Гуманізоване антитіло, специфічне до протофібрилярної форми бета-амілоїдного пептиду

Реферат: Винахід стосується гуманізованого антитіла, специфічного до протофібрилярної форми бетаамілоїдного пептиду, а також застосування вказаного антитіла для лікування хвороби Альцгеймера. UA 107574 C2 (12) UA 107574 C2 UA 107574 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Об'єктом даного винаходу є гуманізовані антитіла, специфічні до протофібрилярної форми β-амілоїдного пептиду. Об'єктом даного винаходу є також застосування цих антитіл в терапії, діагностиці і/або профілактиці, зокрема, в зв'язку з виникненням і розвитком нейродегенеративних порушень і/або захворювань, пов'язаних з відкладенням амілоїдних бляшок, зокрема, з хворобою Альцгеймера. Хвороба Альцгеймера (AD) є прогресуючим нейродегенеративним захворюванням, яке торкається значної частини підстаркуватого населення. Ця хвороба характеризується в клінічному плані втратою пам'яті і ослабленням когнітивних функцій, в невропатологічному плані присутністю в головному мозку нейрофібрилярних внутрішньоклітинних відкладень і позаклітинних відкладень β-амілоїдного пептиду (Α-β), що утворюють амілоїдні бляшки. (Yanker et al. Nature Med. Vol 2 NO:8 (1996)). До цих ознак додається велике число інших аномальних змін, включаючи погіршення імунних і запальних систем, а також погіршення мітохондріальної функції, які можуть привести до підвищення оксидативного стресу, активації механізмів апоптозу і, зрештою, до загибелі клітин. Амілоїдні бляшки складаються в основному з пептидів Α-β з 40 або 42 залишками, які утворюються в протеолітичному процесі білка-попередника β-амілоїдного пептиду (АРР). Позаклітинні відкладення пептидів Α-β представляють ранню і незмінну характеристику всіх форм AD, включаючи сімейні форми (FAD). FAD з'являються відносно рано (між 40 і 60 роками) і зумовлені мутаціями в гені АРР у 5 % випадків FAD (у >20 сімей) з шістьма простими або подвійними місенс-мутаціями; в гені пресеніліну-1 (PS-1) у 50-70 % випадків FAD (у >200 сімей) з більше ніж 80 різними мутаціями, ідентифікованими до теперішнього часу; і в гені пресеніліну2 (PS-2) в меншому числі випадків FAD з 2 місенс-мутаціями, описаних у 8 сімей. Було продемонстровано, що мутації в цих трьох генах викликають зміни в протеолізі АРР, що веде до надсинтезу Α-β і ранньої появи патології і симптомів, які схожі на симптоми спорадичних форм AD. Токсичність амілоїдних бляшок в нейронах коріниться, мабуть, в фібрилах зі значною молекулярною масою, які утворюються в результаті агрегації розчинних пептидів Α-β в фібрилярні форми, спочатку розчинні (що називаються також протофібрилярною формою), які потім перетворюються в нерозчинні форми в амілоїдних бляшках. Дійсно, було показано in vitro, що розчинний пептид Α-β поступово агрегував в фібрилярну форму (c-a-d, яку можна виділити такими агентами, як конго червоний або тіофлавін S, які розпізнають третинні структури в листку бета пептидів/білків) з високою молекулярною масою (>200 кДа), але ще розчинну. Оскільки ця форма розчинна, її часто називають протофібрилярною формою, тоді як фібрили, отримані в результаті ще сильнішої агрегації, ведуть до втрати розчинності. Перехідні протофібрилярні форми звичайно розглядають як попередники амілоїдних волокон, які можуть бути відповідальні за клітинні дисфункції і втрату нейронів при хворобі Альцгеймера і при інших захворюваннях, пов'язаних з агрегацією білків. Було показано, що сенільні амілоїдні бляшки (тобто агреговані, їх називають також зрілими бляшками) корелюють з когнітивним статусом у пацієнтів з хворобою Альцгеймера, на відміну від дифузного відкладення пептиду Α-β, які також широко присутні у пацієнтів, яких не торкнулася ця хвороба (Duyckaerts et al., Neurobiol. Aging 1997; 18: 33-42 і Jellinger et al. 1998; 54:77-95). Таким чином, вплив, зокрема, на ці сенильні амілоїдні бляшки дозволить більш специфічно і ефективно лікувати патологію Альцгеймера. Було випробувано багато підходів для запобігання утворенню пептидів Α-β, як, наприклад, інгібуючих процес протеолізу АРР. Були перевірені такі стратегії імунотерапії, як введення антитіл анти-Αβ (для зменшення відкладення амілоїдів) або імунізація антигенами пептидів Α-β (щоб стимулювати гуморальну відповідь) в цілях зменшити розмір і щільність бляшок. Був, наприклад, описаний (США 7179463) спосіб лікування хвороби Альцгеймера, що включає введення антитіл, спрямованих до протофібрил, що має мутацію Arctic всередині області, яка кодує пептид Α-β. Реально не було описано якого-небудь прикладу антитіл. Крім того, не було приведено якого-небудь порівняння спорідненості антитіл до пептидів залежно від молекулярної маси цих пептидів. У інших патентах (США 6761888 і США 6750324) розкриті антитіла, що розпізнають різні епітопи по довжині амінокислотної послідовності пептиду Α-β42. Була подана міжнародна заявка (WO2007/108756), що стосується антитіл, специфічних до протофібрил, але описані антитіла розпізнають одночасно пептиди Α-β з високою молекулярною масою і олігомери із середньою масою. Крім того, нічого не говориться про спорідненість антитіл до зрілих бляшок в порівнянні з їх спорідненістю до дифузних бляшок. Незважаючи на сучасний розвиток знань про хворобу Альцгеймера, завжди є потреба в композиціях і способах лікування і/або профілактики цієї патології, при максимально обмежених 1 UA 107574 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 побічних ефектах. Антитіла, які описані в даному винаході, гуманізовані і специфічні до протофібрилярної форми пептидів Α-β, мають на меті вирішити цю задачу. Дозволяючи розпізнавати сенільні амілоїдні бляшки, а не дифузні бляшки, антитіла, що є об'єктом даного винаходу, розпізнають патологічні бляшки набагато ефективніше, ніж антитіла, які розпізнають всі форми Α-β і які будуть утримуватися здебільшого на дифузному відкладенні або на розчинних формах мономерного або низькомолекулярного пептиду Α-β. Крім того, завдяки розпізнаванню тільки протофібрилярних форм пептидів Α-β, а не протофібрилярних форм інших білків, не пов'язаних з хворобою Альцгеймера, запобігається непотрібне зв'язування, здатне зменшити концентрацію антитіл, ефективних відносно цього захворювання. Гуманізовані мишачі антитіла по всьому даному опису будуть означатися як антитіла 13СЗ. Послідовності, які можуть кодувати або складати гуманізовані антитіла, що є об'єктом даного винаходу, представлені в таблиці 2. Даний винахід стосуються гуманізованих антитіл, що специфічно зв'язуються з протофібрилярною формою пептиду Α-β, тобто з високомолекулярним пептидом. У більш переважному варіанті антитіла зв'язуються з пептидом Α-β, що має молекулярну масу вищу 200, 300, 400 або 500 кДа. Згідно з одним варіантом здійснення антитіла, що є об'єктом винаходу, зв'язуються з пептидами Α-β, агрегованими в сенільні бляшки, а не з дифузним відкладенням пептидів Α-β. У одному переважному варіанті здійснення антитіла, що є об'єктом винаходу, специфічно зв'язуються з протофібрилярними формами пептиду Α-β, але не з іншими білками амілоїдної структури (як, наприклад, ІАРР - Islet Amyloid Polypeptide, острівцевий амілоїдний поліпептид). Даний винахід стосується також гуманізованих антитіл, що мають знижені ефекторні функції, що дозволяє обмежити такі негативні ефекти, як появу мікрокровотеч і вазогенних набряків. У одному переважному варіанті здійснення антитіла, що є об'єктом винаходу, більше не мають ефекторних функцій. У ще більш переважному варіанті здійснення антитіла являють собою імуноглобулін G4, домен Fc якого був підданий мутаціям, що знижують синтез напівмолекул. У ще більш переважному варіанті здійснення антитіла являють собою імуноглобулін G4, домен Fc якого був підданий мутаціям, що знижують ефекторну активність. Об'єктом даного винаходу є гуманізовані антитіла, що містять щонайменше одну CDR, що кодується нуклеотидною послідовністю, що містить послідовність, ідентичну одній з послідовностей SEQ ID NО:9, 11, 13, 15, 17 і 19, або послідовностями, які відрізняються відповідно на 1, 2, 3, 4 або 5 нуклеотидів від вказаних послідовностей. Об'єктом даного винаходу є також гуманізовані антитіла, що містять щонайменше одну CDR, що має послідовність, ідентичну одній з послідовностей SEQ ID NО:10, 12, 14, 16, 18 і 20. У іншому варіанті здійснення антитіла, що є об'єктом винаходу, містять щонайменше одну CDR, послідовність якої відрізняється на одну-дві амінокислоти від однієї з послідовностей SEQ ID NО:10, 12, 14, 16, 18, 20 і 32, якщо тільки антитіла зберігають свою специфічність зв'язку. У одному переважному варіанті здійснення антитіла містять CDR, що кодуються нуклеотидними послідовностями SEQ ID NО:9, 11, 13, 15, 17 і 19, або послідовностями, які відрізняються відповідно на 1, 2, 3, 4 або 5 нуклеотидів від вказаних послідовностей. У іншому переважному варіанті здійснення антитіла містять CDR з послідовністю SEQ ID NО:10, 12, 14, 16, 18 і 20. Антитіла, що є об'єктом винаходу, можуть також містити CDR, що кодуються нуклеотидними послідовностями SEQ ID NО:9, 11, 13, 31, 17 і 19, або послідовностями, які відрізняються відповідно на 1, 2, 3, 4 або 5 нуклеотидів від вказаних послідовностей. У одному переважному варіанті здійснення антитіла, що є об'єктом винаходу, містять CDR з послідовністю SEQ ID NО:10, 12, 14, 32, 18 і 20. Об'єктом винаходу є гуманізовані антитіла, що містять CDR, які кодуються нуклеотидними послідовностями SEQ ID NO:9, 11, 29, 31, 17 і 19 або послідовностями, які відрізняються відповідно на 1, 2, 3, 4 або 5 нуклеотидів від вказаних послідовностей. Об'єктом винаходу є також гуманізовані антитіла, що містять CDR з послідовністю SEQ ID NО:10, 12, 30, 32, 18 і 20. У одному переважному варіанті здійснення антитіла, що є об'єктом винаходу, мають варіабельну частину їх важкого ланцюга (VH), яка кодується послідовністю, що має щонайменше 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або 99 % ідентичність послідовності SEQ ID NО:5 або послідовності SEQ ID NО:27. У одному переважному варіанті здійснення антитіла, що є об'єктом винаходу, мають варіабельну частину свого важкого ланцюга (VH), що містить послідовність, що має 2 UA 107574 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 щонайменше 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або 99 % ідентичність послідовності SEQ ID NО:6 або послідовності SEQ ID NО:28. У одному переважному варіанті здійснення антитіла, що є об'єктом винаходу, мають варіабельну частину їх легкого ланцюга (VL), яка кодується послідовністю, що має щонайменше 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або 99 % ідентичність послідовності SEQ ID NО:7 або послідовності SEQ ID NО:23. У одному переважному варіанті здійснення антитіла, що є об'єктом винаходу, мають варіабельну частину їх легкого ланцюга (VL), що кодується послідовністю, яка має щонайменше 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або 99 % ідентичність послідовності SEQ ID NО:8 або послідовності SEQ ID NО:24. У ще більш переважному варіанті здійснення антитіла мають важкий ланцюг, що містить варіабельну частину (VH), яка кодується однією з нуклеотидних послідовностей SEQ ID NО:5 і SEQ ID NО:27. У ще більш переважному варіанті здійснення антитіла мають важкий ланцюг, що містить варіабельну частину (VH) з поліпептидною послідовністю SEQ ID NO:6 або SEQ ID NO:28. У іншому варіанті здійснення антитіла мають легкий ланцюг, що містить варіабельну частину (VL), яка кодується однією з нуклеотидних послідовностей SEQ ID NО:7 і SEQ ID NО:23. У іншому варіанті здійснення антитіла мають легкий ланцюг, що містить варіабельну частину (VL) з поліпептидною послідовністю SEQ ID NО:8 або SEQ ID NО:24. У одному переважному варіанті здійснення антитіла містять послідовності, що кодуються нуклеотидними послідовностями SEQ ID NО:5 і 7. У одному переважному варіанті здійснення антитіла містять поліпептидні послідовності SEQ ID NО:6 і 8. У іншому варіанті здійснення антитіла містять послідовності, що кодуються нуклеотидними послідовностями SEQ ID NО:5 і 23. У іншому варіанті здійснення антитіла містять поліпептидні послідовності SEQ ID NО:6 і 24. У іншому варіанті здійснення антитіла містять послідовності, що кодуються нуклеотидними послідовностями SEQ ID NО:27 і 23. У іншому варіанті здійснення антитіла містять поліпептидні послідовності SEQ ID NО:28 і 24. Об'єктом даного винаходу є також антитіла, що містять важкий ланцюг, що кодується послідовністю, яка має щонайменше 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або 99 % ідентичність з однією з нуклеотидних послідовностей SEQ ID NО:1 і SEQ ID N0:25. Об'єктом даного винаходу є також антитіла, що містять важкий ланцюг, який має щонайменше 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або 99 % ідентичність поліпептидної послідовності SEQ ID NО:2 або поліпептидної послідовності SEQ ID NО:26. У одному переважному варіанті здійснення антитіла містять легкий ланцюг, що кодується послідовністю, яка має щонайменше 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або 99 % ідентичність з однією з нуклеотидних послідовностей SEQ ID NО:3 і SEQ ID NO:21. У іншому варіанті здійснення антитіла містять легкий ланцюг, що містить послідовність, яка має щонайменше 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або 99 % ідентичність з однією з поліпептидних послідовностей SEQ ID NО:4 і SEQ ID NО:22. Одним об'єктом винаходу є антитіла, що містять послідовності, які кодуються нуклеотидними послідовностями SEQ ID NО:1 і 3. Іншим об'єктом винаходу є антитіла, послідовність яких містить поліпептидні послідовності SEQ ID NО:2 і 4. Об'єктом винаходу є антитіла, що містять послідовності, які кодуються нуклеотидними послідовностями SEQ ID NО:1 і 21. Іншим об'єктом винаходу є антитіла, послідовність яких містить поліпептидні послідовності SEQ ID NО:2 і 22. Об'єктом винаходу є антитіла, що містять послідовності, які кодуються нуклеотидними послідовностями SEQ ID NО:25 і 21. Іншим об'єктом винаходу є антитіла, послідовність яких містить поліпептидні послідовності SEQ ID NО:26 і 22. Іншим об'єктом винаходу є гуманізовані антитіла до пептиду Αβ, що мають спорідненість до протофібрилярної форми пептиду Αβ щонайменше в 100 раз вищу їх спорідненості до інших форм цього пептиду. Іншим об'єктом винаходу є антитіла, які характеризуються тим, що вони спричиняють зменшення амілоїдних бляшок. 3 UA 107574 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Іншим об'єктом винаходу є застосування гуманізованих антитіл до пептиду Αβ в лікуванні захворювань, пов'язаних з нейродегенеративними порушеннями, зокрема, в лікуванні хвороби Альцгеймера. Іншим об'єктом винаходу є фармацевтична композиція, що містить гуманізовані антитіла до пептиду Αβ і ексципієнти. Іншим об'єктом винаходу є спосіб лікування хвороби Альцгеймера, що включає введення пацієнту гуманізованих антитіл анти-пептид Αβ. Іншим об'єктом винаходу є клітина або клітини, що продукують гуманізовані антитіла до пептиду Αβ, а також спосіб отримання цих антитіл, що включає культивування вказаних клітин. Такі клітини переважно отримують з однієї клітинної лінії. Одним об'єктом винаходу є лікарський засіб, що містить гуманізовані антитіла до пептиду Αβ. Одним об'єктом винаходу є полінуклеотид, що кодує поліпептид, який має щонайменше 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або 99 % ідентичність з однією з послідовностей SEQ ID NО:2, 4, 6, 8, 22, 24, 26 або 28. Іншим об'єктом винаходу є полінуклеотид, що містить послідовність, що має щонайменше 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або 99 % ідентичність з однією з послідовностей SEQ ID NО:1, 3, 5, 7, 21, 23, 25, або 27. Іншим об'єктом винаходу є рекомбінантний вектор, що містить нуклеїнову кислоту, яка має одну з послідовностей SEQ ID NО:1, 3, 5, 7, 21, 23, 25 або 27, а також клітина-хазяїн, що містить вказаний вектор. Визначення Специфічне зв'язування розуміють як різницю щонайменше приблизно в 10, 20, 30, 40, 50 або 100 разів між силою зв'язку з одним рецептором в порівнянні з іншим, тут: між зв'язуванням з протофібрилярною формою пептиду Α-β і зв'язуванням з іншими формами пептиду. Під "епітопом" розуміють ділянку антигену, з яким зв'язуються антитіла. Якщо антиген є полімером, таким як білок або полісахарид, епітоп може бути утворений суміжними або несуміжними залишками. Тут епітоп є конформаційним, тобто, пов'язаним з тривимірною структурою протофібрилярного пептиду Α-β. Під "протофібрилярною формою" розуміють олігомерну форму пептидів Α-β, розчинну in vitro, яку можна виділити як єдине ціле, з молекулярною масою вищою 200 кДа, 300 кДа, 400 кДа або 500 кДа, і яка може фіксувати такі агенти, як тіофлавін S або конго червоний. Під "сенільною бляшкою" розуміють бляшку, що складається з амілоїдного ядра (фіксуючого тіофлавін S або конго червоний), оточеного дистрофічними нейритами і продуктами реакцій гліальних клітин. Сенільні бляшки знаходять, зокрема, у пацієнтів з хворобою Альцгеймера, на відміну від дифузних амілоїдних відкладень (не фіксуючих тіофлавін S або конго червоний), яких набагато більше, але які не пов'язані з хворобою. Антитіла, що називаються також імуноглобуліном, складаються з двох однакових важких ланцюгів ("СН") і двох однакових легких ланцюгів ("CL"), які зв'язані дисульфідним містком. Кожний ланцюг містить константну область і варіабельну область. Кожна варіабельна область містить три сегменти, що називаються "комплементарно-визначуваними областями" ("CDR") або "суперваріабельними областями", які в основному відповідальні за зв'язування з епітопом антигену. Термін "VH" стосується варіабельних областей важкого ланцюга імуноглобуліну антитіла, що містить важкі ланцюги одного з фрагментів Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' або F(ab)'. Термін "VL" стосується варіабельних областей легкого ланцюга імуноглобуліну антитіла, включаючи легкі ланцюги фрагмента Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' або F(ab)'. Під "антитілом" розуміють також будь-який функціональний фрагмент антитіл: Fab (Fragment antigen binding - антиген-зв'язувальний фрагмент), Fv, scFv (single chain Fv - одноланцюжковий Fv), Fc (фрагмент, що кристалізується). Переважно, ці функціональні фрагменти є фрагментами типу Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc, діатілами, поліспецифічними антитілами (зокрема, біспецифічними), синтетичними поліпептидами, що містять послідовності однієї або декількох CDR, які мають звичайно таку ж специфічність фіксації, що і гуманізовані антитіла, з яких вони отримані. Згідно з даним винаходом, фрагменти антитіл по винаходу можуть бути отримані з гуманізованих антитіл такими способами, як розщеплення ферментами, такими як пепсин або папаїн, і/або розрив дисульфідних містків в результаті хімічного відновлення. Нанотіла також підпадають під це визначення. "Областями CDR" будуть позначатися гіперваріабельні області важких і легких ланцюгів імуноглобулінів, як визначено Kabat і інш. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5 Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, і більш пізні видання). 4 UA 107574 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Існує три CDR важкого ланцюга і 3 CDR легкого ланцюга. Термін CDR використовується тут для позначення, залежно від конкретного випадку, однієї або декількох з цих областей, або навіть всіх цих областей, які містять більшість амінокислотних залишків, які відповідають за споріднене зв'язування антитіла з антигеном або епітопом, які він розпізнав. Області варіабельних доменів, що найбільш зберігаються, називаються областями або послідовностями FR, від "framework", або "каркасними". Даний винахід стосується гуманізованих антитіл. Під "гуманізованими антитілами" розуміють антитіла, які містять головним чином послідовності людського імуноглобуліну. Цей термін стосується також імуноглобуліну, що не є людським, який був модифікований введенням людських послідовностей або залишків, що є в людських послідовностях. Взагалі кажучи, гуманізовані антитіла містять один або звичайно два варіабельні домени, в яких всі або частина областей CDR відповідають частинам, отриманим з вихідної, не людської, послідовності, і в яких всі або частина областей FR отримані з послідовності людського імуноглобуліну. Таким чином, гуманізовані антитіла можуть містити щонайменше одну ділянку константної області імуноглобуліну (Fc), зокрема, вибраного базового людського імуноглобуліну. Таким чином, необхідно отримати антитіла, які будуть мінімально імуногенними у людини. Так, можливо, щоб одна або дві амінокислоти однієї або декількох CDR були модифіковані амінокислотою, менш імуногенною для хазяїна-людини, без істотного зниження специфічності зв'язку антитіл до високомолекулярного пептиду Α-β. Однаково, залишки каркасних областей можуть не бути людськими, і дозволяється, щоб вони не були модифіковані, оскільки вони не вносять внесок в імуногенний потенціал антитіл. Існує декілька відомих фахівцеві в даній галузі способів гуманізації, щоб модифікувати вихідні надлюдські антитіла в антитіла, менш імуногенні для людини. Повна ідентичність послідовності з антитіла людини не є суворо необхідною. Дійсно, повна ідентичність послідовності необов'язково є індикатором, що прогнозує знижену імуногенність, і модифікація обмеженого числа залишків може вести до гуманізованих антитіл, що мають дуже ослаблений імуногенний потенціал у людини (Molecular Immunology (2007) 44, 1986-1998). Різними методами є, наприклад, інклюзія CDR (щеплення) (ЕРО 0239400; WO 91/09967 і патенти США 5530101 і 5585089), зміна поверхні (ЕРО 0592106; ЕРО 0519596; Padlan, 1991, Molec. Imm. 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7(6):805-814; і Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973), а також змішення ланцюгів (патент США 5565332). Даний винахід стосується, зокрема, гуманізованих антитіл, у яких варіабельні частини модифіковані згідно з технологією, розкритою в міжнародній патентній заявці WO 2009/032661. У цьому методі використовують, зокрема, моделювання молекулярної динаміки, виходячи з тривимірних моделей антитіл, де вказані моделі розроблені шляхом гомології. Даний винахід стосується також всіх форм антитіл зі зниженими ефекторними функціями, таких як імуноглобуліни, які мають мутації в домені Fc, що знижують його спорідненість до рецепторів імунної системи, або як нанотіла. Під "ефекторними функціями" розуміють будь-яку фіксацію домену Fc антитіла до рецепторів або білків, що викликає імунні відповіді. Ослаблення цих ефекторних функцій дозволяє зменшити такі ускладнення, як виникнення мікрокровотеч (Racke et al. J Neurosci 2005, 25:629). Спорідненість може бути виміряна будь-яким методом, відомим фахівцеві в даній галузі. Переважно вимірювати її методом Biostat Speed, розробленим, виходячи з алгоритмів, описаних Ratkovsky DA і Reedy TJ (Biometries, 1986, 42, 575-82). Щоб можна було експресувати важкі ланцюги і/або легкі ланцюги антитіл, що є об'єктом винаходу, полінуклеотиди, що кодують вказані ланцюги, вводять в експресійні вектори. Ці експресійні вектори можуть бути плазмідами, YAC, космідами, ретровірусами, епісомами, похідними від EBV і будь-яким іншим вектором, який фахівець в даній галузі зможе вважати прийнятним для вказаних ланцюгів. Ці вектори можуть бути використані для трансформації клітин, отриманих переважно з однієї клітинної лінії. Ще більш переважно, така клітинна лінія отримана від ссавця. Переважно, ця лінія являє собою лінію СНО або лінію, похідну від цієї лінії, або лінію НЕК293 або лінію, похідну від цієї лінії. Трансформація клітин може бути здійснена будь-яким способом, відомим фахівцеві в даній галузі, щоб ввести полінуклеотиди в клітину-хазяїна. Одним таким способом може бути трансформація за допомогою декстрану, осадження фосфатом кальцію, трансфекція за 5 UA 107574 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 допомогою полібрену, злиття протопластів, електропорація, інкапсуляція полінуклеотидів в ліпосомах, біолістична ін'єкція і пряма мікроін'єкція ДНК в ядро. Антитіла, що є об'єктом винаходу, можуть міститися в фармацевтичних композиціях для місцевого введення, пероральним, парентеральним, інтраназальним, внутрішньовенним, внутрішньом'язовим, підшкірним, внутрішньоочним і т. д. способами. Переважно, фармацевтичні композиції містять фармацевтично прийнятні носії для препаратів, придатних для ін'єкції. Це можуть бути, зокрема, сольові розчини (мононатрійфосфат, динатрійфосфат, хлорид натрію, калію, кальцію або магнію і т. д., або суміші таких солей), стерильні, ізотонічні, або сухі композиції, зокрема, ліофілізовані, які при додаванні, залежно від конкретного випадку, стерилізованої води або фізіологічного розчину, дозволяють створити придатні для ін'єкцій розчини. Як приклад, фармацевтична композиція містить (1) фосфатний буфер Dulbecco (pH ~7,4), що необов'язково містить від 1 мг/мл до 25 мг/мл людського сироваткового альбуміну, (2) 0,9 % мас/об, хлориду натрію (NaCl)), і (3) 5 % (мас/об.) декстрози. Вона може також містити антиоксидант, такий як триптамін, і стабілізатор, як Tween 20. Патологіями, що розглядаються, можуть бути будь-які захворювання, пов'язані з відкладенням амілоїдних бляшок. Зокрема, цільовою патологією є хвороба Альцгеймера. Дози залежать від бажаного ефекту, тривалості лікування і способу введення; звичайно вони складають від 5 мг до 1000 мг антитіл на добу для дорослого. Звичайно лікар визначає прийнятне дозування залежно від стадії захворювання, віку пацієнта, його маси або будь-яких інших факторів, які потрібно враховувати залежно від пацієнта. Даний винахід ілюструється наступними прикладами, однак, не обмежений ними. Короткий опис фігур Фіг. 1А: Карта плазміди pXL4973, що дозволяє експресію легкого ланцюга LC1 антитіл антиΑβ 13C3-VH1VL1. Фіг. 1В: Карта плазміди pXL4979, що дозволяє експресію важкого ланцюга НС1 антитіл антиΑβ 13 С3 -VH1VL1. Фіг. 2А і 2В: Розділення протофібрил і низькомолекулярних олігомерів гель-хроматографією на Superdex 75 (відповідно при t=0 і t=16 год). Фіг. 3: Визначення молекулярної маси протофібрил. Фіг. 4А, 4В і 4С: Визначення спорідненості гуманізованих антитіл (відповідно антитіл LP09027 (4А), LP09026 (4В) і LP09028 (4С)) до протофібрил (середнє по 3 експериментах±середньоквадратична погрішність). Фіг. 5: Специфічність гуманізованих антитіл LP09027 відносно фібрил Αβ. Фіг. 6А і 6В: Специфічність гуманізованих антитіл (LP09027) до зрілих сенільних бляшок, відповідно для фронтального кортексу (6А) і гіпокампу (6В) миші. Стрілки вказують на сенільні бляшки. Приклади Приклад 1: Отримання гуманізованих антитіл Були гуманізовані мишачі антитіла 13С3. Даний приклад описує послідовність і отримання гуманізованих антитіл до пептиду Αβ, VH1VL1 (LP09027) шляхом продукування в перехідній експресії в лінії ссавця НЕК293, що називається FreeStyle 293-F. кДНК, що кодують гуманізовані варіабельні ланцюги VL1 і VH1, піддавали злиттю з кДНК, що кодують константні області людських Скарра і IgG4, відповідно. Послідовність константної області IgG являє собою послідовність варіанту, що має заміщення S241P і L248E, згідно з номенклатурою Kabat, щоб істотно знизити продукування полумолекул (Angla et al., 1993, Мої. Immunol., 30: 105-108) і ефекторні функції (WO 97/09351). Нуклеїнові послідовності, що кодують СНІ (SEQ ID N0:1) і CL1 (SEQ IN NO:3), клонували незалежно в експресійному векторі, щоб утворити відповідно плазміди pXL4973 (Фіг. 1А) і pXL4979 (Фіг. 1В). Одну серію антитіл отримували шляхом продукування в перехідній експресії в лінії FreeStyle 293-F (Invitrogen) після ко-трансфекції плазмід pXL4973 і pXL4979 згідно з протоколом, описаним Invitrogen (номер в каталозі К9000-01). Цю серію (LP09027) потім очищали методом афінної хроматографії на колонці гелю MabSelect (Amersham) згідно з рекомендаціями постачальника, потім змішували з буфером PBS (Dulbecco, індекс 14190-094) і стерилізували фільтруванням (0,2 мкм). З 1 л культури шляхом денатуруючого електрофорезу в поліакриламідному гелі і просторово-ексклюзійній хроматографії отримували 33 мг антитіл чистотою 97 %. Маса, отримана денатуруючим електрофорезом в поліакриламідному гелі і по РХ/МС, узгоджується з первинною послідовністю амінокислот і присутністю N-глікану в домені 6 UA 107574 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Fc, тобто маса 23969 Да для LC1 і 49650 Да для НС1, враховуючи N-глікан в формі G0F. Маса, отримана електрофорезом в поліакриламідному гелі без денатуруючих умов і по ексклюзійній хроматографії, узгоджується з гетеротетрамерною структурою антитіл масою 150 кДа (Фіг. 4А). Цим же способом отримували серії гуманізованих антитіл LP09026 і LP09028, виходячи з нуклеотидних послідовностей SEQ ID NO:25 і SEQ ID NO:21 для LP09026 (Фіг. 4В) і SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:21 для LP09028 (Фіг. 4С). Приклад 2: Отримання протофібрил з пептиду Αβ (1-42) Протофібрили отримували з синтетичних пептидів Αβ (1-42) згідно з способом, описаним Johansson et al. (FEBS, 2006, 2618-2630). Ліофілізований пептид (Anaspec, індекс 24224) розчиняли в 10 мМ NaOH до концентрації 100 мкМ, потім перемішували протягом 1 хв і інкубували на склі протягом 10 хв. Розчин пептиду розводили потім буфером (100 мМ фосфат натрію, 200 мМ NaCl рН=7,4) до концентрації 50 мкМ, потім перемішували одну хвилину. Препарат інку бували протягом ночі при 37 °C, щоб досягнути утворення протофібрил, потім центрифугували при 17900 g протягом 15 хв при 16 °C для видалення нерозчинних агрегатів. Щоб відділити протофібрили олігомерних форм Αβ з низькою молекулярною масою, супернатант вводили в гель-хроматографічну колонку Superdex 75, урівноважену в буфері (50 мМ ацетату амонію рН=8,5). Фракції, відповідні протофібрилам і низькомолекулярним олігомерам, збирали і зберігали при 4 °C. На фіг. 2 показаний типовий профіль розділення протофібрил. Молекулярну масу протофібрил визначали по гель-хроматографії на Superdex200, використовуючи як індикатор молекулярної маси калібрувальний набір Biorad (індекс 150-1901). Фіг. 3 показує, що молекулярна маса протофібрил вища 200 кДа. Приклад 3: Специфічність і спорідненість гуманізованих антитіл до протофібрил 50 мкл протофібрил і низькомолекулярних олігомерів при концентрації 1 мкг/мл в PBS (Gibco, індекс 70011) вміщували в ямку планшета ELISA (Nunc, індекс 442404) і інкубували при 4 °C протягом ночі. Після видалення надлишку антигенів в кожну ямку вміщували 200 мкл буферу PBS+5 % сухого молока (мас/об'єм), щоб ліквідувати неспецифічну адсорбцію, і інкубували 2 год. при температурі навколишнього середовища. Потім ямку промивала 4 рази 300 мкл буфера PBS Tween 0,02 %. В кожну ямку додавали 50 мкл розчину первинних антитіл (трикратне розведення в 3 рази в PBS Tween, виходячи з концентрації 100 мкг/мл для олігомерів і 25 мкг/мл для протофібрил) і інкубували 1 год. при температурі навколишнього середовища. Ямки промивали 4 рази 300 мкл буфера PBS Tween. Вторинні людські антитіла анти-Fc, комбіновані з пероксидазою (Goat Anti Human IgG (Fc) peroxidase conjugated, Pierce, індекс 31413), розведені до 1/10000 в буфері PBS Tween, додавали в кожну ямку і інкубували 1 год. при температурі навколишнього середовища. Після 4 промивань 300 мкл PBS Tween, в кожну ямку додавали 100 мкл ТМВ (Interchim, індекс UP664782) і інкубували протягом приблизно 10 хв, потім реакцію зупиняли 1М розчином НСl (Interchim, індекс UPS29590) і планшети зчитували при OD, виміряній на довжині хвилі 450 нм. Значення ЕС50 визначали на BioStat Speed. Отримані результати приведені в таблиці 1, а також на фіг. 4 і показують дуже високу специфічність антитіл до протофібрил в порівнянні з низькомолекулярними олігомерами (в 184 рази вище). Таблиця 1 ЕС50 (мкг/мл) LP09026 LP09027 LP09028 45 50 LMW 41,4±40,1 14,7±2,7 21,8±5,3 PF 0,0587±0,004 0,0798±0,007 0,0892±0,007 LMW/PF 705,3 184,2 244,4 Ліофілізований пептид Αβ1-42 (Anaspec, індекс 24224) розчиняють згідно з рекомендаціями постачальника: 40 мкл 1 %-ного NH4OH додавали до 500 мкг Αβ1-42. Після завершення розчинення додавали 460 мкл PBS, щоб отримати концентрацію 1 мг/мл. Готували аліквоти 10 мкл і зберігали при -80 °C. В ямку планшета ELISA вміщували 50 мкл розчину пептиду Αβ1-42 концентрацією 1 мкг/мл в карбонатному буфері (NaHCO3 0,025 Μ (Acros Organics, індекс 217120010), Na2CO3 0,025 Μ (Acros Organics, індекс 207810010), pH 9,7 і інкубували протягом ночі при температурі навколишнього середовища. Як і вище, ямки промивали буфером PBS Tween, інкубували в присутності буфера PBS+5 % сухого молока (мас/об'єм) і промивали буфером PBS Tween. Гуманізовані антитіла в концентрації 0,02 мкг/мл інкубували протягом 1 год. при температурі навколишнього середовища з декількома концентраціями (починаючи з 1 мкг/мл) пептидів Αβ1-28 (Bachem, індекс Н7865), Αβ1-16 (Anaspec, індекс 24225), Αβ25-35 (Anaspec, індекс 24227), низькомолекулярних олігомерів або протофібрил, отриманих, як 7 UA 107574 C2 5 10 15 20 25 30 описано вище. Потім в кожну ямку вміщували суміш антитіла/антигену і мікротитрувальний планшет інкубували 1 год. при температурі навколишнього середовища. Вільні, непов'язані антитіла визначали по тому ж протоколу ELISA, як описано вище. Ці конкурентні експерименти показують, що тільки протофібрили з набагато сильнішою спорідненістю, ніж у низькомолекулярних олігомерів, здатні нейтралізувати гуманізовані антитіла, перешкоджаючи взаємодії з пептидом Αβ1-42, і ніякий пептид не здатний нейтралізувати антитіла. Приклад 4: Специфічність гуманізованих антитіл LP09027 до фібрилів Αβ1-42 Пептид Αβ1-42 (Anaspec, 20276) розчиняли в 200 мкл NaOH 10 мМ до концентрації 5 мг/мл. Пептид ІАРР (Anaspec, 60804) розчиняють в 200 мкл 50 %-ного ДМСО до концентрації 5 мг/мл. 100 мкл кожного препарату розчиняли в 400 мкл PBS 1,25Х. Кінцева концентрація пептидів становила 1 мг/мл в 500 мкл. Зразки інкубували 72 год. при 37 °C. Після інкубації зразки центрифугували при 17900g протягом 30 хвилин при 4 °C. Супернатант видаляли, і осад промивали 3 рази PBS 1Х. Після останнього промивання осад фібрил вводили в 150 мкл PBS. Щоб проконтролювати присутність фібрил амілоїдного типу, проводили тест на флуоресценцію тіофлавіну Τ (Anaspec, 88306). 20 мкл тіофлавіну Τ (кінцева концентрація 20 мкМ), 10 мкл зразка і 70 мкл PBS 1Х (кінцевий об'єм 100 мкл) змішують в ямці чорного планшета (Corning, 3792). Тіофлавін Τ збуджувався на 450 нм і, в присутності структури амілоїдного типу, флуоресціював на 482 нм. В кожну ямку мікротитрувального планшета вміщували 50 мкл фібрил Αβ1-42 концентрацією 1 мкг/мл і ІАРР концентрацією 0,5 мкг/мл. Застосовували протокол ELISA, використовуючи послідовне розбавлення гуманізованих антитіл, починаючи з 10 мкг/мл. Фіг. 5 показує, що гуманізовані антитіла LP09027 специфічно розпізнають фібрили Αβ1-42, але не фібрили ІАРР. Приклад 5: Специфічність гуманізованих антитіл LP09027 до зрілих сенільних бляшок, але не до дифузних бляшок Гуманізовані антитіла (LP09027), зв'язані з дигоксигеніном (Ν-гідроксисукцинімідний ефір дигоксигенін-3-О-метилкарбоніл-ε-амінокапронової кислоти: Roche 11333054001; 11418165001) використовували в імуногістохімії (Robot Ventana) на зрізах головного мозку мишей АРР PS1 (модель Альцгеймера, описана Schmitz С. et al., Am. J. Pathol, 2004, 164, 1495-1502)), а також на зрізах головного мозку людини (церебральний кортекс), взятих у пацієнтів, які страждають на хворобу Альцгеймера. Зразки попередньо фіксували в формаліні і вводили в парафін. Результати, отримані на мишах (фіг. 6А і 6В) чітко показують, що гуманізовані антитіла розпізнають виключно зрілі і щільні сенільні бляшки, але не дифузне відкладення пептиду Αβ. Ці дані корелюють з властивостями антитіл, які є специфічними до протофібрилярної форми Αβ і, отже, не розпізнають розчинні, мономерні або олігомерні, форми цього пептиду. 35 8 UA 107574 C2 Таблиця 2 VH1+CH1 VL1+CL1 VH1 VL1 CDR VH1 CDRVL1 VH1+CH1 VL2+CL2 VH1 VL2 CDR VH1 CDR VL2 VH2+CH2 VL2+CL2 VH2 VL2 CDR VH2 CDR VL2 Нуклеотидні послідовності Антитіла 1 VH1VL1 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:9, 11, 13 SEQ ID NO:15, 17, 19 Антитіла 2 VH1 VL2 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:9, 11, 13 SEQ ID NO:31,17, 19 Антитіла 3 VH2 VL2 SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:9, 11, 29 SEQ ID NO:31,17, 19 9 Білкові послідовності SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:10, 12, 14 SEQ ID NO:16, 18, 20 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:10, 12, 14 SEQ ID NO:32, 18, 20 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:10, 12, 30 SEQ ID NO:32, 18, 20 UA 107574 C2 10 UA 107574 C2 11 UA 107574 C2 12 UA 107574 C2 13 UA 107574 C2 14 UA 107574 C2 15 UA 107574 C2 16 UA 107574 C2 17 UA 107574 C2 18 UA 107574 C2 19 UA 107574 C2 20 UA 107574 C2 21 UA 107574 C2 22 UA 107574 C2 23 UA 107574 C2 24 UA 107574 C2 25 UA 107574 C2 26 UA 107574 C2 27 UA 107574 C2 28