайтами-мішенями, які розташовані за відношенням один до одного таким чином, що відбувається реконструювання функціонального домену розщеплення, і ДНК розщеплюється поблизу сайтів-мішеней. В одному варіанті розщеплення відбувається між сайтами-мішенями двох зв'язуючих доменів типу цинкового пальця. Один або обидва зв'язуючих домени типу цинкового пальця можуть бути штучно сконструйованими. Для цілеспрямованого розщеплення з використанням злитого поліпептиду зв'язуючий домен типу цинкового пальця-домен розщеплення сайт зв'язування може охоплювати сайт розщеплення або сусідній кінець сайту зв'язування може знаходитися на відстані 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25, 50 або більшої кількості нуклеотидів (або будь-яке ціле число між 1 і 50 нуклеотидами) від сайту розщеплення. Точне положення сайту зв'язування по відношенню до сайту розщеплення буде залежати від конкретного домену розщеплення і довжини ZC-лінкеру. У 19 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 випадку застосування способів, в яких використовують два злитих поліпептиду, кожний з яких містить зв'язуючий домен типу цинкового пальця і напівдомен розщеплення, сайти зв'язування зазвичай виступають за обидва кінці сайту розщеплення. Таким чином, сусідній кінець першого сайту зв'язування може бути віддаленим на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25 або більше нуклеотидів (або будь-яке ціле число між 1 і 50 нуклеотидами) з одного боку сайту розщеплення, і сусідній кінець другого сайту зв'язування може бути віддаленим на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 25 або більше нуклеотидів (або будь-яке ціле число між 1 і 50 нуклеотидами) з іншого боку сайту розщеплення. Способи картування сайтів розщеплення in vitro і in vivo відомі фахівцям в даній галузі. Таким чином, в способах, описаних в даній публікації, можна застосовувати сконструйований зв'язуючий домен типу цинкового пальця, злитий з доменом розщеплення. У таких випадках зв'язуючий домен конструюють так, щоб він зв'язувався з послідовністюмішенню в сайті або поблизу сайту, в якому потрібне розщеплення, злитий білок або полінуклеотид, що кодує такий білок, вводять в рослинну клітину. Після введення або експресії в клітині злитий білок зв'язується з послідовністю-мішенню і розщеплює в послідовності-мішені або поблизу неї. Точне місце розщеплення залежить від природи домену розщеплення і/або присутності і/або природи лінкерних послідовностей між доменами зв'язування і розщеплення. У тих випадках, коли використовують два злитих білки, кожний з яких містить напівдомен розщеплення, відстань між сусідніми кінцями сайтів зв'язування може становити 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 25 або більше нуклеотидів (або будь-яке ціле число між 1 і 50 нуклеотидами). Оптимальні рівні розщеплення також можуть залежати як від відстані між сайтами зв'язування двох злитих білків (див., наприклад, Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: 3361-3369; Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21: 289-297), так і від довжини ZC-лінкер в кожному злитому білку. Див. також публікацію патенту США 20050064474A1 і міжнародні патентні публікації WO05/084190, WO05/014791 і WO03/080809. У деяких варіантах домен розщеплення містить два напівдомени розщеплення, при цьому обидва являють собою частину одного поліпептиду, що містить зв'язуючий домен, перший напівдомен розщеплення і другий напівдомен розщеплення. Напівдомени розщеплення можуть мати одну і ту ж амінокислотну послідовність або різні амінокислотні послідовності, за умови, що вони функціонують, розщеплюючи ДНК. Напівдомени розщеплення також можуть бути в окремих молекулах. Наприклад, два злитих поліпептиди можуть бути введені в клітину, при цьому кожний поліпептид містить зв'язуючий домен і напівдомен розщеплення. Напівдомени розщеплення можуть мати одну і ту ж амінокислотну послідовність або різні амінокислотні послідовності, за умови, що вони функціонують, розщеплюючи ДНК. Крім того, зв'язуючі домени зв'язуються з послідовностямимішенями, які зазвичай розташовані таким чином, що після зв'язування злитих поліпептидів два напівдомени розщеплення присутні в просторовій орієнтації по відношенню один до одного, яка забезпечує реконструювання домену розщеплення (наприклад, за допомогою димеризації напівдоменів), при цьому напівдомени розташовуються відносно один одного з утворенням функціонального домену розщеплення, що призводить до розщеплення клітинного хроматину в представляючій інтерес області. Зазвичай розщеплення реконструйованим доменом розщеплення відбувається в сайті, розташованому між двома послідовностями-мішенями. Один або обидва білки можуть бути штучно сконструйовані для зв'язування з сайтом-мішенню. Два злитих білки можуть зв'язуватися в представляючій інтерес області в однаковій або протилежній полярності, і сайти їх зв'язування (тобто сайти-мішені) можуть бути розділені будьякою кількістю нуклеотидів, наприклад, від 0 до 200 нуклеотидів або будь-яким цілим числом нуклеотидів у вказаному діапазоні. У деяких варіантах сайти зв'язування для двох злитих білків, кожний з яких містить зв'язуючий домен типу цинкового пальця і напівдомен розщеплення, можуть бути розташовані один від одного на відстані 5-18 нуклеотидів, наприклад, 5-8 нуклеотидів або 15-18 нуклеотидів або 6 нуклеотидів або 16 нуклеотидів, при цьому відстань вимірюють від кінця кожного сайту зв'язування, найближчого до іншого сайту зв'язування, і розщеплення відбувається між сайтами зв'язування. Сайт, в якому відбувається розщеплення ДНК, зазвичай лежить між сайтами зв'язування двох злитих білків. Двонитковий розрив ДНК часто виникає внаслідок двох однониткових розривів або "ніків", зсунутих на 1, 2, 3, 4, 5, 6 або більше нуклеотидів (наприклад, розщеплення двониткової ДНК нативної Fok I виникає внаслідок однониткових розривів зі зміщенням на 4 нуклеотиди). Таким чином, розщеплення не обов'язково відбувається в сайтах, розташованих точно один навпроти одного на кожній з ниток ДНК. Крім того, структура злитих білків і відстань між сайтами-мішенями може впливати на те, чи відбувається розщеплення поруч з однією парою основ або розщеплення відбувається в декількох сайтах. Однак для багатьох 20 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосувань, включаючи цілеспрямовану рекомбінацію і цілеспрямований мутагенез (див. нижче) зазвичай досить розщеплення в межах певного діапазону нуклеотидів і не потрібно розщеплення між конкретними парами основ. Як вказано вище, злитий білок (білки) може бути введений у вигляді поліпептидів і/або полінуклеотидів. Наприклад, два полінуклеотиди, кожний з яких містить послідовності, що кодують один з вказаних вище поліпептидів, можуть бути введені в клітину, і коли поліпептиди експресуються і кожний зв'язується зі своєю послідовністю-мішенню, відбувається розщеплення в послідовності-мішені або поблизу неї. Альтернативно в клітину вводять один полінуклеотид, що містить послідовності, які кодують обидва злитих поліпептиди. Полінуклеотиди можуть являти собою ДНК, РНК або будь-які модифіковані форми або аналоги ДНК і/або РНК. Щоб підвищити специфічність розщеплення в способах, описаних в даній публікації, також можна використовувати додаткові композиції. Наприклад, окремі напівдомени розщеплення можуть виявляти обмежену активність в двонитковому розщепленні. У способах, в яких в клітину вводять два злитих білки, кожний з яких містить трипальцевий домен типу цинкових пальців і напівдомен розщеплення, будь-який білок специфічно впізнає приблизно 9нуклеотидний сайт-мішень. Незважаючи на те, що складова послідовність-мішень з 18 нуклеотидів ймовірно є унікальною в геномі ссавців, будь-який даний 9-нуклеотидний сайтмішень зустрічається в середньому приблизно 23000 разів в геномі людини. Відповідно може відбуватися неспецифічне розщеплення внаслідок сайт-специфічного зв'язування одного напівдомену. Відповідно способи, описані в даній публікації, передбачають застосування домінантно-негативного мутанта напівдомену розщеплення, такого як Fok I (або кодуючої його нуклеїнової кислоти), який експресується в клітині разом з двома злитими білками. Домінантнонегативний мутант здатний до димеризації, але не здатний до розщеплення, а також блокує активність в розщепленні напівдомену, з яким він димеризуется. У випадку забезпечення молярного надлишку домінантно-негативного мутанта по відношенню до злитих білків тільки ті області, в яких зв'язуються обидва злитих білка, будуть мати досить високу локальну концентрацію функціональних напівдоменів розщеплення для того, щоб відбувалася димеризація і розщеплення. У тих місцях, де зв'язується тільки один з двох злитих білків, його напівдомен розщеплення утворює димер з домінантно-негативним мутантним напівдоменом, і небажане неспецифічне розщеплення не відбувається. Ідентифіковані три каталітичних амінокислотних залишку в напівдомені розщеплення Fok I: Asp 450, Asp 467 і Lys 469. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-10575. Таким чином, одну або більше мутацій в одному з вказаних залишків можна використовувати для створення домінантної негативної мутації. Крім того, відомі і/або можуть бути визначені багато каталітичних амінокислотних залишків інших ендонуклеаз типу IIS, наприклад, за допомогою вирівнювання з послідовностями Fok I і/або шляхом створення і тестування мутантів з каталітичної активності. Мутації доменів димеризації в напівдомені розщеплення У випадку способів цілеспрямованого розщеплення, в які залучене застосування злиття між ZFP і напівдоменом розщеплення (таких як, наприклад, злиття ZFP/FokI), потрібне використання двох таких злитих молекул, кожна з яких звичайно направлена до окремої послідовності-мішені. Послідовності-мішені для двох злитих білків можуть бути вибрані так, щоб цілеспрямоване розщеплення було направлене до унікального сайту в геномі, як обговорювалося вище. Потенційне джерело зниженої специфічності розщеплення може виникати внаслідок гомодимеризації одного з двох злиття ZFP/напівдомен розщеплення. Це може відбуватися, наприклад, внаслідок наявності в геномі інвертованих повторів послідовностей-мішеней для одного з двох злиття ZFP/напівдомен розщеплення, розташованих таким чином, який забезпечує зв'язування двох піків одного і того ж злитого білка в такій орієнтації і просторовому розташуванні, які сприяють утворенню функціонального димеру. Один зі способів зниження імовірності такого типу неправильного розщеплення в інших послідовностях, відмінних від передбачуваного сайту-мішені, полягає в створенні варіантів напівдомену розщеплення, які мінімізують або запобігають гомодимеризацію. Переважно змінюють одну або більше амінокислот в області напівдомену, залученій в димеризацію. Повідомляється, що в кристалічній структурі димеру білка FokI структура напівдоменів розщеплення схожа з розташуванням напівдоменів розщеплення у час розщеплення ДНК під дією FokI. Wah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10564-10569. Така структура показує, що амінокислотні залишки в положеннях 483 і 487 грають ключову роль в димеризації напівдоменів розщеплення FokI. Структура також свідчить про те, що амінокислотні залишки в положеннях 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 і 538 є досить близько розташованими до поверхні контакту при димеризації, щоб впливати на 21 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 димеризацію. Відповідно, зміни амінокислотної послідовності в одному або декількох вказаних вище положеннях ймовірно будуть змінювати димеризаційні властивості напівдомену розщеплення. Такі зміни можуть бути внесені, наприклад, за допомогою конструювання бібліотеки, що містить (або що кодує) різні амінокислотні залишки у вказаних положеннях, і відбору варіантів з необхідними властивостями, або шляхом раціонального проектування окремих мутантів. Крім запобігання гомодимеризації також існує імовірність того, що деякі з таких мутацій можуть підвищувати ефективність розщеплення вище за той рівень, який одержують у випадку двох напівдоменів розщеплення дикого типу. Відповідно, зміну напівдомену розщеплення FokI в будь-якому амінокислотному залишку, який впливає на димеризацію, можна використовувати для запобігання утворенню однієї з пар злиття ZFP/FokI в результаті гомодимеризації, які можуть призводити до розщеплення небажаних послідовностей. Таким чином, для цілеспрямованого розщеплення з використанням пари злиття ZFP/FokI один або обидва злитих білка можуть містити зміни однієї або більше амінокислот, які інгібують самодимеризацію, але забезпечують можливість протікання гетеродимеризації двох злитих білків так, щоб розщеплення відбувалося в необхідному сайтімішені. У деяких варіантах зміни присутні в обох злитих білках, і зміни впливають адитивним чином; тобто, гомодимеризація будь-якого злиття, що призводить до неправильного розщеплення, мінімізується або усувається, в той час як гетеродимеризація двох злитих білків полегшується в порівнянні з гетеродимеризацією, що відбувається у випадку напівдоменів розщеплення дикого типу. Способи цілеспрямованої зміни геномних послідовностей і цілеспрямованої рекомбінації Також в даному описі розкриті способи заміни геномної послідовності (наприклад, представляюча інтерес область в клітинному хроматині) гомологічною неідентичною послідовністю (тобто цілеспрямованої рекомбінації). Спроби замінити конкретні послідовності, що робляться раніше, полягали в здійсненні контакту клітини з полінуклеотидом, що містить послідовності, що мають гомологію з хромосомною областю (тобто, з донорною ДНК), з подальшою селекцією клітин, в яких молекула донорної ДНК зазнала гомологічної рекомбінації з геномом. Ступінь успіху застосування таких способів низький через низьку ефективність гомологічної рекомбінації і високу частоту неспецифічної інсерції донорної ДНК в інші області геному, відмінні від сайту-мішені. Даний опис стосується способів цілеспрямованої зміни послідовностей, що характеризується більш високою ефективністю цілеспрямованої рекомбінації і більш низькою частотою подій неспецифічних інсерцій. Способи полягають в одержанні і застосуванні сконструйованих зв'язуючих доменів типу цинкового пальця, злитого з доменами розщеплення (або напівдоменами розщеплення) для здійснення одного або декількох цілеспрямованих двониткових розривів в клітинній ДНК. Оскільки двониткові розриви в клітинній ДНК в декілька тисяч разів стимулюють механізми репарації в клітині поблизу сайту розщеплення, таке цілеспрямоване розщеплення забезпечує можливість зміни або заміни (за допомогою залежної від гомології репарації) послідовностей фактично в будь-якій ділянці геному. Крім злитих молекул, описаних в даній публікації, цілеспрямована заміна вибраної геномної послідовності також вимагає введення замінюючої (або донорної) послідовності. Донорна послідовність може бути введена в клітину до, одночасно або після експресії злитого білка (білків). Донорний полінуклеотид має достатню гомологію з геномною послідовністю для того, щоб підтримати гомологічну рекомбінацію (або залежну від гомології репарацію) між ним і геномною послідовністю, з якою він гомологічний. Гомологія послідовностей, що охоплює приблизно 25, 50 100, 200, 500, 750, 1000, 1500, 2000 або більше нуклеотидів, між донорною і геномною послідовністю (або будь-яке ціле число від 10 до 2000 або більше нуклеотидів) буде підтримувати гомологічну рекомбінацію між ними. Донорні послідовності можуть мати довжину в діапазоні від 10 до 5000 нуклеотидів (або будь-яке ціле число нуклеотидів у вказаному діапазоні) або більше. Легко можна зрозуміти, що звичайно донорна послідовність не є ідентичною геномній послідовності, яку вона замінює. Наприклад, послідовність донорного полінуклеотиду може містити одну або більше змін окремих основ, інсерцій, делецій, інверсій або перебудов в порівнянні з геномною послідовністю, за умови, що має місце достатня гомологія з хромосомними послідовностями. Альтернативно, донорна послідовність може містити негомологічну послідовність, фланковану двома областями гомології. Крім того, донорні послідовності можуть містити векторну молекулу, що має послідовності, які не гомологічні представляючій інтерес області в клітинному хроматині. Зазвичай гомологічна область (області) донорної послідовності буде мати щонайменше 50 % ідентичність послідовності з геномною послідовністю, з якою потрібна рекомбінація. У деяких варіантах має місце 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % або 99,9 % ідентичність послідовностей. Може мати місце ідентичність 22 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 послідовностей, що оцінюється будь-яким цілим числом від 1 % до 100 %, залежно від довжини донорного полінуклеотиду. Донорна молекула може містити декілька дискретних ділянок гомології з клітинним хроматином. Наприклад, для цілеспрямованої інсерції послідовностей, в нормі не присутніх в представляючій інтерес області, вказані послідовності можуть бути присутніми в молекулі донорної нуклеїнової кислоти і фланковані областями гомології з послідовністю в представляючій інтерес області. Щоб спростити аналізи (наприклад, гібридизацію, ПЛР, розщеплення ферментами рестрикції) для визначення успішної інсерції донорної послідовності деякі відмінності в послідовності можуть бути присутнім в донорній послідовності в порівнянні з геномною послідовністю. Переважно у випадку локалізації в кодуючій області такі відмінності нуклеотидної послідовності не будуть змінювати амінокислотну послідовність або призведуть до мовчазних змін амінокислот (тобто змін, які не впливають на структуру або функцію білка). Донорний полінуклеотид необов'язково може містити зміни в послідовностях, що відповідають сайтам зв'язування домену типу цинкового пальця в представляючій інтерес області, щоб запобігти розщепленню донорних послідовностей, які були введені в клітинний хроматин за допомогою гомологічної рекомбінації. Донорний полінуклеотид може являти собою ДНК або РНК, однониткову або двониткову, і може бути у введений в клітину в лінійній або кільцевій формі. У випадку введення в лінійній формі кінці донорної послідовності можуть бути захищені (наприклад, від екзонуклеолітичного руйнування) способами, відомими фахівцям в даній галузі. Наприклад, додають один або більше дидезоксинуклеотидних залишків до 3'-кінця лінійної молекули і/або з одним або обома кінцями лігують самокомплементарні олігонуклеотиди. Див., наприклад, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4959-4963; Nehls et al., (1996) Science 272: 886-889. Додаткові способи захисту екзогенних полінуклеотидів від руйнування включають без обмеження додавання кінцевої аміногрупи (аміногруп) і застосування модифікованих міжнуклеотидних зв'язків, таких як, наприклад, фосфоротіоати, фосфороамідати і залишки О-метилрибози або дезоксирибози. Полінуклеотид може бути введений в клітину у вигляді частини векторної молекули, що має додаткові послідовності, такі як, наприклад, початки реплікації, промотори і гени, що кодують резистентність до антибіотиків. Крім того, донорні полінуклеотиди можуть бути введені у вигляді "голої" нуклеїнової кислоти, у вигляді нуклеїнової кислоти в комплексі з таким агентом, як ліпосома або полоксамер, або можуть бути доставлені бактеріями або вірусами (наприклад, Agrobacterium, Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, вірус тютюнової мозаїки, вірус картоплі X, вірус мозаїки кольорової капусти і вірус мозаїки жилок маніоку. Див., наприклад, Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1): 1-4. Не маючи наміру бути пов'язаними будь-якою теорією, автори вважають, що присутність двониткового розриву в клітинній послідовності в поєднанні з присутністю молекули екзогенної ДНК, що має гомологію з областю, сусідньою або оточуючою розрив, активує клітинні механізми, які репарують розрив внаслідок перенесення інформації про послідовність від донорної молекули в клітинну (наприклад, геномну або хромосомну) послідовність; тобто внаслідок процесів залежної від гомології репарації, також відомої як "генна конверсія". У способах, що пропонуються заявниками, переважно об'єднують здатності сконструйованих ZFP до ефективного таргетингу з доменом розщеплення (або напівдоменом розщеплення), щоб специфічно ввести цілеспрямований двонитковий розрив в область геному, в якій потрібна інсерція екзогенних послідовностей. Для зміни хромосомної послідовності не обов'язкове копіювання повної послідовності донора в хромосомі, за умови достатнього копіювання донорної послідовності для здійснення зміни необхідної послідовності. Ефективність інсерції донорних послідовностей за допомогою гомологічної рекомбінації зворотно пропорційна відстані в клітинній ДНК між двонитковим розривом і ділянкою, в якій потрібна рекомбінація. Іншими словами більш висока ефективність гомологічної рекомбінації спостерігається в тому випадку, коли двонитковий розрив був ближче до ділянки, в якій потрібна рекомбінація. У тих випадках, коли точний сайт рекомбінації не визначений заздалегідь (наприклад, необхідна подія рекомбінації може відбуватися в межах певного інтервалу геномної послідовності), довжину і послідовність донорної нуклеїнової кислоти разом з сайтом (сайтами) розщеплення вибирають так, щоб одержати необхідну подію рекомбінації. У тих випадках, коли необхідна подія призначена для зміни послідовності в одній парі основ геномної послідовності, клітинний хроматин розщеплюють в межах 10000 нуклеотидів з будь-якої сторони від даної пари основ. У деяких варіантах розщеплення відбувається в межах 1000, 500, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 23 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 50, 40, 30, 20, 10, 5 або 2 нуклеотидів або будь-якого цілого числа нуклеотидів від 2 до 1000, з будь-якої сторони від пари основ, які необхідно змінити в послідовності. Як детально описано вище, сайти зв'язування двох злитих білків, кожний з яких містить зв'язуючий домен типу цинкового пальця і напівдомен розщеплення, можуть бути розташовані на відстані 5-8 або 15-18 нуклеотидів один від одного, при цьому відстань вимірюють від кінця кожного сайту зв'язування, найближчого до іншого сайту зв'язування, і розщеплення відбувається між сайтами зв'язування. Чи відбувається розщеплення в одному сайті або в декількох сайтах між сайтами зв'язування не грає ніякої ролі, оскільки розщеплення геномної послідовності замінюються донорними послідовностями. Отже, для ефективної зміни послідовності в одній парі основ за допомогою цілеспрямованої рекомбінації середня точка області між сайтами зв'язування знаходиться в межах 10000 нуклеотидів від даної пари основ, переважно в межах 1000 нуклеотидів або 500 нуклеотидів, або 200 нуклеотидів, або 100 нуклеотидів, або 50 нуклеотидів, або 20 нуклеотидів, або 10 нуклеотидів, або 5 нуклеотидів, або 2 нуклеотидів, або одного нуклеотиду або в парі основ, що представляє інтерес. У деяких варіантах гомологічна хромосома може служити як донорний полінуклеотид. Таким чином, наприклад, виправлення мутації в гетерозиготі може бути досягнуте за допомогою конструювання злитих білків, які зв'язуються і розщеплюють мутантну послідовність в одній хромосомі, але не розщеплюють послідовність дикого типу в гомологічній хромосомі. Двонитковий розрив в хромосомі, що несе мутацію, стимулює оснований на гомології процес "генної конверсії", при якому послідовність дикого типу з гомологічної хромосоми копіюється в розщеплену хромосому, тим самим відновлюючи дві копії послідовності дикого типу. Також пропонуються способи і композиції, які можуть підвищувати рівні цілеспрямованої рекомбінації, включаючи без обмеження застосування додаткового злиття ZFP-функціональний домен для активації експресії генів, залучених до гомологічну рекомбінації, таких як, наприклад, представники епістатичної групи RAD52 (наприклад, Rad50, Rad51, Rad51B, Rad51C, Rad51D, Rad52, Rad54, Rad54B, Mrell, XRCC2, XRCC3), генів, продукти яких взаємодіють з вказаними вище генними продуктами (наприклад, BRCA1, BRCA2), і/або генів в комплексі NBS1. Див., наприклад, Boyko et al. (2006) Plant Physiology 141: 488-497 і LaFarge et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31(4): 1148-1155. Подібним чином можна використовувати злиття ZFP-функціональний домен в поєднанні зі способами і композиціями, описаними в даній публікації, щоб репресувати експресію генів, залучених до зв'язування негомологічніх кінців (наприклад, Ku70/80, XRCC4, полі(АДФ-рибоза)полімераза, ДНК-лігаза 4). Див., наприклад, Riha et al. (2002) EMBO 21: 28192826; Freisner et al. (2003) Plant J. 34: 427-440; Chen et al. (1994) European Journal of Biochemistry 224:1 35-142. Способи активації і репресії експресії генів з використанням злиття між зв'язуючим доменом типу цинкового пальця і функціональним доменом описані, наприклад, в патентах США тих же авторів 6534261, 6824978 і 6933113. Додаткові способи репресії включають застосування антисмислових олігонуклеотидів і/або малих інтерферуючих РНК (міРНК або РНКі), направлених до послідовності гена, який необхідно репресувати. Як альтернатива або додатково до активації експресії генних продуктів, залучених до гомологічної рекомбінації, злиття таких білків (або їх функціональних фрагментів) зі зв'язуючим доменом типу цинкового пальця, направленим до представляючої інтерес області, можна використовувати для залучення таких білків (білків рекомбінації) в представляючу інтерес область, тим самим підвищуючи їх локальну концентрацію і додатково стимулюючи процеси гомологічної рекомбінації. Альтернативно поліпептид, залучений до гомологічної рекомбінації, який описано вище (або його функціональний фрагмент) може бути частиною потрійного злитого білка, що містить зв'язуючий домен типу цинкового пальця, домен розщеплення (або напівдомен розщеплення) і білок рекомбінації (або його функціональний фрагмент). Додаткові білки, залучені до генної конверсії і пов'язані з рекомбінацією ремоделювання хроматину, які можна використовувати у вказаних вище способах і композиціях, включають гістонацетилтрансферази (наприклад, Esa1p, Tip60), гістон-метилтрансферази (наприклад, Dot1p), кінази гістонів і фосфатази гістонів. Див., також, Bhat et al. (1999) Plant J. 33: 455-469. Додаткове збільшення ефективності цілеспрямованої рекомбінації в клітинах, що містять злиту молекулу цинковий палець/нуклеаза і молекулу донорної ДНК, досягають блокуванням клітин в фазі G2 клітинного циклу, коли максимально активні залежні від гомології процеси репарації. Така затримка може бути здійснена декількома способами. Наприклад, клітини можуть бути оброблені, наприклад, лікарськими засобами, сполуками і/або малими молекулами, які впливають на проходження клітинного циклу, для того, щоб затримати клітини в фазі G2. Приклади молекул такого типу включають без обмеження сполуки, які впливають на полімеризацію мікротрубочок (наприклад, вінбластин, нокодазол, таксол), сполуки, які взаємодіють з ДНК (наприклад, цис-діаміндихлорплатину (II), цисплатин, доксорубіцин) і/або 24 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сполуки, які впливають на синтез ДНК (наприклад, тимідин, гідроксисечовина, L-мімозин, етопозид, 5-фторурацил). Додаткове збільшення ефективності рекомбінації досягають, застосовуючи інгібітори гістондеацетилази (HDAC) (наприклад, бутират натрію, трихостатин А), які змінюють структуру хроматину, роблячи геномну ДНК більш доступною для механізму клітинну рекомбінацію. Додаткові способи затримки клітинного циклу включають надекспресію білків, які інгібують активність кіназ клітинного циклу CDK, наприклад, за допомогою введення кДНК, що кодує білок, в клітину або за допомогою введення в клітину сконструйованого ZFP, який активує експресію гена, що кодує білок. Затримку проходження клітинного циклу також здійснюють за допомогою інгібування активності циклінів і CDK, наприклад, з використанням способів інтерференції РНК (наприклад, патент США №6506559) або введенням в клітину сконструйованого ZFP, який репресує експресію одного або декількох генів, залучених до проходження клітинного циклу, таких як гени цикліну і/або CDK. Див., наприклад, патент США тих же авторів №6534261, в якому розкриті способи синтезу білків, що конструюються з цинковими пальцями для регуляції експресії генів. Альтернативно в деяких випадках цілеспрямоване розщеплення здійснюють у відсутність донорного полінуклеотиду (переважно в фазі S або G 2), і рекомбінація відбувається між гомологічніми хромосомами. Експресуючі вектори Нуклеїнова кислота, що кодує один або більше ZFP або злитих білків ZFP, може бути клонована у векторі для трансформації прокаріотичних або еукаріотичних клітин з метою реплікації і/або експресії. Вектори можуть являти собою прокаріотичні вектори, наприклад, плазміди або човникові вектори, вектори комах або еукаріотичні вектори. Нуклеїнова кислота, що кодує ZFP, також може бути клонована в експресуючому векторі для введення в рослинну клітину. Щоб експресувати ZFP або злиті білки ZFP послідовності, що кодують ZFP або злиття ZFP, зазвичай субклонують в експресуючому векторі, який містить промотор для управління транскрипцією. Відповідні бактеріальні і еукаріотичні промотори добре відомі в даній галузі і nd описані, наприклад, в Sambrook et ah, Molecular Cloning, А Laboratory Manual (2 ed. 1989; 3rd ed., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: А Laboratory Manual (1990); і Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., вище. Бактеріальні системи експресії ZFP доступні, наприклад, в Е. coli, Bacillus sp., і Salmonella (Palva et al., Gene 22: 229-235 (1983)). Набори для таких систем експресії є комерційно доступними. Еукаріотичні системи експресії для клітин ссавців, дріжджів і клітин комах добре відомі фахівцям в даній галузі і також комерційно доступні. Промотор, що використовується для управління експресією нуклеїнової кислоти, що кодує ZFP, залежить від конкретного застосування. Наприклад, сильний конститутивний промотор, придатний для клітини-хазяїна, зазвичай використовують для експресії і очищення ZFP. Навпаки, в тому випадку, коли ZFP вводять in vivo для регуляції генів рослин (див. розділ "Доставка нуклеїнової кислоти в рослинні клітини" нижче), використовують або конститутивний, або індукований промотор, залежно від конкретного застосування ZFP. Не обмежуючі приклади рослинних промоторів включають промоторні послідовності, одержані з гена убіквітину-3 (ubi-3) А. thaliana (Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 12486-12493); гена манопінсинтази (Δmas) А. tumifaciens (Petolino et al., патент США No. 6730824); і/або вірусу мозаїки жилок маніоку (CsVMV) (Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31: 1129-1139). Також дивись розділ "Приклади". Крім промотору експресуючий вектор зазвичай містить транскрипційну одиницю або касету експресії, яка містить всі додаткові елементи, необхідні для експресії нуклеїнової кислоти в клітинах-хазяїнах, або прокаріотичних, або еукаріотичних. Таким чином, типова касета експресії містить промотор, оперативно зв'язаний, наприклад, з послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує ZFP, і сигнали, необхідні, наприклад, для ефективного поліаденілування транскрипту, термінації транскрипції, сайтів зв'язування рибосом або термінації трансляції. Додаткові елементи касети можуть включати, наприклад, енхансери і гетерологічні сигнали сплайсингу. Конкретний експресуючий вектор, що використовується для транспорту генетичної інформації в клітину, вибирають відповідно до передбачуваного застосування ZFP, наприклад, експресія в рослинах, тваринах, бактеріях, грибах, найпростіших і т.д. (див. експресуючі вектори, описані нижче). Стандартні експресуючі вектори бактерій і тварин відомі в даній галузі і детально описані, наприклад, в публікації патенту США 20050064474A1 і міжнародних патентних публікаціях WO05/084190, WO05/014791 і WO03/080809. Можна використовувати стандартні способи трансфекції для одержання ліній клітин бактерій, ссавців, дріжджів або комах, які експресують великі кількості білка, який потім можна 25 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 очистити, використовуючи стандартні методики (див., наприклад, Colley et al., J. Biol. Chem. 264: 17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). Трансформацію еукаріотичних і прокаріотичних клітин здійснюють згідно зі стандартними способами (див., наприклад, Morrison, J. Bact. 132: 349-351 (1977); Clark-Curtiss and Curtiss, Methods in Enzymology 101: 347-362 (Wu et al., eds., 1983). Можна використовувати будь-який з добре відомих способів введення чужорідних нуклеотидних послідовностей в такі клітина-хазяїни. Способи включають трансфекцію із застосуванням фосфату кальцію, полібрену, злиття протопластів, електропорації, способів обробки ультразвуком (наприклад, сонопорацію), ліпосом, мікроін'єкцій, голої ДНК, плазмідних векторів, вірусних векторів, як епісомних, так і інтегрованих, і будь-які інші добре відомі способи введення клонованої геномної ДНК, кДНК, сінтетична ДНК або іншого чужорідного генетичного матеріалу в клітину-хазяїна (див., наприклад, Sambrook et al., вище). Необхідно тільки, щоб конкретний спосіб генетичної інженерії, що використовується, дозволяв успішно вводити щонайменше один ген в клітину-хазяїна, здатний експресувати вибраний білок. Доставка нуклеїнових кислот в рослинні клітини Як вказано вище, конструкції ДНК можуть бути введені (наприклад, в геном) в необхідного рослинного хазяїна множиною звичайних способів. Огляд таких способів див., наприклад, в Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, N.Y.) Section VIII, pp. 421-463; і Grierson and Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9. Наприклад, конструкція ДНК може бути введена безпосередньо в геномну ДНК рослинної клітини з використанням таких способів, як електропорація і мікроін'єкція в протопласти рослинних клітин, або конструкції ДНК можуть бути введені безпосередньо в рослинну тканину з використанням балістичних способів, таких як бомбардування частинками ДНК (див., наприклад, Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73). Альтернативно конструкції ДНК можна об'єднувати з відповідними фланкуючими областями Т-ДНК і ввести в звичайний вектор хазяїна Agrobacterium tumefaciens. Способи опосередкованої Agrobacterium tumefaciens трансформації, включаючи знешкодження і застосування бінарних векторів, добре описані в науковій літературі. Див., наприклад Horsch et al. (1984) Science 233: 496-498, і Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803. Крім того, перенесення генів можна здійснювати з використанням бактерій, які не належать до Agrobacterium, або вірусів, таких як Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, вірус картоплі X, вірус мозаїки кольорової капусти і вірус мозаїки жилок маніоку і/або вірус тютюнової мозаїки. Див., наприклад, Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1): 1-4. Функції вірулентності хазяїна Agrobacterium tumefaciens будуть направляти інсерцію конструкції і сусіднього маркера в ДНК рослинної клітини в тому випадку, коли клітину інфікують бактеріями з використанням бінарного вектора Т-ДНК (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12: 87118721) або при спільному культивуванні (Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231). Зазвичай систему Agrobacterium transformation застосовують для конструювання двосім'ядольних рослин (Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet. 16: 357-384; Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118: 627641). Систему Agrobacterium transformation також можна використовувати для трансформації, а також для перенесення ДНК в односім'ядольні рослини і рослинні клітини. Див. патент США No. 5591616, Hernalsteen et al. (1984) EMBO J., 3: 3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311: 763-764; Grimsley et al. (1987) Nature 325: 1677-179; Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 31-40 і Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95: 426-434. Альтернативні способи перенесення генів і трансформації включають без обмеження трансформацію протопластів з використанням опосередкованого кальцієм, поліетиленгліколем (ПЕГ) або електропорацією захоплення "голої" ДНК (див. Paszkowski et al. (1984) EMBO J., 3: 2717-2722, Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199: 169-177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828; і Shimamoto (1989) Nature 338: 274-276) і електропорації рослинних тканин (D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505). Додаткові способи трансформації рослинних клітин включають мікроін'єкцію, опосередковану карбідом кремнію захоплення ДНК (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9: 415-418), і бомбардування мікрочастинками (див. Klein et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309; і Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2: 603-618). Розкриті способи і композиції можна застосовувати для вбудовування екзогенних послідовностей в положення, що заздалегідь визначається в геномі рослинної клітини. Вказане є корисним, оскільки експресія введеного в рослинний геном трансгена в істотній мірі залежить від місця його інтеграції. Відповідно, гени, що кодують, наприклад, поживні речовини, 26 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 антибіотики або терапевтичні молекули, можуть бути вбудовані за допомогою цілеспрямованої рекомбінації в області геному рослини, сприятливі для їх експресії. Трансформовані рослинні клітини, які одержують будь-яким з описаних вище способів трансформації, можна культивувати, щоб регенерувати цілу рослину, яка має трансформований генотип і, отже, необхідний фенотип. Такі способи регенерації основані на обробці деякими фітогормонами, що вводяться в середовище росту культури тканини, і зазвичай основані на біоцидному і/або гербіцидному маркері, який введений разом з необхідними нуклеотидними послідовностями. Регенерація рослин з культивованих протопластів описана в Evans, et al., "Protoplasts Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; і Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. Регенерацію також можна одержати з калусу рослини, експлантатів, органів, пилка, зародків і їх частин. Такі способи регенерації загалом описані в Klee et al (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486. Нуклеїнові кислоти, введені в рослинну клітину, можуть бути використані для надання необхідних ознак по суті будь-якій рослині. Можуть бути сконструйовані різноманітні рослини і системи рослинних клітин для одержання необхідних фізіологічних і агрономічних властивостей, описаних в даній публікації, з використанням конструкцій нуклеїнових кислот згідно з даним винаходом і різноманітних способів трансформації, вказаних вище. У переважних варіантах рослини-мішені і рослинні клітини-мішені для конструювання включають без обмеження односім'ядольні і двосім'ядольні рослини, такі як сільськогосподарські рослини, включаючи злакові культури (наприклад, пшеницю, кукурудзу, рис, просо, ячмінь), плодові культури (наприклад, томат, яблуню, грушу, суниці, апельсин), кормові культури (наприклад, люцерну), коренеплоди (наприклад, морква, картопля, цукровий буряк, батат), листові овочеві культури (наприклад, латук, шпінат); квітучі рослини (наприклад, петунію, троянду, хризантему), хвойні і соснові дерева (наприклад, сосну, ялицю, ялину); рослини, що використовуються в фітореабілітації (наприклад, рослини, що акумулюють важкі метали); олійні культури (наприклад, соняшник, рапс) і рослини, що використовуються з метою проведення наукових експериментів (наприклад, Arabidopsis). Таким чином, розкриті способи і композиції застосовні для широкого кола рослин, включаючи без обмеження види родів Asparagus, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucurbita, Daucus, Glycine, Gossypium, Hordeum, Lactuca, Lycopersicon, Malus, Manihot, Nicotiana, Oryza, Persea, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Solanum, Sorghum, Triticum, Vitis, Vigna і Zea. Фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що після того, як касета експресії стабільно включається в трансгенні рослини, і після підтвердження того, що вона функціональна, її можна ввести в інші рослини шляхом статевого схрещування. Можна використовувати будь-яку з цілого ряду стандартних методик схрещування, залежно від виду, який піддають схрещуванню. Трансформовану рослинну клітину, калус, тканину або рослину можна ідентифікувати і виділити шляхом селекції і скринінгу матеріалу сконструйованих рослин відносно ознак, що кодуються маркерними генами, присутніми в трансформуючій ДНК. Наприклад, може бути здійснена селекція за допомогою вирощування сконструйованого рослинного матеріалу на середовищах, що містять інгібувальну кількість антибіотика або гербіциду, якому трансформуюча генна конструкція додає стійкість. Крім того, трансформовані рослини і рослинні клітини також можуть бути ідентифіковані в результаті скринінгу відносно активності будь-яких видимих маркерних генів (наприклад, генів β-глюкуронідази, люциферази, В або C1), які можуть бути присутніми в рекомбінантних конструкціях нуклеїнових кислот. Такі методики селекції і скринінгу добре відомі фахівцям в даній галузі. Фізичні і біохімічні способи також можна використовувати для ідентифікації трансформантів рослин або рослинних клітин що містять вбудовані генні конструкції. Такі способи включають без обмеження: 1) Саузерн-аналіз або ПЛР-ампліфікації для виявлення і визначення структури рекомбінантної вставки ДНК; 2) Нозерн-блот, захист від РНКази S1, подовження праймеру або ПЛР-ампліфікація із зворотною транскриптазою для виявлення і дослідження РНК-транскриптів генних конструкцій; 3) ферментні аналізи для виявлення активності ферментів або рибозимів в тому випадку, коли такі генні продукти кодуються генною конструкцією; 4) гель-електрофорез білків, методика Вестерн-блотинга, імунопреципітація або твердофазний імуноферментний аналіз в тому випадку, коли продукти генної конструкції являють собою білки. Також можна використовувати додаткові способи, такі як гібридизація in situ, ферментне фарбування і імунофарбування, щоб виявити наявність або експресію рекомбінантної конструкції в конкретних органах і тканинах рослини. Способи проведення всіх вказаних аналізів добре відомі фахівцям в даній галузі. 27 UA 106193 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ефекти маніпуляцій з генами з використанням способів, описаних в даній публікації, можна спостерігати, наприклад, з допомогою Нозерн-блотів РНК (наприклад, мРНК), виділеної з представляючих інтерес тканин. Зазвичай, якщо кількість мРНК зросла, то можна передбачити, що відповідний ендогенний ген експресується в більш високій мірі, ніж раніше. Можна застосовувати інші способи вимірювання активності гена і/або CYP74B. Можна використовувати різні типи ферментних аналізів, залежно від субстрату, що використовується, і способу виявлення збільшення або зниження кількості продукту реакції або побічного продукту. Крім того, рівні експресованого білка CYP74B можна виміряти імунохімічно, тобто в ELISA, RIA, EIA і інших основаних на антитілах аналізах, добре відомих фахівцям в даній галузі, таких як аналізи, основані на електрофоретичному виявленні (з використанням або фарбування, або Вестернблотинга). Трансген може вибірково експресуватися в деяких тканинах рослини або на деяких стадіях розвитку, або трансген може експресуватися по суті у всіх тканинах рослини і по суті протягом усього життєвого циклу. Однак також застосований будь-який спосіб комбінаторної експресії. Даний опис також охоплює насіння трансгенних рослин, описаних вище, в тому випадку, коли насіння має трансген або генну конструкцію. Даний опис, крім того, охоплює потомство, клони, клітинні лінії або клітини трансгенних рослин, описаних вище, при цьому вказане потомство, клон, клітинна лінія або клітина має трансген або генну конструкцію. ZFP і експресуючі вектори, що кодують ZFP, можна вводити безпосередньо в рослину для цілеспрямованого розщеплення і/або рекомбінації. Введення ефективних кількостей здійснюють будь-яким шляхом, що зазвичай використовується для досягнення тісного контакту ZFP з рослинною клітиною, що піддається обробці. ZFP вводять будь-яким відповідним способом, переважно з фармацевтично прийнятними носіями. Відповідні способи введення таких модуляторів доступні і добре відомі фахівцям в даній галузі, і хоча можна використовувати декілька шляхів для введення конкретної композиції, один специфічний шлях часто може забезпечувати більш швидку і більш ефективну реакцію, ніж інший шлях. Також можна використовувати носії, і вони визначаються частково конкретною композицією, що вводиться, а також конкретним способом, що застосовується для введення композиції. Відповідно, існує широка множина відповідних препаратів фармацевтичних композицій, які th можуть бути застосовні (див., наприклад, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17 ed. 1985)). Застосування Розкриті способи і композиції для цілеспрямованого розщеплення можна застосовувати для індукції мутацій в геномної послідовності. Цілеспрямоване розщеплення також можна застосовувати для створення нокаутів генів (наприклад, для функціональної геноміки або встановлення мішені) і для полегшення цілеспрямованої інсерції послідовності в геном (тобто knock-in генів). Інсерція може бути способом заміни хромосомних послідовностей за допомогою гомологічної рекомбінації або цілеспрямованої інтеграції, при якій нову послідовність (тобто послідовність, не присутню в представляючій інтерес області), фланковану послідовностями, гомологічніми представляючій інтерес області в хромосомі, вбудовують в заздалегідь визначений сайт-мішень. Такі ж способи також можна застосовувати для заміни послідовності дикого типу мутантної послідовністю або для перетворення одного алелю на інший алель. Цілеспрямоване розщеплення інфекційних або рослинних патогенів, що інтегруються, можна застосовувати для лікування патогенних інфекцій в рослині-хазяїні, наприклад, з допомогою розщеплення геному патогену так, щоб його патогенність була знижена або усунута. Крім того, цілеспрямоване розщеплення генів, що кодують рецептори для вірусів рослин, можна використовувати для блокування експресії таких рецепторів, тим самим запобігаючи вірусній інфекції і/або поширенню вірусів в рослині. Приклади патогенів рослин включають без обмеження віруси рослин, такі як Alfamoviruses, Alphacryptoviruses, Badnaviruses, Betacryptoviruses, Bigeminiviruses, Bromoviruses, Bymoviruses, Capilloviruses, Carlaviruses, Carmoviruses, Caulimoviruses, Closteroviruses, Comoviruses, Cucumoviruses, Cytorhabdoviruses, Dianthoviruses, Enamoviruses, Fabaviruses, Fijiviruses, Furoviruses, Hordeiviruses, Hybrigeminiviruses, Idaeoviruses, Ilarviruses, Ipomoviruses, Luteoviruses, Machlomoviruses, Macluraviruses, Marafiviruses, Monogeminiviruses, Nanaviruses, Necroviruses, Nepoviruses, Nucleorhabdoviruses, Oryzaviruses, Ourmiaviruses, Phytoreoviruses, Potexviruses, Potyviruses, Rymoviruses, сателітні РНК, віруси-сателіти, Sequiviruses, Sobemoviruses, Tenuiviruses, Tobamoviruses, Tobraviruses, Tombusviruses, Tospoviruses, Trichoviruses, Tymoviruses, Umbraviruses, Varicosaviruses і Waikaviruses; грибкові патогени, такі як сажка (наприклад, Ustilaginales), іржа (Uredinales), ріжки (Clavicepts pupurea) і мілдью; плісняви (Oomycetes), такі як Phytophthora infestans (гнилизна картоплі); бактеріальні патогени, 28