Химерні гібриди мономер-димер імуноглобуліну

1. Химерний білок, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де вказаний перший ланцюг містить біологічно активну молекулу і щонайменше тільки частину константної ділянки імуноглобуліну, де тільки перший ланцюг містить біологічно активну молекулу і де вказаний другий ланцюг містить щонайменше частину виключно константної ділянки імуноглобуліну. 2. Химерний білок за п. 1, де вказаний другий ланцюг, додатково, містить афінну мітку. 3. Химерний білок за п. 2, де афінною міткою є мітка FLAG. 4. Химерний білок за п. 1, де частиною імуноглобуліну є Fc-фрагмент. 5. Химерний білок за п. 4, де частина імуноглобуліну є FcRn-зв’язувальним партнером. 6. Химерний білок за п. 5, де FcRn-зв’язувальний партнер являє собою пептидний міметик Fcфрагмента імуноглобуліну. 2 (19) 1 3 27. Химерний білок за п. 26, де нуклеїнова кислота є ДНК або РНК. 28. Химерний білок за п. 26, де нуклеїнова кислота є антисмисловою молекулою. 29. Химерний білок за п. 26, де нуклеїнова кислота є рибозимом. 30. Химерний білок за п. 1 або 5, де біологічно активною молекулою є фактор росту. 31. Химерний білок за п. 30, де фактором росту є еритропоетин. 32. Химерний білок, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де вказаний перший ланцюг містить біологічно активну молекулу і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, і де вказаний другий ланцюг по суті містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну і афінну мітку, де тільки перший ланцюг містить біологічно активну молекулу. 33. Химерний білок за п. 32, де афінною міткою є мітка FLAG. 34. Химерний білок, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де a) вказаний перший ланцюг містить біологічно активну молекулу, щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну і перший домен, що має щонайменше один специфічний зв’язувальний партнер; b) тільки перший ланцюг містить біологічно активну молекулу; і с) вказаний другий ланцюг по суті містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну і додатково містить другий домен, при цьому вказаний другий домен є специфічним зв’язувальним партнером вказаного першого домену. 35. Химерний білок за п. 34, де вказаний другий ланцюг додатково містить афінну мітку. 36. Химерний білок за п. 34, де афінною міткою є мітка FLAG. 37. Химерний білок за п. 34, де частина імуноглобуліну являє собою Fc-фрагмент. 38. Химерний білок за п. 34 або 37, де імуноглобулін є IgG. 39. Химерний білок за п. 37, де частина імуноглобуліну є FcRn-зв’язувальним партнером. 40. Химерний білок за п. 39, де FcRnзв’язувальним партнером є пептидний міметик Fcфрагмента імуноглобуліну. 41. Химерний білок за п. 34 або 39, де перший домен зв’язується з другим доменом нековалентно. 42. Химерний білок за п. 34 або 39, де перший домен являє собою половину подвійної спіралі лейцинового зіпера і вказаний другий домен є комплементарним зв’язувальним партнером вказаної подвійної спіралі лейцинового зіпера. 43. Химерний білок за п. 34 або 39, де біологічно активною молекулою є білок. 44. Химерний білок за п. 34 або 39, де біологічно активною молекулою є інтерферон. 45. Химерний білок за п. 44, де біологічно активною молекулою є інтерферон α. 46. Химерний білок за п. 44, де біологічно активною молекулою є інтерферон β. 95436 4 47. Химерний білок за п. 44, де інтерферон являє собою інтерферон α і має лінкер з 15-25 амінокислот. 48. Химерний білок за п. 47, де інтерферон α має лінкер з 15-20 амінокислот. 49. Химерний білок за п. 43, де біологічно активною молекулою є лейпролід. 50. Химерний білок за п. 34 або 39, де біологічно активною молекулою є інгібітор злиття вірусів. 51. Химерний білок за п. 50, де інгібітор злиття вірусів є інгібітором злиття ВІЛ. 52. Химерний білок за п. 51, де інгібітором злиття ВІЛ є Т20 (SEQ ID NO:1), Т21 (SEQ ID NO:2) або Т1249 (SEQ ID NO:3). 53. Химерний білок за п. 34 або 39, де біологічно активною молекулою є фактор згортання крові. 54. Химерний білок за п. 53, де фактором згортання крові є фактор VII або VІІa. 55. Химерний білок за п. 53, де фактором згортання крові є фактор VІІІ або VІІІa. 56. Химерний білок за п. 53, де фактором згортання крові є фактор IX. 57. Химерний білок за п. 34 або 39, де біологічно активною молекулою є біополімерна молекула з молекулярною масою менше 50 кДа. 58. Химерний білок за п. 57, де біологічно активною молекулою є антагоніст VLA4. 59. Химерний білок за п. 34 або 39, де біологічно активна молекула містить нуклеїнову кислоту. 60. Химерний білок за п. 59, де нуклеїнова кислота є ДНК або РНК. 61. Химерний білок за п. 59, де нуклеїнова кислота є антисмисловою нуклеїновою кислотою. 62. Химерний білок за п. 59, де нуклеїнова кислота є рибозимом. 63. Химерний білок за п. 34 або 39, де біологічно активною молекулою є фактор росту або гормон. 64. Химерний білок за п. 63, де фактором росту є еритропоетин. 65. Фармацевтична композиція, що містить химерний білок за будь-яким з пп. 1, 5, 34 або 39 і фармацевтично прийнятний ексципієнт. 66. Химерний білок, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де a) вказаний перший ланцюг містить біологічно активну молекулу, щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну і перший домен, що має щонайменше один специфічний зв’язувальний партнер; і b) вказаний другий ланцюг містить щонайменше тільки частину імуноглобуліну і другий домен, який є специфічним зв’язувальним партнером вказаного першого домену, і афінну мітку. 67. Химерний білок за п. 66, де афінною міткою є мітка FLAG. 68. Химерний білок, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де a) вказаний перший ланцюг містить біологічно активну молекулу, щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну і перший домен, що має щонайменше один специфічний зв’язувальний партнер; і b) тільки перший ланцюг містить біологічно активну молекулу; і 5 c) вказаний другий ланцюг по суті містить щонайменше частину імуноглобуліну, другий домен, де другий домен є специфічним зв’язувальним партнером вказаного першого домену, і афінну мітку. 69. Химерний білок за п. 68, де афінною міткою є мітка FLAG. 70. Спосіб одержання біологічно активного химерного білка за п. 1, в якому здійснюють: a) трансфекцію першої клітини першою конструкцією ДНК, що містить молекулу ДНК, яка кодує перший ланцюг; b) трансфекцію другої клітини другою конструкцією ДНК, що містить молекулу ДНК, яка кодує другий ланцюг; c) культивування клітин, трансфікованих на етапах а) і b) в таких умовах, за яких експресується поліпептид, що кодується вказаною першою конструкцією ДНК і вказаною другою конструкцією ДНК. 71. Спосіб за п. 70, де вказана частина константної ділянки імуноглобуліну є FcRn-зв’язувальним партнером. 72. Спосіб за п. 70, в якому додатково здійснюють ізолювання химерного білка методом хроматографії. 73. Спосіб за п. 70 або 71, в якому біологічно активною молекулою є поліпептид. 74. Спосіб за п. 70 або 71, де біологічно активною молекулою є інтерферон. 75. Спосіб за п. 74, де біологічно активною молекулою є інтерферон α. 76. Спосіб за п. 74, де біологічно активною молекулою є інтерферон β. 77. Спосіб за п. 74, де інтерферон являє собою інтерферон α і містить лінкер з 15-25 амінокислот. 78. Спосіб за п. 74, де інтерферон α має лінкер з 15-20 амінокислот. 79. Спосіб за п. 70 або 71, де біологічно активною молекулою є інгібітор злиття вірусів. 80. Спосіб за п. 79, де інгібітор злиття вірусів є інгібітором злиття ВІЛ. 81. Спосіб за п. 80, де інгібітором злиття ВІЛ є Т20 (SEQ ID NO:1), Т21 (SEQ ID NO:2) або Т1249 (SEQ ID NO:3). 82. Спосіб за п. 70 або 71, де біологічно активна молекула містить фактор згортання крові. 83. Спосіб за п. 82, де фактором згортання крові є фактор VІІ або VІІa. 84. Спосіб за п. 83, де фактором згортання крові є фактор VIII або фактор VІІІa. 85. Спосіб за п. 82, де фактором згортання крові є фактор ІХ. 86. Спосіб за п. 70 або 71, де біологічно активною молекулою є біополімерна молекула з молекулярною масою менше 50 кДа. 87. Спосіб за п. 70 або 71, в якому біологічно активна молекула містить нуклеїнову кислоту. 88. Спосіб за п. 87, де нуклеїнова кислота є ДНК або РНК. 89. Спосіб за п. 87, де нуклеїнова кислота є антисмисловою молекулою. 90. Спосіб за п. 87, де нуклеїнова кислота є рибозимом. 91. Спосіб за п. 70 або 71, де біологічно активна молекула містить фактор росту або гормон. 95436 6 92. Спосіб за п. 91, де фактором росту є еритропоетин. 93. Спосіб за п. 70 або 71, де димери виділяють за допомогою хроматографії. 94. Спосіб за п. 70 або 71, де клітина є еукаріотичною клітиною. 95. Спосіб за п. 94, де еукаріотичною клітиною є клітина СНО. 96. Спосіб за п. 70 або 71, де клітина є прокаріотичною клітиною. 97. Спосіб за п. 96, де прокаріотичною клітиною є клітина Е. соlі. 98. Спосіб лікування пацієнта із захворюванням або станом, що включає введення химерного білка за п. 5 пацієнту, який цього потребує. 99. Спосіб за п. 98, де вказаний химерний білок вводять внутрішньовенним, підшкірним, пероральним, букальним, під’язиковим, назальним, парентеральним, ректальним, вагінальним або легеневим шляхом. 100. Спосіб за п. 98, де вказаною біологічно активною молекулою є фактор VIII або фактор VІІІa. 101. Спосіб за п. 98, де вказаним захворюванням або станом є вірусна інфекція. 102. Спосіб за п. 98, де біологічно активною молекулою є інтерферон. 103. Спосіб за п. 102, де біологічно активною молекулою є інтерферон α. 104. Спосіб за п. 102, де біологічно активною молекулою є інтерферон β. 105. Спосіб за п. 102, де інтерферон являє собою інтерферон α і містить лінкер з 15-25 амінокислот. 106. Спосіб за п. 105, де інтерферон α містить лінкер з 15-20 амінокислот. 107. Спосіб за п. 98, де вказаним захворюванням або станом є ВІЛ-інфекція. 108. Спосіб за п. 98, де вказаною біологічно активною молекулою є інгібітор злиття вірусів. 109. Спосіб за п. 108, де інгібітор злиття вірусів є Т20, Т21 або Т1249. 110. Спосіб за п. 98, де вказаним захворюванням або станом є гемостатичний розлад. 111. Спосіб за п. 98, де вказаним захворюванням або станом є гемофілія А. 112. Спосіб за п. 98, де вказаним захворюванням або станом є гемофілія В. 113. Спосіб за п. 98, де вказаною біологічно активною молекулою є фактор VII або фактор VІІa. 114. Спосіб за п. 98, де вказаною біологічно активною молекулою є фактор IX. 115. Спосіб за п. 98, де вказаним захворюванням або станом є анемія. 116. Спосіб за п. 98, де вказаною біологічно активною молекулою є еритропоетин. 117. Химерний білок формули X-La-F:F aбo F:F-La-X, де X означає біологічно активну молекулу, L означає лінкер, F означає щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, і а дорівнює цілому числу або нулю. 118. Химерний білок за п. 117, де F означає FcRnзв’язувальний партнер. 119. Химерний білок за п. 117, де FcRn є пептидним міметиком Fc-фрагмента імуноглобуліну. 7 120. Химерний білок за п. 117 або 119, де кожний F хімічно зв’язаний з іншим F. 121. Спосіб за п. 120, де хімічне зв’язування є нековалентною взаємодією. 122. Спосіб за п. 120, де хімічний зв’язок є ковалентним зв’язком. 123. Спосіб за п. 120, де хімічний зв’язок є дисульфідним зв’язком. 124. Химерний білок за п. 117 або 118, де F зв’язаний з F зв’язком, який не є дисульфідним. 125. Химерний білок за п. 117, де F означає константну ділянку імуноглобуліну IgG. 126. Химерний білок за п. 117, де F означає IgG1. 127. Химерний білок за п. 117, де F означає Fcфрагмент. 128. Химерний білок за п. 117, де X означає білок. 129. Химерний білок за п. 117, де X означає лейпролід. 130. Химерний білок за п. 117, де X являє собою біополімерну молекулу з молекулярною масою менше 50 кДа. 131. Химерний білок за п. 130, де мала молекула є антагоністом VLA4. 132. Химерний білок за п. 117, де X означає інгібітор злиття вірусів. 133. Химерний білок за п. 132, де інгібітор злиття вірусів є інгібітором злиття ВІЛ. 134. Химерний білок за п. 133, де інгібітором злиття ВІЛ є Т20 (SEQ ID NO:1), Т21 (SEQ ID NO:2) або Т1249 (SEQ ID NO:3). 135. Химерний білок за п. 117 або 118, де X означає фактор згортання крові. 136. Химерний білок за п. 135, де фактором згортання крові є фактор VII або VIIa. 137. Химерний білок за п. 135, де фактором згортання крові є фактор VIII або фактор VIIIa. 138. Химерний білок за п. 135, де фактором згортання крові є фактор IX. 139. Химерний білок за п. 117 або 118, де X означає нуклеїнову кислоту. 140. Химерний білок за п. 139, де нуклеїнова кислота є молекулою ДНК або РНК. 141. Химерний білок за п. 117 або 118, де X означає фактор росту. 142. Химерний білок за п. 141, де фактором росту є еритропоетин. 143. Спосіб лікування захворювання або стану пацієнта, що включає введення химерного білка за будь-яким з пп. 1, 5, 34, 39, 117 або 118 вказаному пацієнту. 144. Спосіб за п. 143, де вказаним захворюванням або станом є вірусна інфекція. 145. Спосіб за п. 143, де біологічно активною молекулою є інтерферон. 146. Спосіб за п. 145, де біологічно активною молекулою є інтерферон α. 147. Спосіб за п. 145, де біологічно активною молекулою є інтерферон β. 148. Спосіб за п. 145, де інтерферон являє собою інтерферон α і містить лінкер з 15-25 амінокислот. 149. Спосіб за п. 148, де інтерферон α містить лінкер з 15-20 амінокислот. 150. Спосіб за п. 144, де вірусною інфекцією є ВІЛінфекція. 95436 8 151. Спосіб за п. 143, де вказаним захворюванням або станом є розлад кровотоку. 152. Спосіб за п. 151, де вказаним розладом кровотоку є гемофілія А. 153. Спосіб за п. 151, де вказаним розладом кровотоку є гемофілія В. 154. Спосіб за п. 143, де вказаним захворюванням або станом є анемія. 155. Спосіб за п. 143, де химерний білок вводять внутрішньовенним, внутрішньом’язовим, підшкірним, пероральним, букальним, під’язиковим, назальним, ректальним, вагінальним шляхом. 156. Спосіб за п. 155, де химерний білок вводять легеневим шляхом. 157. Спосіб за п. 155, де химерний білок вводять перорально. 158. Спосіб за п. 143, де імуноглобулін є IgG. 159. Спосіб за п. 143, де частина імуноглобуліну є Fc-фрагментом. 160. Химерний білок, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, зв’язані разом, в якому вказаний перший ланцюг містить біологічно активну молекулу і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, і вказаний другий ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, нековалентно зв’язану з будь-якою іншою молекулою, за винятком частини імуноглобуліну, що є у вказаному першому поліпептидному ланцюгу, де тільки перший поліпептидний ланцюг містить біологічно активну молекулу. 161. Химерний білок за п. 160, де частина константної ділянки імуноглобуліну є FcRn-зв’язувальним партнером. 162. Химерний білок, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, зв’язані разом, де вказаний перший ланцюг містить біологічно активну молекулу і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, і вказаний другий ланцюг містить щонайменше частину виключно константної ділянки імуноглобуліну, де тільки перший поліпептидний ланцюг містить біологічно активну молекулу. 163. Химерний білок за п. 162, де частина константної ділянки імуноглобуліну є FcRn-зв’язувальним партнером. 164. Спосіб одержання химерного білка, що містить Fc-фрагмент імуноглобуліну, зв’язаний з біологічно активною молекулою, при цьому у вказаному способі здійснюють a) трансфекцію клітини конструкцією ДНК, яка містить послідовність ДНК, що кодує Fc-фрагмент імуноглобуліну, і другу послідовність ДНК, що кодує інтеїн; b) культивування вказаної клітини, трансфікованої з етапу а), в таких умовах, за яких експресується Fc-фрагмент та інтеїн; c) виділення вказаного Fc-фрагмента та інтеїну з вказаної клітини методом хроматографії; d) хімічний синтез біологічно активної молекули, що має N-кінцевий Cys; е) взаємодію виділеного інтеїн-Fc за с) з MESNA, з утворенням С-кінцевого тіоефіру; f) взаємодію біологічно активної молекули за d) з Fc за е) з одержанням химерного білка, що містить Fc, зв’язаного з біологічно активною молекулою. 9 165. Спосіб одержання химерного білка, що містить Fc-фрагмент імуноглобуліну, зв’язаний з біологічно активною молекулою, при цьому у вказаному способі здійснюють: a) трансфекцію клітини конструкцією ДНК, яка містить послідовність ДНК, що кодує Fc-фрагмент імуноглобуліну, і другу послідовність ДНК, що кодує сигнальний пептид, де вказаний сигнальний пептид розташований поруч з цистеїном Fcфрагмента; b) культивування вказаної клітини, трансфікованої на етапі а) в таких умовах, за яких експресується Fc-фрагмент і сигнальний пептид і Fc-фрагмент секретується з клітини без сигнального пептиду і з N-кінцевим цистеїном; c) виділення димерів поліпептидів вказаного Fcфрагмента з N-кінцевим цистеїном, кодованим вказаною першою та другою конструкціями ДНК з а) з вказаної клітини хроматографією; d) хімічний синтез біологічно активної молекули, що має тіоефір; е) взаємодію біологічно активної молекули за d) Fc за с) в таких умовах, за яких біологічно активна молекула може зв’язуватися з одним ланцюгом димеру за с) з одержанням химерного білка, що містить Fс, зв’язаного з біологічно активною молекулою. 166. Спосіб за п. 165, де тіоефір є С-кінцевим тіоефіром. 167. Спосіб одержання химерного білка, що містить Fc-фрагмент імуноглобуліну, зв’язаний з біологічно активною молекулою, при цьому у вказаному способі здійснюють: a) трансфекцію клітини конструкцією ДНК, яка містить послідовність ДНК, що кодує Fc-фрагмент імуноглобуліну, і другу послідовність ДНК, що кодує сигнальний пептид, де вказаний сигнальний пептид розташований поруч з цистеїном Fcфрагмента; b) культивування вказаної клітини, трансфікованої з етапу а) в таких умовах, за яких експресується Fc-фрагмент і сигнальний пептид, зв’язані разом, і вказаний сигнальний пептид відщеплюється від Fс-фрагмента в клітині в першому положенні, розташованому поруч з цистеїном, або у другому положенні, розташованому поруч з валіном; c) виділення димерів поліпептиду вказаних Fcфрагментів з двома N-кінцевими цистеїнами або двома N-кінцевими валінами або N-кінцевим цистеїном і N-кінцевим валіном, що кодуються вказаними першою і другою конструкціями ДНК за а), з вказаної клітини хроматографією; d) хімічний синтез біологічно активної молекули, що має тіоефір; е) взаємодію біологічно активної молекули за d) з димерами за с) з одержанням химерного білка, що містить перший ланцюг, що включає в себе Fc, зв’язаний з біологічно активною молекулою, і другий ланцюг, що включає в себе Fc, не зв’язаний ні з якою біологічно активною молекулою або варіабельною ділянкою імуноглобуліну. 168. Спосіб за п. 167, де тіоефір є С-кінцевим тіоефіром. 169. Спосіб виділення химерного білка за п. 1 з суміші, де суміш містить 95436 10 a) химерний білок за п. 1; b) димер, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де перший і другий ланцюги, обидва, містять біологічно активну молекулу і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну; і c) частину константної ділянки імуноглобуліну; де вказаний спосіб передбачає: 1) приведення в контакт суміші з лігандомбарвником, зв’язаним з твердою підкладкою у відповідних умовах, за яких химерний білок за п. 1 і димер зв’язуються з лігандом-барвником; 2) видалення частини константної ділянки імуноглобуліну, що не зв’язана з лігандом-барвником; 3) зміну відповідних умов 1) для того, щоб зв’язок між химерним білком за п. 1 і лігандом-барвником, зв’язаним з твердою підкладкою, розривався; 4) елюювання химерного білка за п. 1. 170. Спосіб за п. 169, де частина імуноглобуліну є Fc-фрагментом. 171. Спосіб за п. 169, де лігандом-барвником є молекула біоміметика. 172. Спосіб за п. 169, де ліганд-барвник вибраний з Mimetic Red 1™, Mimetic Red 2™, Mimetic Orange 1™, Mimetic Orange 2™, Mimetic Orange 3™, Mimetic Yellow 1™, Mimetic Yellow 2™, Mimetic Green 1™, Mimetic Blue 1™ і Mimetic Blue 2™. 173. Спосіб за п. 169, де химерний білок містить Еро. 174. Спосіб за п. 172 або 173, де лігандомбарвником є Mimetic Red 2™. 175. Спосіб за п. 169, де вказаний химерний білок являє собою фактор VII або VIIa. 176. Спосіб за п. 169, де вказана біологічно активна молекула являє собою фактор VIII або фактор VІІІa. 177. Спосіб за п. 169, де химерний білок містить фактор IX. 178. Спосіб за п. 169, де химерний білок містить інтерферон. 179. Спосіб за п. 178, де химерний білок містить інтерферон α. 180. Спосіб за п. 178, де химерний білок містить інтерферон β. 181. Спосіб за п. 169, де химерний білок містить інгібітор злиття ВІЛ. 182. Спосіб за п. 172 або 178, де лігандомбарвником є Mimetic Green 1™. 183. Спосіб за п. 169, де відповідні умови включають буфер, який має рН в діапазоні 4-9 включно. 184. Спосіб за п. 183, де зміна відповідних умов полягає в додаванні щонайменше однієї солі до буфера в концентрації, достатній для руйнування зв’язку гібриду мономер-димер з лігандомбарвником з виділенням, таким чином, гібриду мономер-димер. 185. Спосіб за п. 184, де щонайменше однією сіллю є NaCl. 186. Спосіб за п. 183, де буфер має рН 8. 187. Спосіб за п. 186, де концентрація солі становить 400 мМ, і химерний білок містить Еро. 188. Спосіб за п. 184, що додатково включає додавання більш високої концентрації солі у порівнянні з концентрацією солі, яка руйнує зв’язок гібриду мономер-димер з лігандом-барвником так, що більш висока концентрація солі руйнує зв’язок 11 95436 12 димеру з лігандом-барвником з виділенням, таким чином, димеру. 189. Химерний білок, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де вказаний перший ланцюг містить ЕРО, восьмиамінокислотний лінкер, що містить амінокислотну послідовність EFAGAAAV, і Fc-фрагмент константної ділянки імуноглобуліну, що містить мутацію аспарагіну в аланін у положенні 297; і де вказаний другий ланцюг містить Fcфрагмент константної ділянки імуноглобуліну, що містить мутацію аспарагіну в аланін у положенні 297. 190. Химерний білок за п. 189, який додатково містить афінну мітку. 191. Химерний білок, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де вказаний перший ланцюг містить фактор VІІІ або фактор VІІІa, восьмиамінокислотний лінкер, що має амінокислотну послідовність EFAGAAAV, і Fc-фрагмент константної ділян ки імуноглобуліну, що містить мутацію аспарагіну в аланін у положенні 297; і де вказаний другий ланцюг містить Fc-фрагмент константної ділянки імуноглобуліну, що містить мутацію аспарагіну в аланін у положенні 297. 192. Химерний білок за п. 191, який додатково містить афінну мітку. 193. Химерний білок, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де вказаний перший ланцюг містить фактор IX, восьмиамінокислотний лінкер, що має амінокислотну послідовність EFAGAAAV, і Fc-фрагмент константної ділянки імуноглобуліну, що містить мутацію аспарагіну в аланін у положенні 297; і де вказаний другий ланцюг містить Fcфрагмент константної ділянки імуноглобуліну, що містить мутацію аспарагіну в аланін у положенні 297. 194. Химерний білок за п. 193, який додатково містить афінну мітку. Дана заявка претендує на пріоритет за попередньою заявкою на видачу патенту США № 60/469600, поданою 6 травня 2003 року, попередньою заявкою на видачу патенту США № 60/487964, поданою 17 липня 2003 року, і попередньою заявкою на видачу патенту США № 60/539207, поданою 26 січня 2004 року, всі вказані заявки включені у вигляді посилання в повному об'ємі. Непопередня заявка на видачу патенту США, озаглавлена «Methods for Chemically Synthesizing Immunoglobulin Chimeric Proteins», подана б травня 2004 року, включена у вигляді посилання. Галузь техніки, до якої відноситься винахід Винахід загалом відноситься до терапевтичних химерних білків, що складаються з двох поліпептидних ланцюгів, в яких перший ланцюг складається з терапевтичної біологічно активної молекули, а другий ланцюг не складається з терапевтичної біологічно активної молекули першого ланцюга. Більш конкретно, винахід відноситься до химерних білків, що складаються з двох поліпептидних ланцюгів, в яких обидва ланцюги складаються щонайменше з частини константної ділянки імуноглобуліну, де перший ланцюг модифікований так, щоб він, крім того, містив біологічно активну молекулу, а другий ланцюг не модифікований таким чином. Отже, винахід відноситься до химерного білка, який є гібридом мономер-димер, тобто химерного білка, що має димерний аспект і мономерний аспект, при цьому димерний аспект відноситься до того факту, що він складається з двох поліпептидних ланцюгів, кожен з яких складається з частини константної ділянки імуноглобуліну, а мономерний аспект відноситься до того факту, що тільки один з двох ланцюгів складається з терапевтичної біологічно активної молекули. Фіг. 1 ілюструє один приклад гібриду мономер-димер, в якому біологічно активною молекулою є еритропоетин (ЕРО), а частина константної ділянки імуноглобуліну являє собою Fc-ділянку IgG. Рівень техніки Імуноглобуліни складаються з чотирьох поліпептидних ланцюгів, двох важких ланцюгів і двох легких ланцюгів, які зв'язані за допомогою дисульфідних зв'язків з утворенням тетрамерів. Кожний ланцюг, крім того, складається з однієї варіабельної ділянки однієї константної ділянки. Варіабельні ділянки опосередковують упізнавання і зв'язування антигену, тоді як константні ділянки, зокрема константні ділянки важких ланцюгів, опосередковують множину ефекторних функцій, наприклад, зв'язування комплементу і зв'язування Fc-рецептора (дивіться, наприклад, патенти США №№ 6086875, 5624821, 5116964). Константна ділянка, крім того, складається з доменів, названих СН-доменами (константна важка) (CH1, СН2 і т.д.). В залежності від ізотипу (наприклад, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) константна ділянка може складатись з трьох або чотирьох СНдоменів. Константні ділянки деяких ізотипів (наприклад, IgG) також містять шарнірну ділянку, Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y. Створення химерних білків, що складаються з константних ділянок імуноглобуліну, зв'язаних з частиною, яка представляє інтерес, або її фрагментом, описано (дивіться, наприклад, патенти США №№ 5480981 і 5808029; Gascoigne et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936; Capon et al. 1989, Nature 337:525; Traunecker et al. 1989, Nature 339:68; Zettmeissl et al. 1990, DNA Cell Biol. USA 9:347; Byrn et al. 1990, Nature. 344:667; Watson et al. 1990, J. Cell, Biol. 110:2221; Watson etal. 1991. Nature 349:164; Aruffo et al. 1990, Cell 61:1303; Linsley et al. 1991, J. Exp. Med. 173:721; Linsley et al. 1991, J. Exp. Med. 174:561; Stamenkovic et al., 1991, Cell 66:1133; Ashkenazi et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Lesslauer et al. 1991, Eur. J. Immunol. 27:2883; Peppel et al. 1991, J. Exp. Med. 174:1483; Bennett et al. 1991, J. Biol. Chem. 266:23060; Kurschner et al. 1992, J. Biol. Chem. 267:9354; Chalupny et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10360; Ridgway and German, 1991, J. Cell. 13 Biol. 115, Abstract No. 1448; Zheng et al. 1995, J. Immun. 154:5590). Вказані молекули звичайно володіють як біологічною активністю, асоційованою зі зв'язаною молекулою, яка представляє інтерес, так і ефекторною функцією, або деякими іншими необхідними характеристиками, пов'язаними з константною ділянкою імуноглобуліну (наприклад, біологічною стабільністю, клітинною секрецією). Fc-частина константної ділянки імуноглобуліну в залежності від ізотипу імуноглобуліну, може включати в себе домени СН2, CH3 і СН4, а також шарнірну ділянку. Химерні білки, що містять Fcчастину імуноглобуліну, набувають декілька необхідних властивостей химерного білка, включаючи підвищену стабільність, збільшений час напівжиття в сироватці (дивіться Capon et al. 1989, Nature 337:525), а також зв'язування з Fc-рецепторами, такими як неонатальний Fc-рецептор (FcRn) (патенти США №№ 6086875, 6485726, 6030613; WO 03/077834; US2003-0235536A1). FcRn є активним в епітеліальній тканині дорослих особнів і експресується в просвіті кишечнику, легеневих дихальних шляхах, назальних поверхнях, вагінальних поверхнях і ректальних поверхнях (патент США № 6485726). Химерні білки, що складаються з FcRn-зв'язувальних партнерів (наприклад, IgG, Fc-фрагментів), можуть бути ефективно переміщені через епітеліальні бар'єри за допомогою FcRn, таким чином забезпечуючи неінвазивні способи системного введення необхідної терапевтичної молекули. Крім того, химерні білки, що містять FcRn-зв'язувальний партнер, піддаються ендоцитозу клітинами, експресуючими FcRn. Але замість того, щоб стати мішенню для руйнування, вказані химерні білки знов повертаються в циркуляцію, таким чином збільшуючи час напівжиття вказаних білків in vivo. Частини константних ділянок імуноглобуліну, наприклад, FcRn-зв'язувальні партнери, звичайно зв'язані за допомогою дисульфідних зв'язків та інших неспецифічних взаємодій одного з одним, утворюючи димери і мультимери більш високого порядку. Даний винахід частково заснований на несподіваному відкритті того, що трансцитоз химерних білків, що складаються з FcRnзв'язувальних партнерів, мабуть, обмежений молекулярною масою химерного білка, при цьому форми з більш високою молекулярною масою транспортуються менш ефективно. Химерні білки, що складаються з біологічно активних молекул, після введення звичайно будуть взаємодіяти з молекулою-мішенню або клітиною. Даний винахід, крім того, частково заснований на несподіваному відкритті того, що гібриди мономер-димер з однією біологічно активною молекулою, але з двома частинами константної ділянки імуноглобуліну, наприклад двома FcRnзв'язувальними партнерами, функціонують і можуть транспортуватись більш ефективно, ніж гомодимери, також названі в даному описі просто «димери», або мультимери більш високого порядку з двома або більше копіями біологічно активної молекули. Частково це є наслідком того факту, що химерні білки, які складаються з двох або більше біоло 95436 14 гічно активних молекул, які існують у вигляді димерів і мультимерів більш високого порядку, можуть мати стеричні перешкоди для взаємодії з молекулою-мішенню або клітиною внаслідок присутності двох або більше біологічно активних молекул в тісному сусідстві одна з одною, і що біологічна молекула може володіти високою афінністю до себе самої. Відповідно, один аспект винаходу відноситься до химерних білків, що складаються з біологічно активної молекули, яка транспортується через епітеліальний бар'єр. Додатковий аспект винаходу відноситься до химерних білків, що складаються щонайменше з однієї біологічно активної молекули, яка здатна взаємодіяти зі своєю молекулоюмішенню або клітиною з невеликою стеричною перешкодою або самоагрегацією або за відсутності таких. Аспекти винаходу відносяться до химерних білків, що містять перший і другий поліпептидні ланцюги, при цьому перший ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, де частина константної ділянки імуноглобуліну була модифікована так, щоб вона включала в себе біологічно активну молекулу, а другий ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, де частина константної ділянки імуноглобуліну не була модифікована таким чином, щоб вона містила біологічно активну молекулу першого ланцюга. Суть винаходу Винахід відноситься до химерного білка, що містить одну біологічно активну молекулу і дві молекули щонайменше частини константної ділянки імуноглобуліну. Химерний білок здатний взаємодіяти з молекулою-мішенню або клітиною з меншою стеричною перешкодою у порівнянні з химерним білком, що складається щонайменше з двох біологічно активних молекул і щонайменше частини двох константних ділянок імуноглобуліну. Винахід також відноситься до химерного білка, що містить щонайменше одну біологічно активну молекулу і дві молекули щонайменше частини константної ділянки імуноглобуліну, який транспортується через епітеліальний бар'єр більш ефективно, ніж відповідний гомодимер, тобто в якому обидва ланцюги зв'язані з однією і тією ж біологічно активною молекулою. Таким чином винахід відноситься до химерного білка, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, зв'язані разом, де вказаний перший ланцюг містить біологічно активну молекулу і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, а вказаний другий ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, але не містить варіабельної ділянки імуноглобуліну і не містить якої-небудь зв'язаної біологічно активної молекули. Винахід відноситься до химерного білка, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, зв'язані разом, в якому вказаний перший ланцюг містить біологічно активну молекулу і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, і вказаний другий ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну без варіабельної ділянки імуноглобуліну або якої-небудь біологі 15 чно активної молекули і де вказаний другий ланцюг нековалентно зв'язаний з будь-якою молекулою, що має молекулярну масу більше 1 кДа, 2 кДа, 5 кДа, 10 кДа або 20 кДа. В одному варіанті другий ланцюг нековалентно зв'язаний з будьякою молекулою, що має молекулярну масу більше 0-2 кДа. В одному варіанті другий ланцюг нековалентно зв'язаний з будь-якою молекулою, що має молекулярну масу більше 5-10 кДа. В одному варіанті другий ланцюг нековалентно зв'язаний з будь-якою молекулою, що має молекулярну масу більше 15-20 кДа. Винахід відноситься до химерного білка, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, зв'язані разом, в якому вказаний перший ланцюг містить біологічно активну молекулу і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, і вказаний другий ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, нековалентно зв'язану з будь-якою іншою молекулою, за винятком частини імуноглобуліну вказаного першого поліпептидного ланцюга. Винахід відноситься до химерного білка, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, зв'язані разом, в якому вказаний перший ланцюг містить біологічно активну молекулу і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, і вказаний другий ланцюг складається щонайменше з частини константної ділянки імуноглобуліну і необов'язкової афінної мітки. Винахід відноситься до химерного білка, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, зв'язані разом, в якому вказаний перший ланцюг містить біологічно активну молекулу і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, і вказаний другий ланцюг по суті складається щонайменше з частини константної ділянки імуноглобуліну і необов'язкової афінної мітки. Винахід відноситься до химерного білка, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, зв'язані разом, в якому вказаний перший ланцюг містить біологічно активну молекулу і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, і вказаний другий ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну без варіабельної ділянки імуноглобуліну або якої-небудь біологічно активної молекули і необов'язково молекулу з молекулярною масою менше 10 кДа, 5 кДа, 2 кДа або 1 кДа. В одному варіанті другий ланцюг містить молекулу менше 15-20 кДа. В одному варіанті другий ланцюг містить молекулу менше 5-10 кДа. В одному варіанті другий ланцюг містить молекулу менше 1-2 кДа. Винахід відноситься до химерного білка, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, в якому вказаний перший ланцюг містить біологічно активну молекулу, щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну і щонайменше перший домен, при цьому вказаний перший домен має щонайменше один специфічний зв'язувальний партнер, і в якому вказаний другий ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну і щонайменше другий домен, де вказаний другий домен є специфічним партнером при зв'язуванні з вказаним першим доменом, без якої 95436 16 небудь варіабельної ділянки імуноглобуліну або біологічно активної молекули. Винахід відноситься до способу одержання химерного білка, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, в якому перший поліпептидний ланцюг і другий поліпептидний ланцюг не однакові, при цьому вказаний спосіб включає в себе трансфекцію клітини першою конструкцією ДНК, що містить молекулу ДНК, яка кодує перший поліпептидний ланцюг, що містить біологічно активну молекулу і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну і необов'язково лінкер, і другою конструкцією ДНК, що містить молекулу ДНК, яка кодує другий поліпептидний ланцюг, що містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну без якої-небудь біологічно активної молекули або варіабельної ділянки імуноглобуліну і необов'язково лінкер, культивування клітин в таких умовах, за яких експресується поліпептидний ланцюг, що кодується першою конструкцією ДНК, і експресується поліпептидний ланцюг, що кодується другою конструкцією ДНК, і виділення гібридів мономер-димер, які складаються з поліпептидного ланцюга, що кодується першою конструкцією ДНК, і поліпептидного ланцюга, що кодується другою конструкцією ДНК. Винахід відноситься до способу одержання химерного білка, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, в якому перший поліпептидний ланцюг і другий поліпептидний ланцюг не однакові і в якому вказаний перший поліпептидний ланцюг містить біологічно активну молекулу, щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну і щонайменше перший домен, при цьому вказаний перший домен має щонайменше один специфічний зв'язувальний партнер, і в якому вказаний другий поліпептидний ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну і другий домен, де вказаний другий домен є специфічним партнером при зв'язуванні з вказаним першим доменом, без якої-небудь біологічно активної молекули або варіабельної ділянки імуноглобуліну, при цьому вказаний спосіб включає в себе трансфекцію клітини першою конструкцією ДНК, що містить молекулу ДНК, яка кодує вказаний перший поліпептидний ланцюг, і другою конструкцією ДНК, що містить молекулу ДНК, яка кодує вказаний другий поліпептидний ланцюг, культивування клітин в таких умовах, за яких експресується поліпептидний ланцюг, що кодується першою конструкцією ДНК, і експресується поліпептидний ланцюг, що кодується другою конструкцією ДНК, і виділення гібридів мономер-димер, які складаються з поліпептидного ланцюга, що кодується першою конструкцією ДНК, і поліпептидного ланцюга, що кодується другою конструкцією ДНК. Винахід відноситься до способу одержання химерного білка згідно з винаходом, при цьому вказаний спосіб включає в себе трансфекцію клітини першою конструкцією ДНК, що містить молекулу ДНК, яка кодує перший поліпептидний ланцюг, що містить біологічно активну молекулу і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну і необов'язково лінкер, культивування клітини в таких умовах, за яких експресується по 17 ліпептидний ланцюг, що кодується першою конструкцією ДНК, виділення поліпептидного ланцюга першою конструкцією, що кодується ДНК, і трансфекцію клітини другою конструкцією ДНК, що містить молекулу ДНК, яка кодує другий поліпептидний ланцюг, що містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну без якоїнебудь біологічно активної молекули або варіабельної ділянки імуноглобуліну, культивування клітини в таких умовах, за яких експресується поліпептидний ланцюг, що кодується другою конструкцією ДНК, виділення поліпептидного ланцюга, що кодується другою конструкцією ДНК, об'єднання поліпептидного ланцюга, що кодується першою конструкцією ДНК, і поліпептидного ланцюга, що кодується другою конструкцією ДНК, в таких умовах, за яких утворюються гібриди мономер-димер, які містять поліпептидний ланцюг, що кодується першою конструкцією ДНК, поліпептидний ланцюг, що кодується другою конструкцією ДНК, і виділення вказаних гібридів мономердимер. Винахід відноситься до способу одержання химерного білка, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, в якому перший поліпептидний ланцюг і другий поліпептидний ланцюг не є однаковими, при цьому вказаний спосіб включає в себе трансфекцію клітини конструкцією ДНК, що містить молекулу ДНК, яка кодує поліпептидний ланцюг, що містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, культивування клітин в таких умовах, за яких експресується поліпептидний ланцюг, що кодується конструкцією ДНК, з Nкінцевим цистеїном, так що утворюються димери поліпептидного ланцюга, виділення димерів, що складаються з двох копій поліпептидного ланцюга, що кодується конструкцією ДНК, і хімічну взаємодію виділених димерів з біологічно активною молекулою, при цьому вказана біологічно активна молекула має складний тіоефір на С-кінці, в таких умовах, за яких біологічно активна молекула взаємодіє переважно тільки з одним поліпептидним ланцюгом димеру, тим самим утворюючи гібрид мономер-димер. Винахід відноситься до способу одержання химерного білка, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, в якому перший поліпептидний ланцюг і другий поліпептидний ланцюг не є однаковими, при цьому вказаний спосіб включає в себе трансфекцію клітини конструкцією ДНК, що містить молекулу ДНК, яка кодує поліпептидний ланцюг, що містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, культивування клітин в таких умовах, за яких експресується поліпептидний ланцюг, що кодується конструкцією ДНК, з Nкінцевим цистеїном, так що утворюються димери поліпептидних ланцюгів, і виділення димерів, що містять дві копії поліпептидного ланцюга, що кодуються конструкцією ДНК, і хімічну взаємодію виділених димерів з біологічно активною молекулою, при цьому вказана біологічно активна молекула має складний тіоефір на С-кінці, так що біологічно активна молекула зв'язується з кожним ланцюгом димеру, денатурацію димеру, що складається з частини імуноглобуліну, зв'язаного з 95436 18 біологічно активною молекулою з утворенням мономерних ланцюгів, об'єднання мономерних ланцюгів з поліпептидним ланцюгом, що містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, яка не має зв'язаної з нею біологічно активної молекули, з утворенням гібридів мономер-димер і виділення гібридів мономер-димер. Винахід відноситься до способу одержання химерного білка, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, в якому перший поліпептидний ланцюг і другий поліпептидний ланцюг не є однаковими, при цьому вказаний спосіб включає в себе трансфекцію клітини конструкцією ДНК, що містить молекулу ДНК, яка кодує поліпептидний ланцюг, що містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, культивування клітин в таких умовах, за яких експресується поліпептидний ланцюг, що кодується конструкцією ДНК, у вигляді суміші двох поліпептидних ланцюгів, де суміш містить поліпептид з N-кінцевим цистеїном і поліпептид з цистеїном поблизу N-кінця, виділення димерів, що складаються з суміші поліпептидних ланцюгів, які кодуються конструкцією ДНК, і хімічну взаємодію виділених димерів з біологічно активною молекулою, при цьому вказана біологічно активна молекула має активний складний тіоефір, так що утворюються щонайменше декілька гібридів мономер-димер, і виділення гібриду мономердимер з вказаної суміші. Винахід відноситься до способу лікування захворювання або стану, що включає в себе введення химерного білка згідно з винаходом, завдяки чому лікують захворювання або стан. Додаткові об'єкти і переваги винаходу будуть вказані частково в описі, який слідує далі, і частково будуть очевидними, виходячи з опису, або можуть бути досліджені при практичному здійсненні винаходу. Об'єкти і переваги винаходу будуть зрозумілі і досягнуті за допомогою елементів і комбінацій, детально вказаних у прикладеній формулі винаходу. Потрібно розуміти, що і наведений вище загальний опис і докладний опис, який слідує далі, є тільки зразковими і пояснювальними і не обмежують винахід, який заявлений. Короткий опис креслень Фіг. 1 є схематичною діаграмою, що порівнює структуру гомодимеру EPO-Fc або димеру і структуру гібриду мономер-димер Epo-Fc. На Фіг. 2а показана амінокислотна послідовність химерного білка фактор VII-Fc. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений), який відщеплюється клітиною, і пропептид (жирним шрифтом), який впізнається вітамін Кзалежною -карбоксилазою, яка модифікує фактор VII з досягненням повної активності. Послідовність згодом розщеплюється PACE з одержанням фактор VII-Fc. На Фіг. 2b показана амінокислотна послідовність химерного білка фактор IX-Fc. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений), який відщеплюється клітиною, і пропептид (жирним шрифтом), який впізнається вітамін Кзалежною -карбоксилазою, яка модифікує фактор IX, з досягненням повної активності. Послідовність 19 згодом розщеплюється PACE з одержанням фактор IX-Fc. На Фіг. 2с показана амінокислотна послідовність химерного білка IFN-Fc. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений), який відщеплюється клітиною з утворенням в результаті зрілого IFN-Fc. На Фіг. 2d показана амінокислотна послідовність химерного білка IFN-Fc-Γ -лінкер. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений), який відщеплюється клітиною з утворенням в результаті зрілого IFN-Fc- -лінкер. На Фіг. 2е показана амінокислотна послідовність химерного білка Flag-Fc. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений), який відщеплюється клітиною з утворенням в результаті зрілого Flag-Fa. На Фіг. 2f показана амінокислотна послідовність химерного білка Еро-ССА-Fc. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений), який відщеплюється клітиною з утворенням в результаті зрілого Epo-CCA-Fc. Також жирним шрифтом показаний кислий двоспіральний домен. На Фіг. 2g показана амінокислотна послідовність химерного білка CCB-Fc. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений), який відщеплюється клітиною з утворенням в результаті зрілого CCB-Fc. Також жирним шрифтом показаний основний двоспіральний домен. На Фіг. 2h показана амінокислотна послідовність химерного білка Cys-Fc. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений), який відщеплюється клітиною з утворенням в результаті зрілого Cys-Fc. Коли дана послідовність утворюється в клітинах СНО, деякий процент молекул неправильно розщеплюється сигнальною пептидазою, так що зліва від N-кінця є дві додаткові амінокислоти, тим самим перешкоджаючи зв'язуванню біологічно активної молекули з Скінцевим тіоефіром (наприклад, за допомогою простого лігування). Коли вказані неправильно розщеплені форми димеризуються з правильно розщепленим Cys-Fc і потім зазнають взаємодії з біологічно активними молекулами з С-кінцевими тіоефірами, утворюються гібриди мономер-димер. На Фіг. 2і показана амінокислотна послідовність химерного білка IFN-GS15-Fc. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений), який відщеплюється клітиною з утворенням в результаті зрілого IFN-GS15-Fc. На Фіг. 2j показана амінокислотна послідовність химерного білка Epo-Fc. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений), який відщеплюється клітиною з утворенням в результаті Epo-Fc. Також жирним шрифтом показаний 8-амінокислотний лінкер. На Фіг. 3a показана послідовність нуклеїнової кислоти химерного білка фактор VII-Fc. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений) і пропептид (жирним шрифтом), який впізнається вітамін К-залежною -карбоксилазою, яка модифікує фактор VII з досягненням повної активності. Послідовність, що транслюється, потім розщеплюється PACE з одержанням зрілого фактор VII-Fc. 95436 20 На Фіг. 3b показана послідовність нуклеїнової кислоти химерного білка фактор IX-Fc. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений) і пропептид (жирним шрифтом), який впізнається вітамін К-залежною -карбоксилазою, яка модифікує фактор IX з досягненням повної активності. Послідовність, що транслюється, потім розщеплюється PACE з одержанням зрілого фактор IX-Fc. На Фіг. 3с показана послідовність нуклеїнової кислоти химерного білка IFN-Fc. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений), який відщеплюється клітиною після трансляції з утворенням в результаті зрілого IFN-Fc. На Фіг. 3d показана послідовність нуклеїнової кислоти химерного білка IFN-Fc- -лінкер. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений), який відщеплюється клітиною після трансляції з утворенням в результаті зрілого IFN-Fc- лінкер. На Фіг. 3e показана амінокислотна послідовність химерного білка Flag-Fc. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений), який відщеплюється клітиною після трансляції з утворенням в результаті зрілого Flag-Fc. На Фіг. 3f показана послідовність нуклеїнової кислоти химерного білка Еро-CCA-Fc. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений), який відщеплюється клітиною після трансляції з утворенням в результаті зрілого Еро-CCA-Fc. Також жирним шрифтом показаний кислий двоспіральний домен. На Фіг. 3g показана послідовність нуклеїнової кислоти химерного білка ССВ-Fc. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений), який відщеплюється клітиною після трансляції з утворенням в результаті зрілого ССВ-Fc. Також жирним шрифтом показаний основний двоспіральний домен. На Фіг. 3h показана послідовність нуклеїнової кислоти химерного білка Cys-Fc. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений), який відщеплюється клітиною після трансляції з утворенням в результаті зрілого Cys-Fc. На Фіг. 3і показана послідовність нуклеїнової кислоти химерного білка IFN-GS15-Fc. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений), який відщеплюється клітиною після трансляції з утворенням в результаті зрілого IFN-GS15Fc. На Фіг. 3j показана послідовність нуклеїнової кислоти химерного білка Еро-Fc. У послідовність включений сигнальний пептид (підкреслений), який відщеплюється клітиною після трансляції з утворенням в результаті зрілого Еро-Fc. Також жирним шрифтом показана послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує 8-амінокислотний лінкер. Фіг. 4 показує шляхи утворення гібридів мономер-димер за допомогою звичайного лігування. На Фіг. 5а показана амінокислотна послідовність Fc MESNA (SEQ ID NO:4). На Фіг. 5b показана послідовність ДНК Fc MESNA (SEQ ID NO:5). На Фіг. 6 наведене порівняння противірусної активності гомодимеру IFN (тобто, що складається з 2 молекул IFN) з активністю гібриду мономер 21 IFN-димер (тобто, що складається з 1 молекули IFN). На Фіг. 7 наведене порівняння скипаючої активності химерного гібриду мономер-димер фактор VIIa-Fc (одна молекула фактора VII) і химерного гомодимеру фактор VIIa-Fc (дві молекули фактора VII). На Фіг. 8 наведене порівняння перорального дозування у новонароджених щурів химерного гібриду мономер-димер фактор VIIa-Fc (одна молекула фактора VII) і химерного гомодимеру фактор VIIa-Fc (дві молекули фактора VII). На Фіг. 9 наведене порівняння перорального дозування у новонароджених щурів химерного гібриду мономер-димер фактор IX-Fc (одна молекула фактора IX) і химерного гомодимеру. На Фіг. 10 показане тимчасове дослідження, що порівнює химерний гібрид мономер-димер фактор IX-Fc (одна молекула фактора IX), що вводиться перорально новонародженим щурам, з химерним гомодимером, що вводиться перорально. Фіг. 11 показує фармакокінетику димеру EpoFc у порівнянні з гібридом мономер-димер Epo-Fc у макак-крабоїдів після однократної легеневої дози. На Фіг. 12 наведене порівняння сироваткової концентрації у мавп підшкірно введеного гібриду мономер-димер Epo-Fc і підшкірно введеного Aranesp (дарбепоетин альфа). На Фіг. 13 наведене порівняння сироваткової концентрації у мавп внутрішньовенно введеного гібриду мономер-димер Epo-Fc і внутрішньовенно введеного Aranesp (дарбепоетин альфа) і Epogen (епоетин альфа). На Фіг. 14 показана крива для колонки Mimetic Red 2 (ProMetic LifeSciences, Inc., Wayne, NJ) і SDS-ПААГ-фракцій з колонки, що містять гібрид мономер-димер EpoFc, димер EpoFc і Fc. Гідрид мономер-димер EpoFc виявлений у фракціях 11, 12, 13 і 14. Димер EpoFc виявлений у фракції 18. Fc виявлений у фракціях 1/2. На Фіг. 15 показана фармакокінетика IFNFc з 8-амінокислотним лінкером у макак-крабоїдів після однократної легеневої дози. На Фіг. 16 показана стимуляція неоптерину у відповідь на гомодимер IFN-Fc і гібрид мономердимер IFN-Fc N297A у макак-крабоїдів. На Фіг. 17а показана нуклеотидна послідовність інтерферон -Fc; на Фіг. 17b показана амінокислотна послідовність інтерферон -Fc. На Фіг. 18 показана амінокислотна послідовність Т20(а); Т21(b) і Т1249(с). Опис варіантів А. Визначення Афінна мітка у значенні, що використовується в даному описі, означає молекулу, зв'язану з другою молекулою, яка представляє інтерес, здатну взаємодіяти зі зв'язувальним партнером з метою виділення або ідентифікації вказаної другої молекули, яка представляє інтерес. Аналоги химерних білків згідно з винаходом або білки, або пептиди, по суті ідентичні химерним білкам згідно з винаходом, у значенні, що викорис 95436 22 товується в даному описі, означають, що відповідна амінокислотна послідовність білка або пептиду щонайменше на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% або 100% ідентична даній послідовності. Як приклад такі послідовності можуть бути варіантами, одержаними з різних видів, або вони можуть бути одержані з даної послідовності за допомогою укорочення, делеції, заміни або додавання амінокислот. Процент ідентичності між двома амінокислотними послідовностями визначають з використанням стандартних алгоритмів вирівнювання, наприклад, за допомогою Basic Local Alignment Tool (BLAST), описаного в Altschul et al. 1990, J. Mol. Biol., 215:403-410, алгоритму Needleman et al. 1970, J. Mol. Biol., 48:444-453; алгоритму Meyers et al. 1988, Comput. Appl. Biosci., 4:11-17; або Tatusova et al. 1999, FEMS Microbiol. Lett., 174:247-250, і т.д. Такі алгоритми включені в програми BLASTN, BLASTP і «BLAST 2 Sequences» (дивіться www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). При використанні таких програм можна використати параметри за умовчанням. Наприклад, для нуклеотидних послідовностей можна використати наступні установки у випадку «BLAST 2 Sequences»: програма BLASTN, нагорода за збіг 2, штраф за неспівпадіння -2, штрафи за відкриття пропуску і подовження пропуску 5 і 2, відповідно, gap x_dropoff 50, очікування 10, розмір слова 11, фільтр ON. Для амінокислотних послідовностей можна використати наступні установки у випадку «BLAST 2 Sequences»: програма BLASTP, матриця BLOSUM62, штрафи за відкриття пропуску і подовження пропуску11 і 1, відповідно, gap x_dropoff 50, очікування 10, розмір слова 3, фільтр ON. Біодоступність у значенні, що використовується в даному, описі означає міру і швидкість, з якою речовина поглинається в живій системі або стає доступною у місці фізіологічної активності. Біологічно активна молекула у значенні, що використовується в даному описі, означає неімуноглобулінову молекулу або її фрагмент, що забезпечує лікування захворювання або стану, або локалізацію або напрям молекули до місця захворювання або стану в організмі за допомогою здійснення функції або дії або стимулювання або відповіді на функцію, дію або реакцію в біологічному контексті (наприклад, в організмі, клітині або її моделі in vitro). Біологічно активні молекули можуть включати в себе щонайменше одну з наступних речовин: поліпептиди, нуклеїнові кислоти, малі молекули, такі як малі органічні або неорганічні молекули. Химерний білок у значенні, що використовується в даному описі, відноситься до будь-якого білка, що складається з першої амінокислотної послідовності, одержаної з першого джерела, зв'язаної ковалентно або нековалентно з другою амінокислотною послідовністю, одержаною з другого джерела, де перше і друге джерела не є однаковими. Перше джерело і друге джерело, які не є однаковими, можуть включати два різних біологічних об'єкти або два різних білки з одного і того ж біологічного об'єкта або біологічний об'єкт і небіологічний об'єкт. Химерний білок може включати, 23 наприклад, білок, одержаний щонайменше з 2 різних біологічних джерел. Біологічне джерело може включати будь-яку несинтетично одержану послідовність нуклеїнової кислоти або амінокислотну послідовність (наприклад, послідовність геномної або кДНК, плазмідний або вірусний вектор, нативний віріон або мутант або аналог, які описані далі в даному описі, будь-якого з вказаних вище). Синтетичне джерело може включати послідовність білка або нуклеїнової кислоти, одержану хімічно, а не в біологічній системі (наприклад, твердофазний синтез амінокислотних послідовностей). Химерний білок також може включати білок, одержаний щонайменше з 2 різних синтетичних джерел, або білок, одержаний щонайменше з одного біологічного джерела і щонайменше з одного синтетичного джерела. Химерний білок також може містити першу амінокислотну послідовність, одержану з першого джерела, ковалентно або нековалентно зв'язану з нуклеїновою кислотою, одержаною з будь-якого джерела, або малою органічною або неорганічною молекулою, одержаною з будь-якого джерела. Химерний білок може містити молекулу лінкера між першою і другою амінокислотними послідовностями або між першою амінокислотною послідовністю і нуклеїновою кислотою, або між першою амінокислотною послідовністю і малою органічною або неорганічною молекулою. Фактор скипання у значенні, що використовується в даному описі, означає будь-яку молекулу або її аналог, природного походження або одержаної рекомбінантно, яка запобігає або знижує тривалість епізоду кровотечі у суб'єкта з гемостатичним порушенням. Іншими словами фактор скипання означає будь-яку молекулу, що володіє скипаючою активністю. Скипаюча активність у значенні, що використовується в даному описі, означає здатність брати участь в каскаді біохімічних реакцій, який завершується утворенням згустка фібрину і/або зменшувати тяжкість, тривалість або частоту геморагії або епізоду кровотечі. Димер у значенні, що використовується в даному описі, відноситься до химерного білка, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, в якому і перший і другий ланцюги містять біологічно активну молекулу і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну. Гомодимер відноситься до димеру, в якому обидві біологічно активні молекули є однією і тією ж молекулою. Димерно зв'язаний гібрид мономер-димер відноситься до химерного білка, що складається щонайменше з частини константної ділянки імуноглобуліну, наприклад, фрагмента Fc імуноглобуліну, біологічно активної молекули і лінкера, який зв'язує їх разом, так що одна біологічно активна молекула зв'язана з 2 поліпептидними ланцюгами, кожна з яких містить частину константної ділянки імуноглобуліну. На Фіг. 4 показаний приклад димерно зв'язаного гібриду мономер-димер. Конструкція ДНК у значенні, що використовується в даному описі, означає молекулу ДНК або клон такої молекули, або однонитковий, або двонитковий, яка була модифікована внаслідок втручання людини так, що вона містить ділянки ДНК, 95436 24 об'єднані таким чином, щоб вони як ціле не могли б існувати в природі в іншому випадку. Конструкції ДНК містять інформацію, необхідну для керування експресією поліпептидів, що представляють інтерес. Конструкції ДНК можуть містити промотори, енхансери і термінатори транскрипції. Конструкції ДНК, що містять інформацію, необхідну для керування секрецією поліпептиду, також будуть містити щонайменше одну сигнальну послідовність секреції. Домен у значенні, що використовується в даному описі, означає ділянку поліпептиду (включаючи білки, в тому вигляді, як даний термін визначений), що має деяку відмітну фізичну властивість або роль, включаючи, наприклад, структуру із незалежним укладанням, що складається з ділянки поліпептидного ланцюга. Домен може містити послідовність з відмітною фізичною ознакою поліпептиду або може містити фрагмент з фізичною ознакою, яка зберігає свої зв'язувальні властивості (тобто він може зв'язуватись з другим доменом). Домен може бути зв'язаний з іншим доменом. Іншими словами, перший домен може в природних умовах зв'язуватись з другим доменом. Фрагмент у значенні, що використовується в даному описі, відноситься до пептиду або поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність щонайменше з 2 амінокислотних залишків, які ідуть один за одним, щонайменше 5 амінокислотних залишків, які ідуть один за одним, щонайменше 10 амінокислотних залишків, які ідуть один за одним, щонайменше 15 амінокислотних залишків, які ідуть один за одним, щонайменше 20 амінокислотних залишків, які ідуть один за одним, щонайменше 25 амінокислотних залишків, які ідуть один за одним, щонайменше 40 амінокислотних залишків, які ідуть один за одним, щонайменше 50 амінокислотних залишків, які ідуть один за одним, щонайменше 100 амінокислотних залишків, які ідуть один за одним або щонайменше 200 амінокислотних залишків, які ідуть один за одним, або будь-яку делецію або укорочення білка, пептиду або поліпептиду. Гемостаз у значенні, що використовується в даному описі, означає зупинення кровотечі або геморагії; або зупинення потоку крові через кровоносну судину або частину тіла. Гемостатичний розлад у значенні, що використовується в даному описі, означає генетично успадкований або набутий стан, що характеризується тенденцією до геморагії, або спонтанно або внаслідок травми, або нездатністю утворювати згусток фібрину. Зв'язана у значенні, що використовується в даному описі, відноситься до першої послідовності нуклеїнової кислоти, ковалентно зв'язаної з другою послідовністю нуклеїнової кислоти. Перша послідовність нуклеїнової кислоти може бути безпосередньо зв'язана або поміщена поряд з другою послідовністю нуклеїнової кислоти або, альтернативно, проміжна послідовність може ковалентно зв'язувати першу послідовність з другою послідовністю. Зв'язана у значенні, що використовується в даному описі, також може відноситися до першої амінокислотної послідовності, ковален 25 тно або нековалентно зв'язаної з другою амінокислотною послідовністю. Перша амінокислотна послідовність може бути безпосередньо зв'язана або поміщена поряд з другою амінокислотною послідовністю або, альтернативно, проміжна послідовність може ковалентно зв'язувати першу амінокислотну послідовність з другою амінокислотною послідовністю. Оперативно зв'язана у значенні, що використовується в даному описі, означає, що перша послідовність нуклеїнової кислоти зв'язана з другою послідовністю нуклеїнової кислоти так, що обидві послідовності здатні експресуватись у вигляді біологічно активного білка або пептиду. Поліпептид у значенні, що використовується в даному описі, відноситься до полімеру амінокислот і не має відношення до конкретної довжини продукту; таким чином, пептиди, олігопептиди і білки включені у визначення поліпептиду. Даний термін не виключає постекспресійні модифікації поліпептиду, наприклад, глікозилування, ацетилування, фосфорилювання, пегілювання, додавання ліпідного залишку або додавання будь-якої органічної або неорганічної молекули. У визначення включені, наприклад, поліпептиди, що містять один або декілька аналогів амінокислоти (включаючи, наприклад, неприродні амінокислоти), і поліпептиди із заміщеними зв'язками, а також іншими модифікаціями, відомими в даній галузі, як такі, що зустрічаються в природі, так і такі, що не зустрічаються в природі. Висока жорсткість у значенні, що використовується в даному описі, включає умови, що легко визначаються фахівцем в даній галузі на основі, наприклад, довжини ДНК. Загалом такі умови визначені в Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, pp. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), і включають застосування розчину для попереднього промивання нітроцелюлозних фільтрів 5SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ ЕДТА (рН 8,0), умови гібридизації в 50% формаміді, 6SSC при 42°С (або іншому схожому розчині для гібридизації, такому як розчин Старка, в 50% формаміді при 42°С), і з промиванням приблизно при 68°С, 0,2SSC, 0,1% SDS. Фахівцеві в даній галузі буде відомо, що температуру і концентрацію солі в розчині для промивання можна коректувати так, як це необхідно відповідно до таких факторів, як довжина зонду. Помірна жорсткість у значенні, що використовується в даному описі, включає умови, які можуть бути легко визначені фахівцем в даній галузі на основі, наприклад, довжини ДНК. Основні умови наведені в Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. Vol. 1, pp. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), і включають застосування розчину для попереднього промивання нітроцелюлозних фільтрів 5SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ ЕДТА (рН 8,0), умови гібридизації у 50% формаміді, 6SSC при 42°С (або іншому схожому розчині для гібридизації, такому як розчин Старка, в 50% формаміді при 42°С), і умови промивання при 60°С, в 0,5SSC, 0,1% SDS. Мала неорганічна молекула у значенні, що використовується в даному описі, означає молекулу, 95436 26 що не містить атомів вуглецю і має розмір не більше 50 кДа. Мала органічна молекула у значенні, що використовується в даному описі, означає молекулу, що містить щонайменше один атом вуглецю і має розмір не більше 50 кДа. Лікувати, лікування, здійснення лікування у значенні, що використовується в даному описі, означає будь-яке з наступного: зменшення тяжкості захворювання або стану; зменшення тривалості перебігу захворювання; ослаблення одного або декількох симптомів, пов'язаних із захворюванням або станом; надання благотворної дії на суб'єкта із захворюванням або станом без обов'язкового зцілення захворювання або стану, профілактику одного або декількох симптомів, пов'язаних із захворюванням або станом. В. Удосконалення, що пропонуються деякими варіантами здійснення винаходу У винаході пропонуються химерні білки (гібриди мономер-димер), що містять перший і другий поліпептидні ланцюги, в яких вказаний перший ланцюг містить біологічно активну молекулу і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, і вказаний другий ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну без якої-небудь біологічно активної молекули або варіабельної ділянки імуноглобуліну. На Фіг. 1 зіставлені традиційні злиті білкові димери з одним прикладом гібриду мономер-димер згідно з винаходом. У даному варіанті біологічно активною молекулою є ЕРО і частина імуноглобуліну являє собою Fc-ділянку IgG. Подібно іншим химерним білкам, що складаються щонайменше з частини константної ділянки імуноглобуліну, винахід відноситься до химерних білків, які забезпечують підвищену стабільність і підвищену біодоступність химерного білка у порівнянні з окремою біологічно активною молекулою. Однак крім того, оскільки тільки один з двох ланцюгів містить біологічно активну молекулу, химерний білок має меншу молекулярну масу, ніж химерний білок, в якому всі ланцюги містять біологічно активну молекулу, і не бажаючи при цьому бути прив'язаними до якої-небудь теорії, це може приводити до химерного білка, що більш легко піддається трансцитозу через епітеліальний бар'єр, наприклад, за допомогою зв'язування з рецептором FcRn, таким чином підвищуючи час напівжиття химерного білка. Таким чином, в одному варіанті винахід відноситься до поліпшеного неінвазивного способу (наприклад, через будь-яку поверхню слизової оболонки, а саме пероральним, букальним, під'язиковим, назальним, ректальним, вагінальним або легеневим або очним шляхами) введення терапевтичного химерного білка згідно з винаходом. Таким чином, винахід відноситься до способів досягнення терапевтичних рівнів химерних білків згідно з винаходом з використанням менш частих і більш низьких доз у порівнянні з раніше описаними химерними білками (наприклад, химерними білками, що складаються щонайменше з частини константної ділянки імуноглобуліну і біологічно активної молекули, в яких всі 27 ланцюги химерного білка містять біологічно активну молекулу). В іншому варіанті винахід відноситься до інвазивного способу, наприклад, підшкірного, внутрішньовенного введення терапевтичного химерного білка згідно з винаходом. Інвазивне введення терапевтичного химерного білка згідно з винаходом забезпечує підвищений час напівжиття терапевтичного химерного білка, що в результаті приводить до застосування менш частих і більш низьких доз у порівнянні з раніше описаними химерними білками (наприклад, химерними білками, що складаються щонайменше з частини константної ділянки імуноглобуліну і біологічно активної молекули, в яких всі ланцюги химерного білка містять біологічно активну молекулу). Ще однією перевагою химерного білка, в якій тільки один з ланцюгів містить біологічно активну молекулу, є підвищена доступність біологічно активної молекули для її клітини-мішені або молекули-мішені, виникаюча внаслідок зменшених стеричних перешкод, зменшених гідрофобних взаємодій, зменшених іонних взаємодій або зниженої молекулярної маси у порівнянні з химерним білком, в якому всі ланцюги містять біологічно активну молекулу. С. Химерні білки Винахід відноситься до химерних білків, що містять одну біологічно активну молекулу, щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну і необов'язково щонайменше один лінкер. Частина імуноглобуліну буде мати N- або амінокінець і Сабо карбоксильний кінець. Химерний білок може мати біологічно активну молекулу, зв'язану з Nкінцем частини імуноглобуліну. Альтернативно, біологічно активна молекула може бути зв'язана з С-кінцем частини імуноглобуліну. В одному варіанті зв'язок є ковалентним зв'язком. В іншому варіанті зв'язок є нековалентним зв'язком. Химерний білок необов'язково може містити щонайменше один лінкер; таким чином, біологічно активна молекула не повинна бути безпосередньо зв'язана з частиною константної ділянки імуноглобуліну. Лінкер може розташовуватись між біологічно активною молекулою і частиною константної ділянки імуноглобуліну. Лінкер може бути зв'язаний з N-кінцем частини константної ділянки імуноглобуліну або С-кінцем частини константної ділянки імуноглобуліну. Якщо біологічно активна молекула складається щонайменше з однієї амінокислоти, то біологічно активна молекула буде мати N-кінець і С-кінець, і лінкер може бути зв'язаний з N-кінцем біологічно активної молекули або С-кінцем біологічно активної молекули. Винахід відноситься до химерного білка формули X-La-F:F або F:F-La-X, де X означає біологічно активну молекулу, L означає необов'язковий лінкер, F означає щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну і а є будь-яким цілим числом або нулем. Винахід також відноситься до химерного білка формули Та-Х-La-F:F або Ta-F:FLa-X, де X означає біологічно активну молекулу, L означає необов'язковий лінкер, F означає щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, а є будь-яким цілим числом або нулем, Τ озна 95436 28 чає другий лінкер або, альтернативно, мітку, яка може бути використана для полегшення очищення химерного білка, наприклад, FLAG-мітка, гістидинова мітка, GST-мітка, мітка у вигляді зв'язуючого мальтозу білка і (:) означає хімічну асоціацію, наприклад, щонайменше один непептидний зв'язок. У деяких варіантах хімічна асоціація, тобто (:) є ковалентним зв'язком. В інших варіантах хімічна асоціація, тобто (:), є нековалентною взаємодією, наприклад, іонною взаємодією, гідрофобною взаємодією, гідрофільною взаємодією, взаємодією Ван-дер-Ваальса, водневим зв'язком. Фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що коли а дорівнює нулю, X буде безпосередньо зв'язаний з F. Таким чином, наприклад, а може дорівнювати 0, 1,2, 3, 4, 5 або бути більше 5. В одному варіанті химерний білок згідно з винаходом містить амінокислотну послідовність, показану на Фіг. 2а (SEQ ID NO:6). В одному варіанті химерний білок згідно з винаходом містить амінокислотну послідовність, показану на Фіг. 2b (SEQ ID NO:8). В одному варіанті химерний білок згідно з винаходом містить амінокислотну послідовність, показану на Фіг. 2с (SEQ ID NO:10). В одному варіанті химерний білок згідно з винаходом містить амінокислотну послідовність, показану на Фіг. 2d (SEQ ID NO:12). В одному варіанті химерний білок згідно з винаходом містить амінокислотну послідовність, показану на Фіг. 2е (SEQ ID NO:14). В одному варіанті химерний білок згідно з винаходом містить амінокислотну послідовність, показану на Фіг. 2f (SEQ ID NO:16). В одному варіанті химерний білок згідно з винаходом містить амінокислотну послідовність, показану на Фіг. 2g (SEQ ID NO:18). В одному варіанті химерний білок згідно з винаходом містить амінокислотну послідовність, показану на Фіг. 2h (SEQ ID NO:20). В одному варіанті химерний білок згідно з винаходом містить амінокислотну послідовність, показану на Фіг. 2і (SEQ ID NO:22). В одному варіанті химерний білок згідно з винаходом містить амінокислотну послідовність, показану на Фіг. 2j (SEQ ID NO:24). В одному варіанті химерний білок згідно з винаходом містить амінокислотну послідовність, показану на Фіг. 17b (SEQ ID NO:27). 1. Варіанти химерних білків Розглядаються похідні химерних білків згідно з винаходом, антитіла проти химерних білків згідно з винаходом і антитіла проти зв'язувальних партнерів химерних білків згідно з винаходом, і вони можуть бути одержані зміною їх амінокислотних послідовностей за допомогою замін, приєднань і/або делецій/укорочень або за допомогою введення хімічної модифікації, яка приводить до функціонально еквівалентних молекул. Фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що деякі амінокислоти в послідовності будь-якого білка можуть бути замінені іншими амінокислотами без несприятливого впливу на активність білка. Отже, можуть бути здійснені різні зміни в амінокислотних послідовностях химерних білків згідно з винаходом або в кодуючих послідовностях ДНК без суттєвої втрати їх біологічної активності, функції або застосовності. Похідні, аналоги або мутанти, які виникають внаслідок таких змін, і застосу 29 95436 вання таких похідних входить в об'єм даного винаходу. У конкретному варіанті похідне є функціонально активним, тобто здатним виявляти одну або декілька активностей, зв'язаних з химерними білками згідно з винаходом, наприклад, зв'язування FcRn, інгібування вірусів, гемостаз, продукція червоних кров'яних клітин. Багато аналізів, що дозволяють тестувати активність химерного білка, який містить біологічно активну молекула, відомі в даній галузі. У тому випадку, коли біологічно активна молекула є інгібітором ВІЛ, активність можна тестувати вимірюванням активності оберненої транскриптази, використовуючи відомі способи (дивіться, наприклад, Barre-Sinoussi et al. 1983, Science 220:868; Gallo et al. 1984, Science 224:500). Альтернативно, активність можна виміряти за допомогою вимірювання фузогенної активності (дивіться, 30 наприклад, Nussbaum et al. 1994, J. Virol. 68 (9):5411). У тому випадку, коли біологічною активністю є гемостаз, може бути здійснений аналіз StaCLot FVIIa-rTF, щоб оцінити активність похідних фактора VIIa (Johannessen et al. 2000, Blood Coagulation and Fibrinolysis 11:5159). Замінники амінокислот в послідовності можуть бути вибрані з інших представників класу, до якого відноситься амінокислота (дивіться таблицю 1). Крім того, різні амінокислоти звичайно замінюють нейтральними амінокислотами, наприклад, аланіном, лейцином, ізолейцином, валіном, проліном, фенілаланіном, триптофаном і метіоніном (дивіться, наприклад, MacLennan et al. 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki et al. 1998, Adv. Biophys. 35:1-24). Таблиця 1 Вихідний залишок Ala (A) Arg (R) Asn (N) Asp (D) Cys (C) Gln (Q) Gly (G) His (H) IIe (I) Leu (L) Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser (S) Thr (T) Trp (W) Tyr (Y) Val (V) Зразкові заміни Val, Leu, IIe Lys, GIn, Asn GIn Glu Ser, Ala Asn Pro, Ala Asn, GIn, Lys, Arg Leu, Val, Met, Ala, Phe, норлейцин норлейцин, Не, Val, Met, Ala, Phe Arg, 1,4-діаміномасляна кислота, Gin, AsnI Leu, Phe, IIe Leu, Val, IIe, Ala, Tyr Ala Thr, Ala, Cys Ser Tyr, Phe Trp, Phe, Thr, Ser lIe, Met, Leu, Phe, Ala, норлейцин 2. Біологічно активні молекули Винахід передбачає застосування будь-якої біологічно активної молекули як терапевтичної молекули згідно з винаходом. Біологічно активною молекулою може бути поліпептид. Біологічно активною молекулою може бути одна амінокислота. Біологічно активна молекула може включати в себе модифікований поліпептид. Біологічно активна молекула може включати в себе ліпідну молекулу (наприклад, стероїд або холестерин, жирну кислоту, триацилгліцерин, гліцерофосфоліпід або сфінголіпід). Біологічно активна молекула може включати в себе молекулу цукру (наприклад, глюкозу, сахарозу, манозу). Біологічно активна молекула може включати в себе молекулу нуклеїнової кислоти (наприклад, ДНК, РНК). Біологічно активна молекула може включати в себе малу органічну молекулу або малу неорганічну молекулу. a. Цитокіни і фактори росту В одному варіанті біологічно активною молекулою є фактор росту, гормон або цитокін або їх аналог або фрагмент. Біологічно активною моле Типові заміни Leu Lys GIn Glu Ser Asn Ala Arg Leu IIe Arg Leu Leu Gly Thr Ser Tyr Phe Leu кулою може бути будь-який агент, здатний індукувати зростання і проліферацію клітин. У конкретному варіанті біологічно активною молекулою є будь-який агент, який може індукувати проліферацію еритроцитів. Таким чином, один з прикладів біологічно активної молекули, що пропонується у винаході, є ЕРО. Біологічно активна молекула також може включати, без обмеження, RANTES, МІР1, МІР1, IL-2, IL-3, GM-CSF, гормон росту, фактор некрозу пухлин (наприклад, TNF або ). Біологічно активна молекула може включати інтерферон , одержаний або синтетично, або рекомбінантно, включаючи, без обмеження, будьякий з приблизно двадцяти п'яти структурно споріднених підтипів, як, наприклад, інтерферон-2а, новий комерційно доступний для клінічного застосування (Roferon, Roche) та інтерферон-2b, також схвалений для клінічного застосування (Intron, Schering), а також генетично сконструйовані варіанти різних підтипів, включаючи, але не обмежуючи вказаним, комерційно доступний консенсусний інтерферон  (Infergen, Intermune, 31 розроблений Amgen) і консенсусний інтерферон лейкоцитів людини, дивіться, наприклад, патенти США №№ 4695623, 4897471, інтерферон , епідермальний фактор росту, гонадотропін-рилізинг гормон (GnRH), лейпролід, фолікулостимулюючий гормон, прогестерон, естроген або тестостерон. Список цитокінів і факторів росту, які можуть бути використані в химерному білку згідно з винаходом, описаний раніше (дивіться, наприклад, патенти США №№ 6086875, 6485726, 6030613; WO 03/077834; US2003-0235536A1). b. Противірусні агенти В одному варіанті біологічно активною молекулою є противірусний агент, включаючи його фрагменти і аналоги. Противірусний агент може включати будь-яку молекулу, яка інгібує або запобігає реплікації вірусів, або інгібує або запобігає проникненню вірусу в клітину, або інгібує або запобігає виходу вірусу з клітини. В одному варіанті противірусним агентом є інгібітор злиття. В одному варіанті противірусним агентом є цитокін, який інгібує реплікацію вірусів. В іншому варіанті противірусним агентом є інтерферон . Інгібітором злиття вірусів для застосування в химерному білку може бути будь-яка молекула, яка знижує або запобігає проникненню вірусу через клітинну мембрану клітини-мішені. Інгібітором злиття вірусів може бути будь-яка молекула, яка зменшує або запобігає утворенню синцитіїв щонайменше між двома чутливими клітинами. Інгібітором злиття вірусів може бути будь-яка молекула, яка знижує або запобігає зв'язуванню ліпідної бішарової мембрани еукаріотичної клітини і ліпідного бішару вірусу, що має оболонку. Приклади вірусу, покритого оболонкою, включають, але не обмежують вказаним ВІЛ-1, ВІЛ-2, SIV, вірус грипу, парагрипу, вірус Епштейн-Барра, CMV, вірус простого герпесу 1, вірус простого герпесу 2 і респіраторно-синцитіальний вірус. Інгібітором злиття вірусів може бути будь-яка молекула, яка зменшує або запобігає злиттю вірусів, включаючи, без обмеження, поліпептид, малу органічну молекулу або малу неорганічну молекулу. В одному варіанті інгібітором злиття є поліпептид. В одному варіанті інгібітором злиття вірусів є поліпептид довжиною 3-36 амінокислот. В іншому варіанті інгібітором злиття вірусів є поліпептид довжиною 3-50 амінокислот, 10-65 амінокислот, 10-75 амінокислот. Поліпептид може складатись з амінокислотної послідовності (наприклад, фрагмент gp41), що зустрічається в природі, включаючи її аналоги і мутанти, або поліпептид може складатись з амінокислотної послідовності, що не зустрічається в природі, за умови, що поліпептид виявляє активність інгібітору злиття вірусів. В одному варіанті інгібітором злиття вірусів є поліпептид, ідентифікований як інгібітор злиття вірусів з використанням щонайменше одного комп'ютерного алгоритму, наприклад, ALLMOTI5, 1071784 і PLZIP (дивіться, наприклад, патенти США №№ 6013263, 6015881, 6017536, 6020459, 6060065, 6068973, 6093799 і 6228983). В одному варіанті інгібітором злиття вірусів є інгібітор злиття ВІЛ. В одному варіанті ВІЛ являє собою ВІЛ-1. В іншому варіанті ВІЛ являє собою 95436 32 ВІЛ-2. В одному варіанті інгібітором злиття ВІЛ є поліпептид, що складається з фрагмента білка оболонки gp41 ВІЛ-1. Інгібітор злиття ВІЛ може містити, наприклад, Т20 (SEQ ID NO:1) або його аналог, Т21 (SEQ ID NO:2) або його аналог, Т1249 (SEQ ID NO:3) або його аналог, NCCGgp41 (Louis et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:(31) 29485) або його аналог або 5-helix (Root et al. 2001, Science 291:884) або його аналог. Аналізи, відомі в даній галузі, можна використати для того, щоб тестувати інгібуючу злиття вірусів активність поліпептиду, малої органічної молекули або малої неорганічної молекули. Такі аналізи включають аналіз оберненої транскриптази, аналіз р24 або аналіз утворення синцитіїв (дивіться, наприклад, патент США № 5464933). Список противірусних агентів, які можна використати в химерному білку згідно з винаходом, описаний раніше (дивіться, наприклад, патенти США №№ 6086875, 6485726, 6030613; WO 03/077834; US2003-0235536A1). с. Гемостатичні агенти В одному варіанті біологічно активною молекулою є фактор скипання або інший агент, який стимулює гемостаз, включаючи його фрагменти і аналоги. Фактор скипання крові може включати будь-яку молекулу, яка володіє скипаючою активністю або активує молекулу, що володіє скипаючою активністю. Фактор скипання крові може складатись з поліпептиду. Фактором скипання крові може бути, наприклад, без обмеження, фактор VIII, фактор IX, фактор XI, фактор XII, фібриноген, протромбін, фактор V, фактор VII, фактор X, фактор XIII або фактор фон Віллебранда. В одному варіанті фактором скипання крові є фактор VII або фактор VIla, фактором скипання крові може бути фактор, який бере участь у зовнішньому шляху скипання крові. Фактором скипання крові може бути фактор, який бере участь у внутрішньому шляху скипання крові. Альтернативно, фактором скипання крові може бути фактор, який бере участь як у зовнішньому, так і у внутрішньому шляху. Фактором скипання крові може бути фактор скипання крові людини або фактор скипання крові тварини, яка відрізняється від людини, наприклад, одержаний від приматів, які відрізняється від людини, свині або будь-якого ссавця. Фактором скипання крові може бути химерний фактор скипання крові, наприклад, фактор скипання крові може містити частину фактора скипання крові людини і частину фактора скипання крові свині або частину першого фактора скипання крові тварини, яка відрізняється від людини, і частину другого фактора скипання крові тварини, яка відрізняється від людини. Фактором скипання крові може бути активований фактор скипання крові. Альтернативно, фактором скипання крові може бути неактивна форма фактора скипання крові, наприклад, зимоген. Неактивний фактор скипання крові може зазнавати активації після зв'язування щонайменше з частиною константної ділянки імуноглобуліну. Неактивний фактор скипання крові може бути активований після введення суб'єкту. Альтернативно, неактив 33 ний фактор скипання крові може бути активований перед введенням. У деяких варіантах може бути використана ендопептидаза, наприклад, фермент, що розщеплює спарені основні амінокислоти (PACE), або будьякий представник сімейства PACE, такий як PCSK1-9, включаючи його укорочені варіанти, або його дріжджовий еквівалент Кех2 з S. cerevisiae і укорочені варіанти Ке2 (Ке2 1-675) (дивіться, наприклад, патенти США №№ 5077204, 5162220, 5234830, 5885821, 6329176), щоб відщепити пропептид з утворенням зрілого химерного білка згідно з винаходом (наприклад, фактора VII, фактора IX). d. Інші білкові біологічно активні молекули В одному варіанті біологічно активною молекулою є рецептор або його фрагмент або аналог. Рецептор може бути експресований на поверхні клітини або, альтернативно, рецептор може бути експресований всередині клітини. Рецептор може бути вірусним рецептором, наприклад, CD4, CCR5, CXCR4, CD21, CD46. Біологічно активною молекулою може бути бактеріальний рецептор. Біологічно активною молекулою може бути білок позаклітинного матриксу або його фрагмент або аналог, важливий для колонізації бактерій та інфекції (дивіться, наприклад, патенти США №№ 5648240, 5189015, 5175096) або білок поверхні бактерій, важливий для адгезії та інфекції (дивіться, наприклад, патент США № 5648240). Біологічно активною молекулою може бути рецептор фактора росту, гормону або цитокіну або його фрагмент або аналог, наприклад, рецептор TNF, рецептор еритропоетину, CD25, CD122 або CD132. Список інших білкових молекул, які можна використати в химерному білку згідно з винаходом, описаний раніше (дивіться, наприклад, патенти США №№ 6086875, 6485726, 6030613, WO 03/077834; US2003-0235536A1). e. Нуклеїнові кислоти В одному варіанті біологічно активною молекулою є нуклеїнова кислота, наприклад, ДНК, РНК. В одному конкретному варіанті біологічно активною молекулою є нуклеїнова кислота, яка може бути використана в інтерференції РНК (RNAi). Молекула нуклеїнової кислоти може являти собою як приклад, але не обмежуючи вказаним, антисмислову молекулу або рибозим або аптамер. Молекули антисмислової РНК і ДНК діють, прямо блокуючи трансляцію мРНК за допомогою гібридизації з мРНК-мішенню і запобігаючи трансляції білка. Способи на основі антисмислових послідовностей полягають в конструюванні олігонуклеотидів, які комплементарні мРНК гена-мішені. Антисмислові олігонуклеотиди будуть зв'язуватись з комплементарними мРНК-транскриптами генамішені і запобігати трансляції. Абсолютна комплементарність не потрібна. Послідовність «комплементарна» частині РНК, у значенні, що використовується в даному описі, означає послідовність, що володіє достатньою комплементарністю, щоб бути здатною гібридизуватись з РНК, утворюючи стабільний дуплекс; таким чином у випадку двониткових антисмислових 95436 34 нуклеїнових кислот може бути тестована одна нитка ДНК-дуплексу або може бути досліджене утворення триплексу. Здатність гібридизуватись буде залежати як від міри комплементарності, так і від довжини антисмислової нуклеїнової кислоти. Загалом, чим довше нуклеїнова кислота, яка гібридизується, тим більше основ, що помилково паруються з РНК, вона може містити і все ще утворювати стабільний дуплекс (або триплекс, в залежності від обставин). Фахівець в даній галузі може з'ясувати прийнятну міру помилкового спаровування, використовуючи стандартні способи визначення точки плавлення гібридизованого комплексу. Антисмислові нуклеїнові кислоти повинні мати щонайменше шість нуклеотидів в довжину і переважно є олігонуклеотидами довжиною в межах від 6 до приблизно 50 нуклеотидів. У конкретних аспектах олігонуклеотид має щонайменше 10 нуклеотидів, щонайменше 17 нуклеотидів, щонайменше 25 нуклеотидів або щонайменше 50 нуклеотидів. Олігонуклеотиди можуть бути ДНК або РНК або їх химерними сумішами або похідними або модифікованими варіантами, однонитковими або двонитковими. Олігонуклеотид може бути модифікований по залишку основи, залишку цукру або фосфатному кістяку, наприклад, щоб підвищити стабільність молекули, гібридизацію і т.д. Олігонуклеотид може включати в себе інші бічні групи, такі як поліпептиди (наприклад, для націлювання на рецептори клітин-хазяїнів in vivo), або агенти, які сприяють транспорту через клітинну мембрану (дивіться, наприклад, Letsinger et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553; Lemaitre et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648; WO 88/09810), або гематоенцефалічний бар'єр (дивіться, наприклад, WO 89/10134), агенти для розщеплення, що запускається гібридизацією (дивіться, наприклад, Krol et al. 1988, BioTechniques 6:958) або інтеркалюючі агенти (дивіться, наприклад, Zon 1988, Pharm. Res. 5:539). З цією метою олігонуклеотид може бути кон'югований з іншою молекулою, наприклад, поліпептидом, агентом для перехресного зшивання, що запускається гібридизацією, транспортуючим агентом або агентом розщеплення, що запускається гібридизацією. Молекули рибозимів, сконструйовані для каталітичного розщеплення транскриптів мРНК генамішені, також можна використати для того, щоб запобігти трансляції мРНК гена-мішені і, отже, експресії продукту гена-мішені (дивіться, наприклад, WO 90/11364; Sarver et al. 1990, Science 247, 12221225). Рибозими є молекулами ферментної РНК, здатними каталізувати специфічне розщеплення РНК (дивіться Rossi 1994, Current Biology 4:469). Механізм дії рибозимів полягає у специфічній для послідовності гібридизації молекули рибозиму з комплементарною РНК-мішенню з подальшою подією ендонуклеолітичного розщеплення. До складу молекул рибозимів можуть входити одна або декілька послідовностей, комплементарних мРНК гена-мішені, і повинна входити добре відома каталітична послідовність, відповідальна за роз 35 щеплення мРНК. Відносно вказаної послідовності дивіться, наприклад, патент США № 5093246. В одному варіанті рибозими, які розщеплюють мРНК в сайт-специфічно упізнаваних послідовностях, можна використати для руйнування мРНК генів-мішеней. В іншому варіанті передбачається застосування рибозимів типу «головки молота». Рибозими типу «головки молота» розщеплюють мРНК в положеннях, продиктованих фланкуючими ділянками, які утворюють комплементарні пари основ з мРНК-мішенню. Єдиною вимогою є, щоб мРНК-мішень мала наступну послідовність з двох основ: 5'-UG-3'. Конструювання і одержання рибозимів типу «головки молота» добре відоме в даній галузі і описане більш повно в Myers 1995, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York, і в Haseloff and Gerlach 1988, Nature, 334:585. f. Малі молекули Винахід також передбачає застосування будьякої терапевтичної малої молекули або лікарського засобу як біологічно активної молекули в химерному білку згідно з винаходом. Список малих молекула і лікарських засобів, які можна використати в химерному білку згідно з винаходом, описаний раніше (дивіться, наприклад, патенти США №№ 6086875, 6485726, 6030613, WO 03/077834, US2003-0235536А1). 2. Імуноглобуліни Химерні білки згідно з винаходом містять щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну. Імуноглобуліни складаються з чотирьох білкових ланцюгів, які зв'язані ковалентно - двох важких ланцюгів і двох легких ланцюгів. Кожний ланцюг, крім того, складається з однієї варіабельної ділянки і однієї константної ділянки. В залежності від ізотипу імуноглобуліну константна ділянка важкого ланцюга складається з 3 або 4 доменів константної ділянки (наприклад, CH1, СН2, CH3, СН4). Деякі ізотипи, крім того, містять шарнірну ділянку. Частина константної ділянки імуноглобуліну може бути одержана від будь-якого ссавця. Частина константної ділянки імуноглобуліну може входити в частину константної ділянки імуноглобуліну людини, константної ділянки імуноглобуліну приматів, які відрізняється від людини, константної ділянки бичачого імуноглобуліну, константної ділянки імуноглобуліну свині, константної ділянки імуноглобуліну миші, константної ділянки імуноглобуліну вівці або константної ділянки імуноглобуліну щура. Частина константної ділянки імуноглобуліну може бути одержана рекомбінантно або шляхом синтезу. Імуноглобулін може бути виділений з бібліотеки кДНК. Частина константної ділянки імуноглобуліну може бути виділена з фагової бібліотеки (дивіться, наприклад, McCafferty et al. 1990, Nature 348:552, Rang et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363; EP 0589877 B1). Частина константної ділянки імуноглобуліну може бути одержана перетасовуванням генів з відомими послідовностями (Mark et al. 1992, BiolTechnol. 10:779). Частина константної ділянки імуноглобуліну може бути ви 95436 36 ділена за допомогою рекомбінації in vivo (Waterhouse et al. 1993, Nucl. Acid Res. 21:2265). Імуноглобулін може бути гуманізованим імуноглобуліном (патент США № 5585089, Jones et al. 1986, Nature 332:323). Частина константної ділянки імуноглобуліну може включати в себе частину IgG, IgA, IgM, IgD або IgE. В одному варіанті імуноглобулін є IgG. В іншому варіанті імуноглобулін є IgG1. В іншому варіанті імуноглобулін є IgG2. Частина константної ділянки імуноглобуліну може включати в себе повну константну ділянку важкого ланцюга або її фрагмент або аналог. В одному варіанті константна ділянка важкого ланцюга може містити домен CH1, домен СН2, домен CH3 і/або шарнірну ділянку. В іншому варіанті константна ділянка важкого ланцюга може містити домен CH1, домен СН2, домен CH3 і/або домен СН4. Частина константної ділянки імуноглобуліну може містити фрагмент Fc. Фрагмент Fc може складатись з доменів СН2 і CH3 імуноглобуліну і шарнірної ділянки імуноглобуліну. Фрагмент Fc може являти собою фрагмент Fc IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. В одному конкретному варіанті частина константної ділянки імуноглобуліну являє собою фрагмент Fc IgG1. В іншому варіанті частина константної ділянки імуноглобуліну являє собою фрагмент Fc IgG2. В іншому варіанті частину константної ділянки імуноглобуліну являє собою зв'язувальний партнер неонатального рецептора Fc (FcRn). FcRnзв'язувальним партнером є будь-яка молекула, яка може бути специфічно зв'язана рецептором FcRn з подальшим активним транспортом рецептором FcRn FcRn-зв'язувального партнера. Специфічно зв'язаний відноситься до двох молекул, які утворюють комплекс, який є відносно стабільним у фізіологічних умовах. Специфічне зв'язування характеризується високою афінністю і від низької до помірної місткістю, що відрізняються від неспецифічного зв'язування, яке звичайно має низьку афінність при місткості від помірної до високої. Звичайно зв'язування вважають специфічним, ко6 -1 ли константа афінності КА вище 10 М або біль8 -1 ше, переважно вище 10 М . За необхідності неспецифічне зв'язування може бути зменшене без істотного впливу на специфічне зв'язування варіюванням умов зв'язування. Відповідні умови зв'язування, такі як концентрація молекул, іонна сила розчину, температура, час, дозволений для зв'язування, концентрація блокуючого агента (наприклад, сироваткового альбуміну, казеїну молока) і т.д., можуть бути оптимізовані фахівцем в даній галузі з використанням звичайних способів. Рецептор FcRn був виділений з декількох видів ссавців, включаючи людину. Послідовності FcRn людини, FcRn мавп, FcRn щурів і FcRn мишей відомі (Story et al. 1994, J. Exp. Med. 180:2377). Рецептор FcRn зв'язує IgG (але не інші класи імуноглобулінів, такі як IgA, IgM, IgD і IgE) при відносно низькому рН, активно транспортує IgG трансклітинним шляхом в просвіт в напрямі серозної оболонки і потім вивільняє IgG при відносно більш високому рН, виявленому в інтерстиціа 37 льних рідинах. Він експресується в епітеліальній тканині дорослого організму (патенти США №№ 6485726, 6030613, 6086875, WO 03/077834; US2003-0235536А1), включаючи епітелій легень і кишечнику (Israel et al. 1997, Immunology 92:69), епітелій проксимальних ниркових канальців (Kobayashi et al. 2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358), а також епітелій носа, вагінальні поверхні і поверхні жовчного дерева. FcRn-зв'язувальні партнери згідно з даним винаходом охоплюють будь-яку молекулу, яка може бути специфічно зв'язана рецептором FcRn, включаючи цілий IgG, Fc-фрагмент IgG та інші фрагменти, які містять повну ділянку зв'язування рецептора FcRn. Ділянка Fc-частини IgG, яка зв'язується з рецептором FcRn, була описана рентгенівською кристалографією (Burmeister et al. 1994, Nature 372:379). Основна ділянка контакту Fc з FcRn розташована поблизу з'єднання доменів СН2 і CH3. Всі контакти Fc-FcRn знаходяться в одному важкому ланцюгу Ig. FcRn-зв'язувальні партнери включають повний IgG, Fc-фрагмент IgG та інші фрагменти IgG, які містять повну ділянку зв'язування FcRn. Основні місця контакту включають в себе амінокислотні залишки 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 і 314 домену СН2 і амінокислотні залишки 385-387, 428 і 433-436 домену CH3. Всі посилання, зроблені на нумерацію амінокислот імуноглобулінів або фрагментів імуноглобулінів або ділянок, засновані на Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda, MD. Fc-ділянка IgG може бути модифікована відповідно до добре відомих способів, таких як сайтнаправлений мутагенез і тому подібні, щоб одержати модифікований IgG або його Fc-фрагменти або частини, які будуть зв'язуватись рецептором FcRn. Такі модифікації включають модифікації, віддалені від сайтів контакту FcRn, а також модифікації в сайтах контакту, які зберігають або навіть посилюють зв'язування з FcRn. Наприклад, наступні одиночні залишки амінокислот в Fc(Fcyl) IgG1 людини можуть бути замінені без істотної втрати афінності зв'язування Fc у відношенні FcRn: Р238А, S239A, K246А, K248А, D249A, М252А, Т256А, Е258А, Т260А, D265A, S267A, Н268А, Е269А, D270A, Е272А, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, Е283А, Н285А, N286A, Т289А, K290А, R292A, Е293А, Е294А, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, Т307А, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317А, Е318А, K320А, K322А, S324A, K326А, A327Q, Р329А, A330Q, Р331А, Е333А, K334А, Т335А, S337A, K338А, K340А, Q342A, R344A, Е345А, Q347A, R355A, Е356А, М358А, Т359А, K360А, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, Е380А, Е382А, S383A, N384A, Q386A, Е388А, N389A, N390A, Y391F, K392А, L398A, S400A, D401A, D413A, K414А, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, Е430А, N434A, Т437А, Q438A, K439А, S440A, S444A і K447А, де, наприклад, Р238А означає пролін дикого типу, що замінюється аланіном в положенні номер 238. Як приклад один конкретний варіант включає мутацію N297A, що видаляє високо консервативний сайт 95436 38 N-глікозилування. Крім аланіну, інші амінокислоти можуть бути використані для заміни амінокислот дикого типу у вказаних вище положеннях. Мутації можуть бути окремо введені у Fc з утворенням більше ста FcRn-зв'язувальних партнерів, які відрізняються від нативного Fc. Крім того, комбінації з двох, трьох або більше вказаних окремих мутацій можуть бути введені разом, приводячи до утворення ще сотень FcRn-зв'язувальних партнерів. Крім того, один з FcRn-зв'язувальних партнерів в гібриді мономер-димер може бути мутований, а інший FcRn-зв'язувальний партнер взагалі не мутований, або вони можуть бути мутовані обидва, але різними мутаціями. Будь-яку з наведених в даному описі мутацій, включаючи N297A, можна використати для модифікації Fc, незалежно від біологічно активної молекули (наприклад, ЕРО, IFN, фактор IX, Т20). Деякі з вказаних вище мутацій можуть додавати нової функціональності FcRn-зв'язувальному партнеру. Наприклад, один варіант включає N297A, що видаляє високо консервативний сайт N-глікозилування. Вплив мутації полягає у зменшенні імуногенності і при цьому збільшенні часу напівжиття в циркуляції FcRn-зв' язу вального партнера, і у наданні FcRn-зв'язу вальному партнеру нездатності зв'язуватись з FcRI, FcRIIA, FcRIIB і FcRIIIA, не піддаючи ризику афінність у відношенні FcRn (Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Як наступний приклад нової функціональності, виникаючої внаслідок мутацій, описаних вище, може бути збільшена афінність у відношенні FcRn, в деяких випадках вище ніж афінність дикого типу. Вказана підвищена афінність може відображати підвищену швидкість утворення комплексу, знижену швидкість розпаду комплексу або і підвищену швидкість утворення комплексу і знижену швидкість розпаду комплексу разом. Мутації, які можливо надають підвищену афінність у відношенні FcRn, включають Т256А, Т307А, Е380А і N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591). Крім того, щонайменше три рецептори Fc гамма людини, мабуть, впізнають сайт зв'язування на IgG в ділянці нижче шарніра, звичайно амінокислоти 234-237. Отже, інший приклад нової функціональності і можливої зниженої імуногенності може виникати внаслідок мутацій даної ділянки, наприклад, при заміні амінокислот 233-236 IgG1 людини «ELLG» на відповідну послідовність з IgG2 «PVA» (з делецією однієї амінокислоти). Показано, що FcRI, FcRII і FcRIII, які опосередковують різні ефекторні функції, не будуть зв'язуватись з IgG1, коли введені такі мутації. Ward і Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 і Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613. В одному варіанті FcRn-зв'язу вальним партнером є поліпептид, що містить послідовність PKNSSMISNTP (SEQ ID NO:26) і необов'язково, крім того, що містить послідовність, вибрану з HQSLGTQ (SEQ ID NO:27), HQNLSDGK (SEQ ID NO:28), HQNISDGK (SEQ ID NO:29) або VISSHLGQ (SEQ ID NO:30) (патент США № 5739277). 39 Два рецептори FcRn можуть зв'язувати одну молекулу Fc. Кристалографічні дані свідчать, що кожна молекула FcRn зв'язує один поліпептид гомодимеру Fc. В одному варіанті зв'язування FcRnзв'язувального партнера, наприклад, Fcфрагмента IgG, з біологічно активною молекулою забезпечує засоби доставки біологічно активної молекули пероральним, букальним, під'язиковим, ректальним, вагінальним шляхом, у вигляді аерозолю, що вводиться назально, або через легеневий шлях або очним шляхом. В іншому варіанті химерний білок може бути введений інвазивно, наприклад, підшкірно, внутрішньовенно. Фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що частини константної ділянки імуноглобуліну для застосування в химерному білку згідно з винаходом можуть включати його мутанти або аналоги, або можуть включати хімічно модифіковані константні ділянки імуноглобуліну (наприклад, пегільовані) або її фрагменти (дивіться, наприклад, Aslam and Dent 1998, Bioconjugation: Protein Coupling Technigues For the Biomedical Sciences Macmilan Reference, London). В одному випадку мутант може забезпечувати підвищене зв'язування FcRnзв'язувального партнера по відношенню до FcRn. Також для застосування в химерному білку згідно з винаходом пропонуються пептидоміметики щонайменше частини константної ділянки імуноглобуліну, наприклад, пептидоміметик Fc-фрагмента або пептидоміметик FcRn-зв'язувального партнера. В одному варіанті пептидоміметик ідентифікують, використовуючи фаговий дисплей, або за допомогою скринінгу хімічної бібліотеки (дивіться, наприклад, McCafferty et al. 1990, Nature 348:552, Kang et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363; ЕРО 589 877B1). 3. Необов'язкові лінкери Химерний білок згідно з винаходом необов'язково може містити щонайменше одну лінкерну молекулу. Лінкер може складатись з будь-якої органічної молекули. В одному варіанті лінкер являє собою поліетиленгліколь (ПЕГ). В іншому варіанті лінкер складається з амінокислот. Лінкер може містити 1-5 амінокислот, 1-10 амінокислот, 1-20 амінокислот, 10-50 амінокислот, 50-100 амінокислот, 100-200 амінокислот. В одному варіанті лінкер являє собою восьмиамінокислотний лінкер EFAGAAAV (SEQ ID NO:31). Будь-який з лінкерів, наведених в даному описі, може бути використаний в химерному білку згідно з винаходом, наприклад, гібрид мономер-димер, що містить EFAGAAAV, незалежно від біологічно активної молекули (наприклад, ЕРО, IFN, фактор IX). Лінкер може містити послідовність Gn. Лінкер може містити послідовність (GA)n (SEQ ID NO:32). Лінкер може містити послідовність (GGS)n (SEQ ID NO:33). Лінкер може містити послідовність (GGS)n(GGGGS)n (SEQ ID NO:34). У вказаних випадках n може бути цілим числом від 1 до 10, тобто 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Приклади лінкерів включають, але не обмежені вказаним, GGG (SEQ ID NO:35), SGGSGGS (SEQ ID NO:36), GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID NO:37), GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:38), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO:39). Лін 95436 40 кер не виключає або не зменшує біологічну активність химерного білка. Необов'язково лінкер посилює біологічну активність химерного білка, наприклад, додатково зменшуючи вплив стеричних перешкод і роблячи біологічно активну молекулу більш доступною для сайту мішені, який зв'язує її. В одному конкретному варіанті лінкер для інтерферону  має довжину 15-25 амінокислот. В іншому конкретному варіанті лінкер для інтерферону  має довжину 15-20 амінокислот. В іншому конкретному варіанті лінкер для інтерферону  має довжину 10-25 амінокислот. В іншому конкретному варіанті лінкер для інтерферону  має довжину 15 амінокислот. В одному варіанті лінкер для інтерферону  являє собою (GGGGS)n (SEQ ID NO:40), де G означає гліцин, S означає серин і n є цілим числом від 1 до 10. У конкретному варіанті n дорівнює 3. Лінкер також може включати в себе залишок, здатний розщеплюватись або хімічно (наприклад, гідроліз ефірного зв'язку), ферментативно (наприклад, включення послідовності розщеплення протеазою) або фотолітично (наприклад, хромофор, такий як 3-аміно-3-(2-нітрофеніл)пропіонова кислота (ΑΝΡ)), для того, щоб вивільняти біологічно активну молекулу з Fc-білка. 4. Димеризація химерних білків з використанням специфічних зв'язувальних партнерів В одному варіанті химерний білок згідно з винаходом містить перший поліпептидний ланцюг, що містить щонайменше перший домен, при цьому вказаний перший домен має щонайменше один специфічний зв'язувальний партнер, і другий поліпептидний ланцюг, що містить щонайменше другий домен, де вказаний другий домен є специфічним зв'язувальним партнером вказаного першого домену. Таким чином, химерний білок містить поліпептид, здатний димеризуватись з іншим поліпептидом внаслідок взаємодії першого домену і другого домену. Способи димеризації антитіл з використанням гетерологічних доменів відомі в даній галузі (патенти США №№ 5807706 і 5910573; Kostelny et al. 1992, J. Immunol. 148 (5): 1547). Димеризація може відбуватись внаслідок утворення ковалентного зв'язку або, альтернативно, нековалентного зв'язку, наприклад, гідрофобної взаємодії, сил Ван-дер-Ваальса, взаємного розташування амфіфільних пептидів, такого як, без обмеження, альфа-спіралі, взаємодії зарядів амінокислот, які несуть протилежні заряди, таких як, без обмеження, лізин і аспарагінова кислота, аргінін і глутамінова кислота. В одному варіанті домен являє собою спіральний мотив, що містить спіраль, поворот та іншу спіраль. В іншому варіанті домен є лейциновим зипером, що містить пептид, який має декілька амінокислот, що повторюються, в якому кожна сьома амінокислота є залишком лейцину. В одному варіанті специфічним зв'язувальним партнером є fos/jun (дивіться Branden et al. 1991, Introduction To Protein Structure, Garland Publishing, New York). В іншому варіанті зв'язування опосередковане хімічним зв'язуванням (дивіться, наприклад, Brennan et al. 1985, Science 229:81). В даному варіанті інтактні імуноглобуліни або химерні білки, 41 що складаються щонайменше з частини константної ділянки імуноглобуліну, розщеплюють, щоб створити фрагменти важкого ланцюга. Вказані фрагменти відновлюють у присутності агента для утворення комплексів дитіолів арсеніту натрію, щоб стабілізувати сусідні дитіоли і запобігти утворенню міжмолекулярних дисульфідів. Створені фрагменти потім перетворюють в похідні тіонітробензоату (TNB). Одне з похідних TNB потім знов перетворюють в тіол фрагмента важкого ланцюга відновленням меркаптоетиламіном і потім змішують з еквімолярною кількістю іншого похідного TNB з утворенням химерного димеру. D. Нуклеїнові кислоти Винахід відноситься до першої конструкції нуклеїнової кислоти і другої конструкції нуклеїнової кислоти, кожна з яких містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує щонайменше частину химерного білка згідно з винаходом. В одному варіанті перша конструкція нуклеїнової кислоти містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує частину константної ділянки імуноглобуліну, оперативно зв'язану з другою послідовністю ДНК, що кодує біологічно активну молекулу, і вказана друга конструкція ДНК містить послідовність ДНК, що кодує константну ділянку імуноглобуліну, без другої послідовності ДНК, що кодує біологічно активну молекулу. Біологічно активна молекула може, наприклад, включати, але не як обмеження, інгібітор злиття, вірусів, фактор скипання крові, фактор росту або гормон або рецептор, або аналог або фрагмент будь-якого з вказаних вище. Послідовності нуклеїнових кислот також можуть включати в себе додаткові послідовності або елементи, відомі в даній галузі (наприклад, промотори, енхансери, полі Αпослідовності, афінні мітки). В одному варіанті послідовність нуклеїнової кислоти другої конструкції необов'язково може включати в себе послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує лінкер, поміщений між послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує біологічно активну молекулу і частину константної ділянки імуноглобуліну. Послідовність нуклеїнової кислоти другої конструкції ДНК необов'язково може включати в себе лінкерну послідовність, поміщену перед або після послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує біологічно активну молекулу і/або частину константної ділянки імуноглобуліну. В одному варіанті конструкція нуклеїнової кислоти складається з ДНК. В іншому варіанті конструкція нуклеїнової кислоти складається з РНК. Конструкція нуклеїнової кислоти може являти собою вектор, наприклад, вірусний вектор або плазміду. Приклади вірусних векторів включають, але не обмежені вказаним, аденовірусний вектор, вектор на основі аденоасоційованого вірусу або вектор на основі вірусу лейкозу мишей. Приклади плазмід включають, але не обмежені вказаним, pUC, pGEM і pGEX. В одному варіанті конструкція нуклеїнової кислоти містить послідовність нуклеїнової кислоти, показану на Фіг. 3a (SEQ ID NO:7). В одному варіанті конструкція нуклеїнової кислоти містить послідовність нуклеїнової кислоти, показану на Фіг. 3b (SEQ ID NO:9). В одному варіанті конструкція нук 95436 42 леїнової кислоти містить послідовність нуклеїнової кислоти, показану на Фіг. 3с (SEQ ID NO:11). В одному варіанті конструкція нуклеїнової кислоти містить послідовність нуклеїнової кислоти, показану на Фіг. 3d (SEQ ID NO:13). В одному варіанті конструкція нуклеїнової кислоти містить послідовність нуклеїнової кислоти, показану на Фіг. 3е (SEQ ID NO:15). В одному варіанті конструкція нуклеїнової кислоти містить послідовність нуклеїнової кислоти, показану на Фіг. 3f (SEQ ID NO:17). В одному варіанті конструкція нуклеїнової кислоти містить послідовність нуклеїнової кислоти, показану на Фіг. 3g (SEQ ID NO:19). В одному варіанті конструкція нуклеїнової кислоти містить послідовність нуклеїнової кислоти, показану на Фіг. 3h (SEQ ID NO:21). В одному варіанті конструкція нуклеїнової кислоти містить послідовність нуклеїнової кислоти, показану на Фіг. 3і (SEQ ID NO:23). В одному варіанті конструкція нуклеїнової кислоти містить послідовність нуклеїнової кислоти, показану на Фіг. 3j (SEQ ID NO:25). В одному варіанті конструкція нуклеїнової кислоти містить послідовність нуклеїнової кислоти, показану на Фіг. 17а (SEQ ID NO:27). Внаслідок відомої виродженості генетичного коду, в якому більше ніж один кодон може кодувати одну і ту ж амінокислоту, послідовність ДНК може змінюватись у порівнянні з послідовностями, показаними в SEQ ID NO:7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 або 27, але все ще кодувати поліпептид, що має відповідну амінокислотну послідовність SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 або 26, відповідно. Такі варіанти послідовності ДНК можуть виникати внаслідок мовчазних мутацій (наприклад, що відбуваються під час ПЛРампліфікації) або можуть бути продуктом навмисного мутагенезу нативної послідовності. Таким чином винахід відноситься до ізольованих послідовностей ДНК, що кодують поліпептиди згідно з винаходом, вибраних з: (а) ДНК, що містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 або 27; (b) ДНК, що кодує поліпептиди SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 або 26; (с) ДНК, здатної гібридизуватись з ДНК за (а) або (b) в умовах помірної жорсткості, і яка кодує поліпептиди згідно з винаходом; (d) ДНК, здатна гібридизуватись з ДНК за (а) або (b) в умовах високої жорсткості і яка кодує поліпептиди згідно з винаходом, і (e) ДНК, яка є виродженою внаслідок генетичного коду у порівнянні з ДНК, визначеною в (а), (b), (с) або (d), і яка кодує поліпептиди згідно з винаходом. Звичайно, поліпептиди, що кодуються такими послідовностями ДНК, входять в об'єм винаходу. В іншому варіанті молекули нуклеїнової кислоти, що містять послідовність, яка кодує химерний білок згідно з винаходом, також можуть містити нуклеотидні послідовності, які щонайменше на 80% ідентичні нативній послідовності. Також передбачаються варіанти, в яких молекули нуклеїнової кислоти, що містять послідовність, яка кодує химерний білок згідно з винаходом, містять послідовність, яка щонайменше на 90% ідентична, щонайменше на 95% ідентична, щонайменше на 98% ідентична, щонайменше на 99% ідентична або 43 щонайменше на 99,9% ідентична нативній послідовності. Нативна послідовність може включати будь-яку послідовність ДНК, не змінену штучно людиною. Процент ідентичності можнавизначити візуальним переглядом і математичним розрахунком. Альтернативно, процент ідентичності двох послідовностей нуклеїнової кислоти можна визначити порівнянням інформації про послідовність з використанням комп'ютерної програми GAP, версія 6.0, описаної Devereux et al. 1984, Nucl. Acids Res. 12:387, і доступної з University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Переважні параметри, що використовуються за умовчанням, у випадку програми GAP включають: (1) матрицю унарного порівняння (що містить значення 1 для ідентичності і 0 для неідентичності) нуклеотидів, і матрицю зважуючого порівняння Gribskov and Burgess 1986, Nucl. Acids Res. 14:6745, які описані Schwartz and Dayhoff, eds. 1979, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358; (2) штраф 3,0 за кожний пропуск і додатковий штраф 0,10 за кожний символ в кожному пропуску; і (3) відсутність штрафу за кінцеві пропуски. Також можна використати інші програми, що використовуються фахівцем в галузі порівняння послідовностей. Е. Синтез химерних білків Химерні білки, що містять щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну і біологічно активну молекулу, можуть бути синтезовані з використанням способів, відомих в даній галузі. Наприклад, химерні білки згідно з винаходом можуть бути синтезовані рекомбінантно в клітинах (дивіться, наприклад, Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. і Ausubel et al. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.). Альтернативно, химерні білки згідно з винаходом можуть бути синтезовані з використанням відомих способів синтезу, таких як твердофазний синтез. Способи синтезу добре відомі в даній галузі (дивіться, наприклад, Merrifield, 1973, Chemical Polypeptides, (Katsoyannis and Panayotis eds.) pp. 335-61; Merrifield 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149; Davis et al. 1985, Biochem. Intl. 10:394; Finn et al. 1976, The Proteins (3d ed.) 2:105; Erikson et al. 1976, The Proteins (3d ed.) 2:257; патент США № 3941763. Альтернативно, химерні білки згідно з винаходом можуть бути синтезовані з використанням комбінації способів на основі рекомбінації і способів синтезу. У деяких застосуваннях може бути корисним застосування або способу на основі рекомбінації, або комбінації способу на основі рекомбінації і способу синтезу. Нуклеїнові кислоти, що кодують біологічно активну молекулу, можуть бути легко синтезовані з використанням способів рекомбінації, добре відомих в даній галузі. Альтернативно, пептиди як такі можуть бути синтезовані хімічним шляхом. Нуклеїнові кислоти згідно з винаходом можуть бути синтезовані стандартними способами, відомими в даній галузі, наприклад, за допомогою застосування автоматизованого синтезатора ДНК (такого як комерційно доступні з Biosearch, Applied 95436 44 Biosystems, і т.д.). Як приклади фосфоротіоатні олігонуклеотиди можуть бути синтезовані способом Stein et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16:3209, метилфосфонатні олігонуклеотиди можуть бути одержані внаслідок застосування підкладок з полімерного скла з розміром пор, що контролюється, як описано в Sarin et al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7448. Додаткові способи синтезу нуклеїнових кислот відомі в даній галузі (дивіться, наприклад, патенти США №№ 6015881, 6281331, 6469136). Послідовності ДНК, що кодують константні ділянки імуноглобуліну або його фрагменти, можуть бути клоновані з різних бібліотек геномної або кДНК, відомих в даній галузі. Способи виділення таких послідовностей ДНК з використанням основаних на зондах способів є звичайними методиками і добре відомі фахівцям в даній галузі. Зонди для виділення таких послідовностей ДНК можуть бути основані на опублікованих послідовностях ДНК (дивіться, наприклад, Hieter et al. 1980, Cell 22:197-207). Можна використати спосіб полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), описаний Mullis et al. (патент США № 4683195) і Mullis (патент США № 4683202). Вибір бібліотеки і підбір зондів для виділення таких послідовностей ДНК здійснюється фахівцем в даній галузі. Альтернативно, послідовності ДНК, що кодують імуноглобуліни або їх фрагменти, можна одержати з векторів, які як відомо в даній галузі, містять імуноглобуліни або їх фрагменти. Для рекомбінантного одержання першу полінуклеотидну послідовність, що кодує частину химерного білка згідно з винаходом (наприклад, частину константної ділянки імуноглобуліну), і другу полінуклеотидну послідовність, що кодує частину химерного білка згідно з винаходом (наприклад, частину константної ділянки імуноглобуліну і біологічно активну молекулу), вбудовують у відповідні носії для експресії, наприклад, вектори, які містять необхідні елементи для транскрипції і трансляції вбудованої кодуючої послідовності, або у випадку вектора на основі РНК-вірусу необхідні елементи для реплікації і трансляції. Нуклеїнові кислоти, що кодують химерний білок, вбудовують у вектор в правильній рамці зчитування. Експресуючими носіями потім трансфікують або котрансфікують відповідну клітину-мішень, яка буде експресувати поліпептиди. Способи трансфекції, відомі в даній галузі, включають, але не обмежені вказаним, осадження фосфатом кальцію (Wigler et al. 1978, Cell 14:725) і електропорацію (Neumann et al. 1982, EMBO, J. 1:841), і реагенти на основі ліпосом. Може бути використана множина систем хазяїн-експресуючий вектор, щоб експресувати химерні білки, вказані в даному описі, включаючи як прокаріотичні, так і еукаріотичні клітини. Системи включають, але не обмежені вказаним, мікроорганізми, такі як бактерії (наприклад, Е. coli), трансформовані експресуючими векторами на основі рекомбінантної ДНК бактеріофага або плазмідної ДНК, що містять відповідну кодуючу послідовність; дріжджі або нитчасті гриби, трансформовані рекомбінантними експресуючими векторами дріжджів або грибів, що містять відповідну 45 кодуючу послідовність; системи клітин комах, інфікованих рекомбінантними вірусними експресуючими векторами (наприклад, бакуловірусом), що містять відповідну кодуючу послідовність; системи клітин рослин, інфікованих рекомбінантними вірусними експресуючими векторами (наприклад, на основі вірусу мозаїки цвітної капусти або вірусу мозаїки тютюну) або трансформованими рекомбінантними плазмідними експресуючими векторами (наприклад, Ті-плазмідою), що містять відповідну кодуючу послідовність; або системи клітин тварин, включаючи клітини ссавців (наприклад, клітини СНО, Cos, HeLa). У тому випадку, коли химерний білок згідно з винаходом синтезують рекомбінантно в прокаріотичній клітині, може бути бажаним укладання химерного білка. Химерний білок, одержаний таким способом, може бути підданий рефолдингу до біологічно активної конформації з використанням умов, відомих в даній галузі, наприклад, денатурацією у відновлювальних умовах і потім повільним діалізом в PBS. В залежності від системи експресії, що використовується, експресований химерний білок потім виділяють способами, добре розробленими в даній галузі (наприклад, афінною хроматографією, ексклюзійною хроматографією за розміром, іонообмінною хроматографією). Експресуючі вектори можуть кодувати мітки, які дають можливість легко очищати рекомбінантно одержаний химерний білок. Приклади включають, але не обмежені вказаним, вектор pUR278 (Ruther et al. 1983, EMBO J. 2:1791), в якому послідовності, що кодують химерний білок, вказаний в даному описі, можуть бути ліговані у вектор в рамці з ділянкою, що кодує lac z, так що виходить гібридний білок; вектори pGEX можуть бути використані для експресії химерних білків згідно з винаходом з міткою у вигляді глутатіон-8трансферази (GST). Вказані білки звичайно розчинні і можуть бути легко очищені з клітин за допомогою адсорбції на глутатіон-агарозних кульках з подальшим елююванням у присутності вільного глутатіону. Вектори містять сайти розщеплення (тромбін або протеаза фактора Ха або протеаза PreScission (Pharmacia, Peapack, N.J.) для простого видалення мітки після очищення. Щоб підвищити ефективність одержання, можуть бути сконструйовані полінуклеотиди, що кодують множинні одиниці химерного білка згідно з винаходом, розділені сайтами розщеплення ферментами. Одержаний в результаті поліпептид може бути розщеплений (наприклад, обробкою відповідним ферментом), щоб одержати поліпептидні одиниці. Це може підвищити вихід поліпептидів, керований одним промотором. При використанні у відповідних вірусних системах експресії керування трансляцією кожного поліпептиду, що кодується мРНК, здійснюється всередині транскрипту, наприклад, за допомогою внутрішнього сайту приєднання рибосоми, IRES. Таким чином поліцистронна конструкція направляє транскрипцію однієї великої поліцистронної мРНК, яка в свою чергу направляє трансляцію множини окремих поліпептидів. Такий підхід виключає продукування і фер 95436 46 ментативний процесинг полібілків і може значно збільшити вихід поліпептиду під керуванням одного промотору. Вектори, що використовуються для трансформації, звичайно будуть містити селектований маркер, який використовується для того, щоб ідентифікувати трансформанти. У бактеріальних системах він може включати ген резистентності до антибіотика, такого як ампіцилін або канаміцин. Селектовані маркери для застосування в клітинах ссавців, що культивуються, включають гени, які надають резистентності до лікарських засобів, таких як неоміцин, гігроміцин і метотрексат. Селектований маркер може бути ампліфікованим селектованим маркером. Одним з ампліфікованих селектованих маркерів є ген DHFR. Іншим ампліфікованим маркером є кДНК DHFR (Simonsen and Levinson 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2495). Огляд селектованих маркерів наведений Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA) і вибір селектованих маркерів може здійснити фахівець в даній галузі. Селектовані маркери можуть бути введені в клітину в окремій плазміді в один і той же час з геном, який представляє інтерес, або вони можуть бути введені в одній і тій же плазміді. При введенні в одній і тій же плазміді селектований маркер і ген, який представляє інтерес, можуть бути під контролем різних промоторів або одного і того ж промотору, у випадку останнього розташування продукується дицистронний месенджер. Конструкції такого типу відомі в даній галузі (наприклад, патент США № 4713339). Елементи експресії експресуючих систем варіюють за своєю довжиною і специфічністю. В залежності від системи хазяїн/вектор, що використовується, в експресуючому векторі можна використати будь-який з ряду відповідних елементів транскрипції і трансляції, включаючи конститутивні та індуковані промотори. Наприклад, при клонуванні в бактеріальних системах можна використати індуковані промотори, такі як pL бактеріофага , plac, ptrp, ptac (гібридний промотор ptrplac) і тому подібні; при клонуванні в системах клітин комах можна використати такі промотори, як промотор поліедрину бакуловірусу; при клонуванні в системах клітин рослин можна використати промотори, одержані з геному рослинних клітин (наприклад, промотори теплового шоку; промотор для малої субодиниці RUBISCO; промотор для білка, який зв'язує хлорофіл а/b) або з вірусів рослин (наприклад, промотор 35S РНК CaMV; промотор білка оболонки TMV); при клонуванні в системах клітин ссавців можна використати промотори, одержані з геному клітин ссавців (наприклад, промотор металотіонеїну) або з вірусів ссавців (наприклад, пізній промотор аденовірусу; промотор 7,5 К вірусу вакцинії); при створенні ліній клітин, які містять множинні копії продукту експресії, можна використати вектори, основані на SV40, BPV і EBV з відповідним селектованим маркером. У тих випадках, коли використовують експресуючі вектори рослин, експресія послідовностей, що кодують лінійні або нециклічні форми химерних 47 білків згідно з винаходом, може керуватись будьяким з ряду промоторів. Наприклад, можна використати вірусні промотори, такі як промотори 35S РНК і 19S РНК CaMV (Brisson et al. 1984, Nature 310:511-514), або промотор білка оболонки TMV (Takamatsu et al. 1987, EMBO J. 6:307-311); альтернативно, можна використати промотори рослин, такі як промотор малої субодиниці RUBISCO (Coruzzi et al. 1984, EMBO J. 3:1671-1680; Broglie et al. 1984, Science 224:838-843) або промотор теплового шоку, наприклад, hsp17.5-E або hsp17.3-B сої (Gurley et al. 1986, Mol. Cell. Biol. 6:559-565). Вказані конструкції можуть бути введені в клітини рослин з використанням Ті-плазмід, Ri-плазмід, векторів на основі вірусів рослин, прямою трансформацією ДНК, мікроін'єкцією, електропорацією і т.д. Огляд таких способів дивіться, наприклад, у Weissbach and Weissbach 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, SectionVIII, pp. 421-463; і Grierson and Corey 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9. В одній системі експресії комах, яку можна використати для одержання химерних білків згідно з винаходом, використовують вірус ядерного поліедрозу Autographa californica (AcNPV) як вектор для експресії чужорідних генів. Вірус росте в клітинах Spodoptera frugiperda. Кодуюча послідовність може бути клонована в несуттєвих ділянках (наприклад, в гені поліедрину) вірусу і поміщена під контроль промотору AcNPV (наприклад, промотор поліедрину). Успішне вбудовування кодуючої послідовності приведе до інактивації гена поліедрину і продукції «невкрапленого» рекомбінантного вірусу (тобто вірусу, у якого відсутня білкова оболонка, що кодується геном поліедрину). Потім вказані рекомбінантні віруси використовують для інфекції клітин Spodoptera frugiperda, в яких вбудований ген експресується (дивіться, наприклад, Smith et al. 1983, J. Virol. 46:584; патент США № 4215051). Додаткові приклади такої системи експресії можна знайти в Ausubel et al., eds. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. and Wiley Interscience. Іншою системою, яку можна використати для експресії химерних білків згідно з винаходом, є система експресії гена глутамінсинтетази, також названа «системою експресії GS» (Lonza Biologies PLC, Berkshire UK). Вказана система експресії детально описана в патенті США № 5981216. У клітинах-хазяїнах ссавців можна використати ряд основаних на вірусах систем експресії. У тих випадках, коли як експресуючий вектор використовують аденовірус, кодуюча послідовність може бути лігована з комплексом регуляції транскрипції/трансляції аденовірусу, наприклад, пізнім промотором і лідерною послідовністю, що складається з трьох частин. Потім вказаний химерний ген може бути вбудований в аденовірусний геном за допомогою рекомбінації in vitro або in vivo. Інсерція в несуттєву ділянку вірусного геному (наприклад, ділянка Е1 або E3) в результаті приведе до рекомбінантного вірусу, який є життєздатним і здатний експресувати пептид у інфікованих хазяїнів (дивіться, наприклад, Logan and Shenk 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655). Альтернативно, мо 95436 48 жна використати промотор 7.5 К вакцинії (дивіться, наприклад, Mackett et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415; Mackett et al. 1984, J. Virol. 49:857; Panicali et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927). У тих випадках, коли як експресуючий вектор використовують аденовірус, кодуюча послідовність може бути лігована з комплексом регуляції транскрипції/трансляції аденовірусу, наприклад, пізнім промотором і лідерною послідовністю, що складається з трьох частин. Потім вказаний химерний ген може бути вбудований в аденовірусний геном за допомогою рекомбінації in vitro або in vivo. Інсерція в несуттєву ділянку вірусного геному (наприклад, ділянка Е1 або E3) в результаті приведе до рекомбінантного вірусу, який є життєздатним і здатний експресувати пептид у інфікованих хазяїнів (дивіться, наприклад, Logan and Shenk 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655). Альтернативно, можна використати промотор 7.5 К вакцинії (дивіться, наприклад, Mackett et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7415; Mackett et al. 1984, J. Virol. 49:857; Panicali et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4927). Клітини-хазяїни, що містять конструкції ДНК химерного білка, вирощують у відповідному середовищі для зростання. У значенні, що використовується в даному описі, термін «відповідне середовище для зростання» означає середовище, що містить поживні речовини, необхідні для зростання клітин. Поживні речовини, необхідні для зростання клітин, можуть включати джерело вуглецю, джерело азоту, незамінні амінокислоти, вітаміни, мінерали і фактори росту. Необов'язково середовища можуть містити сироватку теляти або фетальну сироватку теляти. В одному варіанті середовище по суті не містить IgG. Середовище для зростання, як правило, буде вибиратись для клітин, що містять конструкцію ДНК, наприклад, за допомогою лікарської селекції або з використанням дефіциту незамінної поживної речовини, які комплементуються селектованим маркером в конструкції ДНК або котрансфікованим разом з конструкцією ДНК. Клітини ссавців, що культивуються, звичайно вирощують в комерційно доступному середовищі, що містить сироватку, або у безсироватковому середовищі (наприклад, MEM, DMEM). Вибір середовища, придатного для конкретної лінії клітин, що використовується, може здійснити фахівець в даній галузі. Рекомбінантно одержаний химерний білок згідно з винаходом може бути виділений з культурального середовища. Культуральне середовище від відповідним чином вирощених трансформованих або трансфікованих клітин-хазяїнів відділяють від клітинного матеріалу і показують присутність химерних білків. Одним зі способів виявлення химерних білків, наприклад, є зв'язування химерних білків або частин химерних білків зі специфічним антитілом, що упізнає химерний білок згідно з винаходом. Антитіло проти химерного білка може бути моноклональним або поліклональним антитілом, що виробляється проти химерного білка, який розглядається. Наприклад, химерний білок містить щонайменше частину константної ділянки імуног 49 лобуліну. Антитіла, що упізнають константну ділянку багатьох імуноглобулінів, відомі в даній галузі і є комерційно доступними. Антитіло може бути використане для здійснення ELISA або для вестернблоту, щоб виявити наявність химерного білка згідно з винаходом. Химерний білок згідно з винаходом може бути синтезований в трансгенній тварині, такій як гризун, корова, свиня, вівця або коза. Термін «трансгенні тварини» відноситься до тварин, які відрізняються від людини, в геном яких був введений чужорідний ген. Оскільки даний ген присутній в зародкових тканинах, він передається від батьків потомству. Екзогенні гени вводять в одноклітинні ембріони (Brinster et al. 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438). Способи одержання трансгенних тварин відомі в даній галузі, включаючи трансгенні організми, які продукують молекули імуноглобуліну (Wagner et al. 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6376; McKnight et al. 1983, Cell 34:335; Brinster et al. 1983, Nature 306:332; Ritchie et al. 1984, Nature 312:517; Baldassarre et al. 2003, Theriogenology 59:831; Robl et al. 2003, Theriogenology 59:107; Malassagne et al. 2003, Xenotransplantation 10(3):267). Химерний білок згідно з винаходом також може бути одержаний при комбінуванні способів хімічного синтезу і способів рекомбінації. Наприклад, частина константної ділянки імуноглобуліну може бути експресована рекомбінантно, як описано вище. Біологічно активна молекула може бути одержана з використанням відомих способів хімічного синтезу (наприклад, твердофазним синтезом). Частина константної ділянки імуноглобуліну може бути лігована з біологічно активною молекулою з використанням хімічного лігування і потім об'єднана з частиною константної ділянки імуноглобуліну, яка не була лігована з біологічно активною молекулою, з утворенням химерного білка згідно з винаходом. В одному варіанті частина константної ділянки імуноглобуліну являє собою Fc-фрагмент. Fc-фрагмент може бути одержаний рекомбінантно, щоб утворити Cys-Fc, і підданий взаємодії з біологічно активною молекулою, що має тіоефір, щоб одержати гібрид мономер-димер. В іншому варіанті одержують Fc-тіоефір і піддають взаємодії з біологічно активною молекулою, що має N-кінцевий цистеїн (Фіг. 4). В одному варіанті частина константної ділянки імуноглобуліну, лігована з біологічно активною молекулою, буде утворювати гомодимери. Гомодимери можуть бути зруйновані при впливі на гомодимери денатуруючих і відновлювальних умов (наприклад, бета-меркаптоетанол і 8М сечовина) і потім об'єднані з частиною константної ділянки імуноглобуліну, не зв'язаного з біологічно активною молекулою, з утворенням гібридів мономердимер. Потім гібриди мономер-димер піддають ренатурації і рефолдингу за допомогою діалізу в PBS і виділяють, наприклад, ексклюзійною хроматографією за розміром або афінною хроматографією. В іншому варіанті частина константної ділянки імуноглобуліну буде утворювати гомодимери перед зв'язуванням з біологічно активною молеку 95436 50 лою. У даному варіанті умови реакції для зв'язування біологічно активної молекули з гомодимером можна коректувати так, щоб зв'язування біологічно активної молекули відбувалось переважно з одним ланцюгом гомодимеру (наприклад, коректуючи молярні еквіваленти кожної реагуючої речовини). Біологічно активна молекула може бути хімічно синтезована з N-кінцевим цистеїном. Послідовність, що кодує частину константної ділянки імуноглобуліну, може бути субклонована у векторі, що кодує інтеїн, зв'язаний з хітин-зв'язувальним доменом (New England Biolabs, Beverly, MA). Інтеїн може бути зв'язаний з С-кінцем частини константної ділянки імуноглобуліну. В одному варіанті частина імуноглобуліну з інтеїном, зв'язаним з її Скінцем, може бути експресована в прокаріотичній клітині. В іншому варіанті частина імуноглобуліну з інтеїном, зв'язаним з її С-кінцем, може бути експресована в еукаріотичній клітині. Частина константної ділянки імуноглобуліну, зв'язана з інтеїном, може бути піддана взаємодії з MESNA. В одному варіанті частину константної ділянки імуноглобуліну, зв'язану з інтеїном, зв'язують з колонкою, наприклад, колонкою з хітином, і потім елююють, використовуючи MESNA. Біологічно активна молекула і частина імуноглобуліну можуть бути піддані взаємодії одна з одною так, щоб відбувалось нуклеофільне перегрупування і біологічно активна молекула ковалентно зв'язувалась з частиною імуноглобуліну за допомогою амідного зв'язку (Dawsen et al. 2000, Annu. Rev. Biochem. 69:923). Синтезований таким чином химерний білок необов'язково може містити лінкерний пептид між частиною імуноглобуліну і біологічно активною молекулою. Лінкер можна, наприклад, синтезувати на Nкінці біологічно активної молекули. Лінкери можуть включати пептиди і/або органічні молекули (наприклад, поліетиленгліколь і/або короткі амінокислотні послідовності). Вказаний комбінований рекомбінантний і хімічний синтез дозволяє провести швидкий скринінг біологічно активних молекул і лінкерів, щоб оптимізувати необхідні властивості химерного білка згідно з винаходом, наприклад, інгібування вірусів, гемостаз, продукція червоних кров'яних клітин, біологічний час напівжиття, стабільність, зв'язування з білками сироватки або деякі інші властивості химерного білка. Спосіб також дозволяє вводити амінокислоти, що не зустрічаються в природі, в химерний білок згідно з винаходом, які можуть бути застосовні для оптимізації необхідного химерного білка згідно з винаходом. За бажання химерний білок, одержаний таким способом, може бути підданий рефолдингу до біологічно активної конформації з використанням умов, відомих в даній галузі, наприклад, відновлювальних умов, і потім повільно діалізований в PBS. Альтернативно, N-кінцевий цистеїн може бути на частині константної ділянки імуноглобуліну, наприклад, Fc-фрагменті. Fc-фрагмент може бути створений з N-кінцевим цистеїном, беручи до уваги той факт, що нативний Fc має цистеїн в положенні 226 (дивіться Rabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U. S. Department of Public Health, Bethesda, MD). 51 Щоб експресувати кінцевий цистеїн, Fcфрагмент може бути експресований рекомбінантно. В одному варіанті Fc-фрагмент експресують в прокаріотичній клітині, наприклад, Е. coli. Послідовність, що кодує Fc-частину, починаючи з Cys 226 (нумерація EU), можна вмістити відразу після послідовності, що кодує сигнальний пептид, наприклад, OmpA, PhoA, STII. Прокаріотичну клітину можна піддати осмотичному шоку, щоб вивільнити рекомбінантний Fc-фрагмент. В іншому варіанті Fc-фрагмент продукують в еукаріотичній клітині, наприклад, клітині СНО, клітині ВНК. Послідовність, що кодує фрагмент Fc-частини, можна вмістити прямо після послідовності, що кодує сигнальний пептид, наприклад, сигнальної послідовності легкого ланцюга Ig миші або сигнальної послідовності Kb MHC класу І так, щоб коли рекомбінантний химерний білок синтезувався еукаріотичною клітиною, сигнальна послідовність відщеплювалась, залишаючи при цьому N-кінцевий цистеїн, потім білок може бути виділений і підданий хімічній взаємодії з молекулою, яка несе тіоефір (наприклад, С-кінцевий тіоефір, якщо молекула складається з амінокислот). N-кінцевий цистеїн на Fc-фрагменті також може бути створений з використанням ферменту, який розщеплює свій субстрат біля його N-кінця, наприклад, фактор Ха, ентерокінази, і продукт може бути виділений і підданий взаємодії з молекулою, що має тіоефірну групу. Рекомбінантно експресований Fc-фрагмент може бути використаний для одержання гомодимерів або гібридів мономер-димер. У конкретному варіанті Fc-фрагмент експресують з сигнальним пептидом інтерферону людини, розташованим поруч з Cys у положенні 226. Коли конструкцію, що кодує даний поліпептид, експресують в клітинах СНО, клітини СНО відщеплюють сигнальний пептид в двох різних положеннях (у Cys 226 і у Val в сигнальному пептиді на 2 амінокислоти вище в напрямі N-кінця). Це приводить до утворення суміші двох видів Fcфрагментів (один з N-кінцевим Val і один з Nкінцевим Cys). Це в свою чергу приводить до суміші димерних видів (гомодимери з кінцевим Val, гомодимери з кінцевим Cys і гетеродимери, в яких один ланцюг має кінцевий Cys, а інший ланцюг має кінцевий Val). Fc-фрагменти можуть бути піддані взаємодії з біологічно активною молекулою, що має С-кінцевий тіоефір і одержаний в результаті гібрид мономер-димер може бути виділений з суміші (наприклад, ексклюзійною хроматографією за розміром). Передбачається, що при використанні інших послідовностей сигнального пептиду для експресії Fc-фрагментів в клітинах СНО буде утворюватись суміш видів Fc-фрагментів щонайменше з двома різними N-кінцями. В іншому варіанті рекомбінантно одержаний Cys-Fc може утворювати гомодимер. Гомодимер може бути підданий взаємодії з пептидом, який має розгалужений лінкер на С-кінці, при цьому розгалужений лінкер має два С-кінцевих тіоефіри, які можуть бути піддані взаємодії з Cys-Fc. В іншому варіанті біологічно активна молекула має один некінцевий тіоефір, який може бути підданий 95436 52 взаємодії з Cys-Fc. Альтернативно, розгалужений лінкер може мати два С-кінцевих цистеїни, які можуть взаємодіяти з тіоефіром Fc. В іншому варіанті розгалужений лінкер має дві функціональні групи, які можуть бути піддані взаємодії з тіоефіром Fc, наприклад, 2-меркаптоамін. Біологічно активна молекула може складатись з амінокислот. Біологічно активна молекула може включати малу органічну молекулу або малу неорганічну молекулу. F. Способи застосування химерних білків Химерні білки згідно з винаходом мають багато застосувань, які будуть відомі фахівцеві в даній галузі, включаючи, але не обмежуючи вказаним, способи лікування суб'єкта при захворюванні або патологічному стані. Захворювання або стан може включати, без обмеження, вірусну інфекцію, гемостатичний розлад, анемію, злоякісну пухлину, лейкоз, запальний стан або аутоімунне захворювання (наприклад, артрит, псоріаз, системний червоний вовчак, множинний склероз), або бактеріальну інфекцію (дивіться, наприклад, патенти США №№ 6086875, 6030613, 6485726; WO 03/077834; US2003-0235536A1). 1. Способи лікування суб'єкта з недостатністю червоних кров'яних клітин Винахід відноситься до способу лікування суб'єкта, що має недостатність червоних кров'яних клітин, наприклад, анемію, що включає в себе введення терапевтично ефективної кількості щонайменше одного химерного білка, при цьому химерний білок містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де перший ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну і щонайменше один агент, здатний індукувати проліферацію червоних кров'яних клітин, наприклад, ЕРО, і другий поліпептидний ланцюг містить щонайменше частину імуноглобуліну без агента, здатного індукувати проліферацію червоних кров'яних клітин, який є в першому ланцюгу. 2. Способи лікування суб'єкта з вірусною інфекцією Винахід відноситься до способу лікування суб'єкта, що має вірусну інфекцію або підданого впливу вірусу, що включає в себе введення терапевтично ефективної кількості щонайменше одного химерного білка, при цьому химерний білок містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де перший ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну і щонайменше один противірусний агент, наприклад, інгібітор злиття або інтерферон , і другий поліпептидний ланцюг містить щонайменше частину імуноглобуліну без противірусного агента, що є в першому ланцюгу. В одному варіанті суб'єкт інфікований вірусом, який можна лікувати IFN, наприклад, вірусом гепатиту С. В одному варіанті суб'єкт інфікований ВІЛ, таким як ВІЛ-1 або ВІЛ-2. В одному варіанті химерний білок згідно з винаходом інгібує реплікацію вірусів. В одному варіанті химерний білок згідно з винаходом запобігає або інгібує проникнення вірусу в клітини-мішені, тим самим зупиняючи, запобігаючи або обмежуючи поширення вірусної інфекції у суб'єкта і зменшуючи вірусне навантаження інфікованого суб'єкта. Завдяки зв'язуванню частини імуноглобуліну з 53 інгібітором злиття вірусів винахід забезпечує химерний білок активністю, яка інгібує злиття вірусів, з більш високою стабільністю і більш високою біодоступністю у порівнянні з інгібіторами злиття, що використовуються окремо, наприклад, Т20, Т21, Τ1249. Таким чином в одному варіанті інгібітор злиття вірусів зменшує або запобігає ВІЛ-інфекції клітини-мішені, наприклад, інфекції ВІЛ-1. а. Стани, які можна лікувати Химерний білок згідно з винаходом можна використати для інгібування або запобігання інфекції клітини-мішені вірусом гепатиту, наприклад, вірусом гепатиту С Химерний білок може містити противірусний агент, який інгібує реплікацію вірусів. В одному варіанті химерний білок згідно з винаходом містить інгібітор злиття. Химерний білок згідно з винаходом можна використати для інгібування або запобігання інфекції будь-якої клітинимішені будь-яким вірусом (дивіться, наприклад, патенти США №№ 6086875, 6030613, 6485726; WO 03/077834; US2003-0235536А1). В одному варіанті вірус є вірусом, покритим оболонкою, таким як, без обмеження, ВІЛ, SIV, вірус кору, грипу, вірус Епштейн-Барра, респіраторно-синцитіальний вірус або вірус парагрипу. В іншому варіанті вірус є вірусом, не покритим оболонкою, таким як риновірус або вірус поліомієліту. Химерний білок згідно з винаходом можна використати для лікування суб'єкта, вже інфікованого вірусом. Суб'єкт може мати гостру вірусну інфекцію. Альтернативно, суб'єкт може бути хронічно інфікований вірусом. Химерний білок згідно з винаходом також можна використати для профілактичного лікування суб'єкта, для якого існує ризик зараження вірусною інфекцією, наприклад, суб'єкта, який як відомо або приблизно близько контактує з вірусом, або суб'єкта, який приблизно інфікований або несе вірус. Химерний білок згідно з винаходом можна використати для лікування суб'єкта, який зазнавав впливу вірусу, але який ще не має позитивного діагнозу. В одному варіанті винахід відноситься до способу лікування суб'єкта, інфікованого HCV, що включає в себе введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості химерного білка, при цьому химерний білок містить Fc-фрагмент IgG і цитокін, наприклад IFN. В одному варіанті винахід відноситься до способу лікування суб'єкта, інфікованого ВІЛ, що включає в себе введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості химерного білка, при цьому химерний білок містить Fc-фрагмент IgG та інгібітор злиття вірусу містить Т20. 3. Способи лікування суб'єкта, що має гемостатичний розлад Винахід відноситься до способу лікування суб'єкта, що має гемостатичний розлад, що включає в себе введення терапевтично ефективної кількості щонайменше одного химерного білка, при цьому химерний білок містить перший і другий ланцюги, де перший ланцюг містить щонайменше один фактор скипання крові і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, і другий ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну. 95436 54 Химерний білок згідно з винаходом лікує або запобігає гемостатичному розладу, стимулюючи утворення згустка фібрину. Химерний білок згідно з винаходом може активувати будь-який член каскаду коагуляції. Фактор скипання крові може бути учасником зовнішнього шляху, внутрішнього шляху або обох шляхів. В одному варіанті фактором скипання крові є фактор VII або фактор VIIa. Фактор VIIa може активувати фактор X, який взаємодіє з фактором Va, розщеплюючи протромбін до тромбіну, який в свою чергу розщеплює фібриноген до фібрину. В іншому варіанті фактором скипання крові є фактор IX або фактор ІХа. У ще одному варіанті фактором скипання крові є фактор VIII або фактор VIIla. У ще одному варіанті фактором скипання крові є фактор фон Віллебрандта, фактор XI, фактор XII, фактор V, фактор X або фактор XIII. а. Стани, які можна лікувати Химерний білок згідно з винаходом можна використати для лікування будь-якого гемостатичного розладу. Гемостатичні розлади, які можна лікувати введенням химерного білка згідно з винаходом, включають, але не обмежені вказаним, гемофілію А, гемофілію В, хворобу фон Віллебрандта, недостатність фактора XI (недостатність РТА), недостатність фактора XII, а також недостатність або структурні аномалії фібриногену, протромбіну, фактора V, фактора VII, фактора X або фактора XIII. В одному варіанті гемостатичний розлад є спадковим розладом. В одному варіанті суб'єкт має гемофілію А, і химерний білок містить фактор VIII або фактор VIIla. В іншому варіанті суб'єкт має гемофілію А, і химерний білок містить фактор VII або фактор VIIa. В іншому варіанті суб'єкт має гемофілію В, і химерний білок містить фактор IX або фактор ІХа. В іншому варіанті суб'єкт має гемофілію В, і химерний білок містить фактор VII або фактор VIIa. В іншому варіанті суб'єкт має інгібуючі антитіла до фактора VIII або фактора VIIla, і химерний білок містить фактор VII або фактор VIIa. У ще одному варіанті суб'єкт має інгібуючі антитіла проти фактора IX або фактора ІХа, і химерний білок містить фактор VII або фактор VIIa. Химерний білок згідно з винаходом можна використати для профілактичного лікування суб'єкта з гемостатичним розладом. Химерний білок згідно з винаходом можна використати для лікування гострого епізоду кровотечі у суб'єкта з гемостатичним розладом. В одному варіанті гемостатичний розлад є результатом недостатності фактора скипання крові, наприклад, фактора IX, фактора VIII. В іншому варіанті гемостатичний розлад може бути результатом дефектного фактора скипання крові, наприклад, фактора фон Віллебрандта. В іншому варіанті гемостатичний розлад може являти собою набутий розлад. Набутий розлад може бути результатом вторинного захворювання або стану, який лежить в основі. Неспорідненим станом може бути, наприклад, без обмеження, злоякісна пухлина, аутоімунне захворювання або вагітність. Набутий розлад може бути результатом немолодого віку або медикаментозного лікування 55 вторинного розладу, який лежить в основі (наприклад, хіміотерапії злоякісної пухлини). 4. Способи лікування суб'єкта, потребуючого загального гемостатичного агента Винахід також відноситься до способів лікування суб'єкта, який не має гемостатичного розладу або вторинного захворювання або стану, що приводить до набуття гемостатичного розладу. Таким чином, винахід відноситься до способу лікування суб'єкта, потребуючого загального гемостатичного агента, що включає в себе введення терапевтично ефективної кількості щонайменше одного химерного білка, при цьому химерний білок містить перший і другий поліпептидні ланцюги, де перший поліпептидний ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну і щонайменше один фактор скипання крові, і другий ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну без фактора скипання крові, що є в першому поліпептидному ланцюгу. а. Стани, які можна лікувати В одному варіанті суб'єкта, потребуючого загального гемостатичного агента, піддають або мають намір піддати хірургічній операції. Химерний білок згідно з винаходом можна вводити перед або після операції як профілактичний засіб. Химерний білок згідно з винаходом можна вводити під час або після операції, щоб контролювати гострий епізод кровотечі. Хірургічна операція може включати, але не обмежена вказаним, трансплантацію печінки, резекцію печінки або трансплантацію стовбурових клітин. Химерний білок згідно з винаходом можна використати для лікування суб'єкта, що має гострий епізод кровотечі, який не має гемостатичного розладу. Гострий епізод кровотечі може бути результатом важкої травми, наприклад, хірургічної операції, автомобільної аварії, поранення, вогнепального поранення або будь-якої іншої травмуючої події, що призводить до кровотечі, яка не контролюється. 5.Засоби лікування Химерний білок згідно з винаходом можна вводити внутрішньовенно, підшкірно, внутрішньом'язово або через будь-яку поверхню слизової оболонки, наприклад, пероральним, під'язиковим, букальним, назальним, ректальним, вагінальним способом або через легеневий шлях. Химерний білок може бути імплантований в тверду підкладку на основі біополімеру або зв'язаний з підкладкою, яка забезпечує можливість повільного вивільнення химерного білка в необхідному місці. Доза химерного білка згідно з винаходом буде варіювати в залежності від суб'єкта і конкретного шляху введення, що використовується. Дози можуть бути в діапазоні від 0,1 до 100000 мкг/кг маси тіла. В одному варіанті межі доз становлять 0,11000 мкг/кг. Білок може вводитись безперервно або з конкретними часовими інтервалами. Можна використати аналізи in vitro, щоб визначити оптимальні межі доз і/або схеми введення. В даній галузі відомо багато аналізів in vitro, в яких вимірюють інфекційність вірусу. Наприклад, можна використати аналіз оберненої транскриптази або ОТ-ПЛР-аналіз або аналіз розгалуженої ДНК, щоб 95436 56 виміряти концентрації ВІЛ. Можна використати аналіз StaClot, щоб виміряти скипаючу активність. Крім того, ефективні дози можна екстраполювати на основі кривих доза-відповідь, одержаних в моделях на тваринах. Винахід також відноситься до фармацевтичної композиції, що містить інгібітор злиття вірусу, щонайменше частину імуноглобуліну і фармацевтично прийнятний носій або ексципієнт. Приклади відповідних фармацевтичних носіїв описані в Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin. Приклади ексципієнтів можуть включати крохмаль, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, крейду, силікагель, стеарат натрію, моностеарат гліцерину, тальк, хлорид натрію, сухе знежирене молоко, гліцерин, пропілен, гліколь, воду, етанол і тому подібне. Композиція також може містити реагенти для рН-буферів і зволожувачі або емульгатори. Для перорального введення фармацевтична композиція може мати форму таблеток або капсул, одержаних звичайними способами. Композиція також може бути одержана у вигляді рідини, наприклад, сиропу або суспензії. Рідина може містити суспендуючі агенти (наприклад, сироп сорбіту, похідні целюлози або гідрогенізовані харчові жири), емульгатори (лецитин або акацієву камедь), неводні наповнювачі (наприклад, мигдалеву олію, маслянисті складні ефіри, етиловий спирт або фракціоновані олії) і консерванти (наприклад, метил- або пропіл-пара-гідроксибензоати або сорбінову кислоту). Препарати також можуть містити коригенти, барвники і підсолоджувачі. Альтернативно, композиція може бути одержана у вигляді сухого продукту для приготування з водою або іншим відповідним наповнювачем. Для букального і під'язикового введення композиції можна надавати форму таблеток, коржиків або плівок, що швидко розчиняються, згідно зі звичайними протоколами. У випадку введення шляхом інгаляції сполуки для застосування згідно з даним винаходом звичайно доставляють у формі аерозольного спрею з упаковки під тиском або розпилювача (наприклад, в PBS) з відповідним газом-витискувачем, наприклад, дихлордифторметаном, трихлорфторметаном, дихлортетрафторметаном, вуглекислим газом або іншим відповідним газом. У випадку аерозолю під тиском одиницю дозування можна визначати, забезпечуючи клапаном для доставки кількості, що вимірюється. Можуть бути приготовані капсули і картриджі, наприклад, з желатину, для застосування в інгаляторі або інсуфляторі, що містять порошкоподібну суміш сполуки і відповідної порошкоподібної основи, такої як лактоза або крохмаль. Фармацевтична композиція може бути приготована для парентерального введення (наприклад, внутрішньовенного або внутрішньом'язового) за допомогою ін'єкції болюсу. Препарати для ін'єкції можуть бути представлені в дозованій лікарській формі, наприклад, в ампулах або контейнерах, що містять декілька доз з додаванням консерванта. Композиції можуть мати такі форми, як суспензії або емульсії в масляних або водних наповню 57 вачах, і містити агенти для приготування лікарського засобу, такі як суспендуючі, стабілізуючі і/або диспергуючі агенти. Альтернативно, активний інгредієнт може бути у формі порошку для перерозчинення з використанням відповідного наповнювача, наприклад, апірогенної води. Фармацевтична композиція також може бути приготована для ректального введення у вигляді супозиторію або утримуючої клізми, наприклад, що містять звичайні для супозиторіїв основи, такі як масло какао або інші гліцериди. 6. Комбінована терапія Химерний білок згідно з винаходом можна використати для лікування суб'єкта із захворюванням або станом в комбінації щонайменше з одним іншим відомим засобом для лікування вказаного захворювання або стану. В одному варіанті винахід відноситься до способу лікування суб'єкта, інфікованого ВІЛ, що включає в себе введення терапевтично ефективної кількості щонайменше одного химерного білка, що містить перший і другий ланцюги, в якому перший ланцюг містить інгібітор злиття ВІЛ і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, і другий ланцюг містить щонайменше частину імуноглобуліну без інгібітору злиття ВІЛ, що є в першому ланцюгу, в комбінації щонайменше з одним іншим агентом проти ВІЛ. Вказаним іншим агентом проти ВІЛ може бути будь-який терапевтичний засіб, для якого показана анти-ВІЛактивність. Вказаний інший агент проти ВІЛ як приклад може включати, але не обмежений вказаним, інгібітор протеази (наприклад, Amprenavir, Crixivan, Ritonivir), нуклеозидний аналог оберненої транскриптази (наприклад, AZT, DDI, D4T, 3ТС, Ziagen), ненуклеозидний аналог-інгібітор оберненої транскриптази (наприклад, Sustiva), інші інгібітори злиття ВІЛ, нейтралізуюче антитіло, специфічне по відношенню до ВІЛ, антитіло, специфічне по відношенню до CD4, міметик CD4, наприклад, злитий білок CD4-IgG2 (заявка на видачу патенту США 09/912824) або антитіло, специфічне по відношенню до CCR5 або CXCR4, або специфічний зв'язувальний партнер CCR5 або CXCR4. В іншому варіанті винахід відноситься до способу лікування суб'єкта з гемостатичним розладом, що включає в себе введення терапевтично ефективної кількості щонайменше одного химерного білка, що містить перший і другий ланцюги, в якому перший ланцюг містить щонайменше один фактор скипання крові і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, і другий ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну без фактора скипання крові, що є в першому ланцюгу, в комбінації щонайменше з одним іншим фактором скипання крові або агентом, який стимулює гемостаз. Вказаним іншим фактором скипання крові або агентом, який стимулює гемостаз, може бути будь-який терапевтичний засіб з показаною скипаючою активністю. Як необмежувальний приклад фактор скипання крові або гемостатичний агент може включати фактор V, фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XI, фактор XII, фактор XIII, протромбін або фібриноген або активовані форми будь-якого з 95436 58 вказаних вище. Фактор скипання крові або гемостатичний агент також може включати антифібринолітичні лікарські засоби, наприклад, епсилонамінокапронову кислоту, транексамову кислоту. 7. Способи інгібування злиття вірусів з клітиною-мішенню Винахід також відноситься до способу in vitro інгібування злиття ВІЛ з клітиною ссавця, що включає в себе комбінування клітини ссавця щонайменше з одним химерним білком, при цьому химерний білок містить перший і другий ланцюги, де перший ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну та інгібітор ВІЛ, і другий ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну без інгібітору ВІЛ, що є в першому ланцюгу. Клітина ссавця може включати будь-яку клітину або лінію клітин, чутливу до інфекції ВІЛ, вклю+ чаючи, без обмеження, первинні Т-клітини CD4 людини або макрофаги, клітини MOLT-4, клітини СЕМ, клітини АА5 або клітин HeLa, які експресують CD4 на клітинній поверхні. G. Способи виділення химерних білків Звичайно, коли одержують химерні білки згідно з винаходом, вони знаходяться в суміші інших молекул, таких як інші білки або фрагменти білків. Таким чином, винахід відноситься до способів виділення будь-якого з химерних білків, описаних вище, з суміші, що містить химерні білки. Визначено, що химерні білки згідно з винаходом зв'язуються з лігандами-барвниками у відповідних умовах і що зміна вказаних умов після зв'язування може розривати зв'язок між лігандом-барвником і химерним білком, тим самим забезпечуючи спосіб виділення химерного білка. У деяких варіантах суміш може містити гібрид мономер-димер, димер і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, наприклад, Fc. Таким чином, в одному варіанті винахід відноситься до способу виділення гібриду мономер-димер. В іншому варіанті винахід відноситься до способу виділення димеру. Відповідно, в одному варіанті винахід відноситься до способу виділення гібриду мономердимер з суміші, коли суміш містить a) гібрид мономер-димер, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, в якому перший ланцюг містить біологічно активну молекулу і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну, і в якому другий ланцюг містить щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну без біологічно активної молекули або варіабельної ділянки імуноглобуліну; b) димер, що містить перший і другий поліпептидні ланцюги, в якому перший і другий ланцюги обидва містять біологічно активну молекулу і щонайменше частину константної ділянки імуноглобуліну; і c) частину константної ділянки імуноглобуліну; при цьому вказаний спосіб включає в себе: 1) здійснення контакту суміші з лігандомбарвником, зв'язаним з твердою підкладкою у відповідних умовах, так що і гібрид мономер-димер і димер зв'язуються з лігандом-барвником; 2) видалення незв'язаної частини константної ділянки імуноглобуліну; 59 3) зміну відповідних умов 1) так, що зв'язок між гібридом мономер-димер і лігандом-барвником, зв'язаним з твердою підкладкою, розривається; 4) виділення гібриду мономер-димер. У деяких варіантах перед здійсненням контакту суміші з лігандом-барвником суміш може бути піддана контакту з речовиною для хроматографії, такою як білок А-сефароза або тому подібним. Суміш елююють з речовини для хроматографії, використовуючи відповідний елююючий буфер (наприклад, буфер з низьким значенням рН) і елюат, що містить суміш, потім піддають контакту з лігандом-барвником. Відповідні умови для контактування суміші з лігандом-барвником можуть включати буфер для підтримання суміші при відповідному рН. Відповідне значення рН може становити 3-10, 4-9, 5-8. В одному варіанті відповідне значення рН дорівнює 8,0. Можна використати будь-який буферний агент, відомий в даній галузі, за умови, що він підтримує рН у відповідному діапазоні, наприклад, Трис, HEPES, PIPES, MOPS. Відповідні умови також можуть включати буфер для промивання, щоб елюювати незв'язані форми з ліганду-барвника. Буфером для промивання може бути будь-який буфер, який не руйнує зв'язування зв'язаної форми. Наприклад, буфером для промивання може бути такий же буфер, який використовують на стадії контактування. Після того, як химерний білок зв'язують з лігандом-барвником, химерний білок виділяють, змінюючи відповідні умови. Зміна відповідних умов може включати додавання солі до буфера. Можна використати будь-яку сіль, наприклад, NaCl, KCl. Сіль потрібно додавати в концентрації, яка є досить високою, щоб зруйнувати зв'язування між лігандом-барвником і необхідною формою, наприклад, гібридом мономер-димер. У деяких варіантах, коли суміш складається з Fc, гібриду мономер-димер і димеру, виявлено, що Fc не зв'язується з лігандом-барвником і, отже, елююється прохідним потоком. Димер зв'язується більш міцно з лігандом-барвником, ніж гібрид мономер-димер. Таким чином, потрібна більш висока концентрація солі, щоб зруйнувати зв'язок (наприклад, елюювати) між димером і лігандомбарвником у порівнянні з концентрацією солі, необхідною для руйнування зв'язку між лігандомбарвником і гібридом мономер-димер. У деяких варіантах можна використати NaCl, щоб виділити гібрид мономер-димер з суміші. У деяких варіантах відповідна концентрація солі, яка руйнує зв'язок між лігандом-барвником і гібридом мономер-димер, становить 200-700 мМ, 300-600 мМ, 400-500 мМ. В одному варіанті концентрація NaCl, необхідна для руйнування зв'язування між лігандом-барвником і гібридом мономер-димер, становить 400 мМ. NaCl також можна використати для виділення димеру з суміші. Звичайно гібрид мономер-димер виділяють з суміші до виділення димеру. Димер виділяють додаванням відповідної концентрації солі до буфера, таким чином руйнуючи зв'язування між лігандом-барвником і димером. У деяких варіантах відповідна концентрація солі, яка руйнує 95436 60 зв'язок між лігандом-барвником і димером, складає від 800 мМ до 2 М, від 900 мМ до 1,5 М, від 950 мМ до 1,2 М. В одному конкретному варіанті використовують 1 Μ NaCl, щоб зруйнувати зв'язування між лігандом-барвником і димером. Лігандом-барвником може бути біоміметик. Біоміметик являє собою штучно одержану речовину, пристрій або систему, яка імітує природну. Таким чином, в деяких варіантах ліганд-барвник імітує молекули лігандів, що зустрічаються в природі. Ліганд-барвник може бути вибраний з Mimetic Red I, Mimetic Red 2, Mimetic Orange 1, Mimetic Orange 2, Mimetic Orange 3, Mimetic Yellow 1, Mimetic Yellow 2, Mimetic Green 1, Mimetic Blue 1 і Mimetic Blue 2 (Prometic Biosciences (USA) Inc., Wayne, NJ). В одному конкретному варіанті лігандом-барвником є Mimetic Red 2 (Prometic Biosciences (USA) Inc., Wayne, NJ). У деяких варіантах ліганд-барвник зв'язують з твердою підкладкою, наприклад, з Mimetic Red 1 A6XL, Mimetic Red 2 A6XL, Mimetic Orange 1 A6XL, Mimetic Orange 2 A6XL, Mimetic Orange 3 A6XL, Mimetic Yellow 1 A6XL, Mimetic Yellow 2 A6XL, Mimetic Green 1 A6XL, Mimetic Blue 1 A6XL і Mimetic Blue 2 A6XL (Prometic Biosciences (USA) Inc., Wayne, NJ). Ліганд-барвник може бути зв'язаний з твердою підкладкою. Твердою підкладкою може бути будьяка тверда підкладка, відома в даній галузі (дивіться, наприклад, www.seperationsNOW.com). Приклади твердих підкладок можуть включати кульку, гель, мембрану, наночастинку або мікросферу. Тверда підкладка може містити будь-який матеріал, який може бути зв'язаний з лігандомбарвником (наприклад, агарозу, полістирол, сефарозу, сефадекс). Тверді підкладки можуть містити будь-який синтетичний органічний полімер, такий як поліакриловий, вініловий полімери, акрилат, поліметакрилат і поліакриламід. Тверді підкладки також можуть містити вуглеводний полімер, наприклад, агарозу, целюлозу або декстран. Тверді підкладки можуть містити неорганічні оксиди, такі як діоксид кремнію, діоксид цирконію, діоксид титану, оксид церію, оксид алюмінію, магнезію (тобто оксид магнію) або оксид кальцію. Тверді підкладки також можуть містити комбінації деяких з вказаних вище підкладок, включаючи, без обмеження, декстран-акриламід. Приклади Приклад 1: Молекулярна маса впливає на трасцитоз, опосередкований FcRn Химерні білки, що складаються з різних білків, які представляють інтерес, і IgG Fc, одержували рекомбінантно (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) або у випадку контактин-Fc, ΜΑΒ--gal (комплекс моноклонального антитіла, зв'язаного з -gal) (Biodesign International, Saco, ME) i MAB-GH (комплекс моноклонального антитіла і гормону росту) (Research Diagnostics, Inc. Flanders, NJ) придбавали з комерційних джерел. Коротко, гени, що кодують білок, який представляє інтерес, клонували за допомогою ПЛР і потім субклонували в плазміді, яка експресує злиття Fc. Плазмідами