Конструкція нуклеїнової кислоти для зниження реплікації вірусу грипу а в клітині тварини

Реферат: Винахід належить до конструкцій нуклеїнових кислот, що кодують молекули двониткової РНК, які можуть використовуватися для одержання трансгенних свійських птахів, наприклад, курей, так щоб вони були щонайменше менш сприйнятливі до інфекції пташиним грипом. Зазначені молекули нуклеїнової кислоти, що містять двониткову ділянку, можуть використовуватися як терапевтичний засіб для лікування і/або профілактики, наприклад, пташиного грипу в свійських птахів. UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь винаходу Даний винахід стосується молекул нуклеїнових кислот, що містять двониткову ділянку, і конструкцій нуклеїнових кислот, що кодують їх, які можна використовувати для лікування і/або профілактики грипу. Зокрема, даний винахід стосується конструкцій нуклеїнових кислот, що кодують молекулу(и) двониткової РНК, які можуть використовуватися для одержання трансгенних тварин, наприклад, курчат, які щонайменше менш сприйнятливі до інфікування пташиним грипом. Даний винахід також стосується молекул нуклеїнової кислоти, що містять двониткові ділянки, які можуть використовуватися як терапевтичні засоби для лікування і/або профілактики, наприклад, пташиного грипу в свійських птахів. Попередній рівень техніки Відомі три типи вірусу грипу, типи А, В та С, і вони належать до родини оболонкових вірусів, що містять однонитковий негативний ланцюг РНК, які називають Orthomyxoviridae. Довжина вірусного геному складає приблизно від 12000 до 15000 нуклеотидів і містить 8 сегментів РНК (7 у типу С), які кодують 11 білків. Вірус грипу А інфікує багатьох тварин, таких як свині, коні, морські тварини і птахи, а також людей (Nicholson et al., 2005). Його природним резервуаром є водоплавні птахи, і в птахів більшість інфікувань вірусом грипу викликає легкі локалізовані інфекції дихальних шляхів і кишкового тракту. Однак вірус може бути високопатогенним для свійських птахів, викликаючи раптові спалахи з високим відсотком смертності в популяції уражених свійських птахів. Віруси грипу А можна класифікувати на підтипи на підставі алельних змін в антигенних ділянках двох генів, які кодують поверхневі глікопротеїди, а саме, гемаглютинін (НА) і нейрамінідазу (NA), які необхідні для прикріплення вірусу і виходу з клітин. Інші основні вірусні білки включають нуклеопротеїн, нуклеокапсидний структурний білок, матричні білки (М1 і М2), полімерази (РА, РВ1 і РВ2) і неструктурні білки (NS1 і NS2). У вірусу грипу А відомі щонайменше 16 підтипів НА (Н1-Н16) і 9 NA (N1-N9) антигенних варіантів. Штами вірусу пташиного грипу можуть також характеризуватися як низькопатогенні і високопатогенні штами. Низькопатогенні штами звичайно мають лише дві основні амінокислоти в положеннях -1 і -3 сайта розщеплення попередника НА, тоді як високопатогенні штами мають багатоосновний сайт розщеплення. Підтипи Н5 і Н7 можуть викликати високопатогенні інфекції у свійських птахів, і було показано, що певні підтипи долають видові бар'єри і стають інфекційними для людей. Високопатогенні віруси Н5 і Н7 можуть також виникати з низькопатогенних попередників у свійських птахів. Симптоми інфекції пташиного грипу проявляються в діапазоні від звичайних симптомів грипу (лихоманка, кашель, біль у горлі і м'язові болі) до кон'юнктивіту, пневмонії, гострої дихальної недостатності та інших загрозливих для життя ускладнень. Існує необхідність у розробці способів контролю існування і/або реплікації вірусу грипу у тварин, таких як свійські птахи, не лише для підвищення продуктивності і благополуччя тварин у промисловому тваринництві, але також для зниження ризиків для здоров'я людей. Стислий опис суті винаходу Автори ідентифікували молекули нуклеїнових кислот, що містять двониткові ділянки, які здатні знизити реплікацію і/або продукцію вірусу грипу в інфікованих клітинах тварин. Відповідно, даний винахід стосується конструкції нуклеїнової кислоти, що кодує молекулу РНК, яка містить двониткову ділянку, де молекула РНК знижує реплікацію вірусу грипу А в клітині тварини і/або знижує продукцію інфекційних частинок вірусу грипу А в клітині тварини і/або знижує експресію поліпептиду вірусу грипу А в клітині тварини, інфікованій вірусом грипу А, у порівнянні з ізогенною клітиною тварини, інфікованою вірусом грипу А, що не має молекули РНК. Переважно, двониткова ділянка містить нуклеотидну послідовність нуклеотидів, вибраних із: (і) нуклеотидів у положеннях від 2240 до 2341 послідовності SEQ ID NO:1, (ii) нуклеотидів у положеннях від 2257 до 2341 послідовності SEQ ID NO:2, (iii) нуклеотидів у положеннях від 2087 до 2233 послідовності SEQ ID NO:3, (iv) нуклеотидів у положеннях від 1484 до 1565 послідовності SEQ ID NO:4, (v) нуклеотидної послідовності будь-якої з послідовності SEQ ID NO:6-15 або 52-54, (vi) нуклеотидної послідовності, яка щонайменше на 90 % ідентична будь-якій з (і)-(v), (vii) нуклеотидної послідовності, яка гібридизується з будь-якої з (і)-(v) у жорстких умовах. В одному з варіантів здійснення молекула РНК знижує реплікацію вірусу грипу А в клітині тварини в порівнянні з ізогенною клітиною тварини, інфікованою вірусом грипу А, що не має молекули РНК. В іншому варіанті здійснення молекула РНК знижує продукцію інфекційних частинок вірусу грипу А в клітині тварини в порівнянні з ізогенною клітиною тварини, інфікованою вірусом грипу А, що не має молекули РНК. У ще одному варіанті здійснення 1 UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молекула РНК знижує експресію поліпептиду вірусу грипу А в клітині тварини, інфікованій вірусом грипу А, у порівнянні з ізогенною інфікованою клітиною тварини, що не має молекули РНК. Переважно, вірус грипу А являє собою вірус пташиного грипу. Конструкція нуклеїнової кислоти за винаходом може кодувати будь-який тип молекули РНК, що містить двониткову ділянку. Переважно, довжина двониткової ділянки складає щонайменше 19 п.о. Також переважно, довжина двониткової ділянки складає менше ніж 100 п.о. В особливо переважному варіанті здійснення кодована молекула РНК являє собою коротку РНК-“шпильку" (shРНК). В одному з переважних варіантів здійснення двониткова ділянка, що кодується молекулою РНК, містить послідовність нуклеотидів SEQ ID NO:7. В іншому переважному варіанті здійснення двониткова ділянка, що кодується молекулою РНК, містить послідовність нуклеотидів SEQ ID NO:9. В іншому переважному варіанті здійснення двониткова ділянка, що кодується молекулою РНК, містить послідовність нуклеотидів SEQ ID NO:12. У ще одному переважному варіанті здійснення двониткова ділянка, що кодується молекулою РНК, містить послідовність нуклеотидів SEQ ID NO:6. В одному з переважних варіантів здійснення двониткова ділянка, що кодується молекулою РНК, містить послідовність нуклеотидів SEQ ID NO:8. У ще одному переважному варіанті здійснення двониткова ділянка, що кодується молекулою РНК, містить послідовність нуклеотидів SEQ ID NO:13. У ще одному переважному варіанті здійснення двониткова ділянка, що кодується молекулою РНК, містить послідовність нуклеотидів SEQ ID NO:15. У деяких випадках може бути бажаним, щоб конструкція нуклеїнової кислоти кодувала більше ніж одну молекулу РНК, наприклад, 2, 3, 4, 5 або більше молекул РНК. Відповідно, даний винахід стосується конструкції нуклеїнової кислоти, яка кодує дві або більше молекул РНК. Молекули РНК, що кодуються, можуть бути різними або однаковими або являти собою їхню комбінацію. Крім того, молекули РНК, що кодуються, можуть націлюватися на однакові або різні гени вірусу грипу А, або на їхню комбінацію. В одному з варіантів здійснення кожна молекула РНК містить нуклеотидну послідовність, що відповідає іншому гену вірусу грипу А. Даний винахід, крім того, стосується конструкції нуклеїнової кислоти за винаходом, де кожна молекула РНК кодується нуклеотидною послідовністю, функціонально зв'язаною з промотором РНК полімерази II або з промотором РНК полімерази III. У переважному варіанті здійснення промотори являють собою промотори РНК полімерази III. У деяких випадках може бути бажаним, щоб послідовність промотору була такою ж, як природна послідовність промотору тварини і/або клітини, або її потомства, в яку переноситься/трансформується конструкція нуклеїнової кислоти. В одному з варіантів здійснення промотор являє собою курячий, індичий і/або качиний промотор. Переважно, промотор вибраний із промотору U6, 7SK і/або H1. В одному з конкретних варіантів здійснення промотор U6 являє собою cU6-1, cU6-2, cU6-3 і/або cU6-4. У ще одному конкретному варіанті здійснення промотор містить нуклеотидну послідовність, вибрану з будь-якої послідовності SEQ ID NO:22-25. Автори винаходу несподівано виявили, що конструкції нуклеїнових кислот, які містять промотори U6, що містять мінімальну кількість послідовності промотору, необхідну для індукції транскрипції shРНК, були щонайменше так само ефективні при транскрибуванні shРНК, як і конструкції, що містять промотори U6, з додатковими 100 п.о. послідовності, що знаходиться вище по ходу транскрипції. Відповідно, в одному з варіантів здійснення винаходу промотор складається з нуклеотидної послідовності, вибраної з будь-якої послідовності SEQ ID NO:22-25. У ще одному варіанті здійснення кожна нуклеотидна послідовність, що кодує молекулу РНК, функціонально зв'язана з іншим промотором РНК полімерази III. В одному з варіантів здійснення молекула РНК знижує експресію поліпептиду вірусу грипу А, що кодується будь-якою послідовністю SEQ ID NO:1-5. В одному з конкретних варіантів здійснення поліпептид вірусу грипу А може бути вибраний із PB1, PB2, PA, NP і/або M1. Переважно, поліпептид являє собою поліпептид вірусу пташиного грипу. В одному з варіантів здійснення штам пташиного грипу являє собою високопатогенний штам. Переважно, вірус пташиного грипу являє собою H5N1. В іншому варіанті здійснення конструкція містить лише послідовності вірусу грипу А і 2 UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 природні послідовності тварини-хазяїна. Наприклад, якщо конструкція сконструйована для трансфекції курці, то конструкція нуклеїнової кислоти бажано повинна складатися з послідовностей курей і вірусу грипу А. Тому в одному з варіантів здійснення даний винахід стосується конструкції нуклеїнової кислоти за винаходом, де конструкція складається з нуклеотидних послідовностей курей і вірусу грипу А. У переважному варіанті здійснення конструкція нуклеїнової кислоти за винаходом кодує 3 молекули РНК, що містять двониткову ділянку, де двониткові ділянки містять нуклеотидні послідовності, вибрані з: В іншому переважному варіанті здійснення конструкція нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, вибрану з послідовностей SEQ ID NO:16-21 і 61-63, або їхніх фрагментів, або послідовність, яка щонайменше на 95 % ідентична нуклеотидній послідовності, вибраній із послідовностей SEQ ID NO:16-21 і 61-63. Переважно, фрагмент містить нуклеотидну послідовність, позбавлену 100 нуклеотидів або менше з 5'-кінця і/або 3'-кінця послідовності, ще більш переважно, 50 нуклеотидів або менше з 5'-кінця і/або 3'-кінця послідовності, ще більш переважно, 20 нуклеотидів або менше з 5'-кінця і/або 3'-кінця послідовності, ще більш переважно, 10 нуклеотидів або менше з 5'-кінця і/або 3'-кінця послідовності. Даний винахід, крім того, стосується виділеної і/або екзогенної молекули нуклеїнової кислоти, що містить двониткову ділянку, де двониткова ділянка містить послідовність нуклеотидів, вибрану з: (і) нуклеотидів у положеннях від 2240 до 2341 послідовності SEQ ID NO:1, (ii) нуклеотидів у положеннях від 2257 до 2341 послідовності SEQ ID NO:2, (iii) нуклеотидів у положеннях від 2087 до 2233 послідовності SEQ ID NO:3, (iv) нуклеотидів у положеннях від 1484 до 1565 послідовності SEQ ID NO:4, (v) нуклеотидної послідовності будь-якої з послідовностей SEQ ID NO:6-15 або 52-54, (vi) нуклеотидної послідовності, яка щонайменше на 90 % ідентична будь-якій з (і)-(v), (vii) нуклеотидної послідовності, яка гібридизується з будь-якої з (і)-(v) у жорстких умовах. В одному з варіантів здійснення виділена і/або екзогенна молекула нуклеїнової кислоти знижує реплікацію вірусу грипу А в клітині тварини в порівнянні з ізогенною інфікованою вірусом грипу А клітиною тварини, що не містить молекули нуклеїнової кислоти. В іншому варіанті здійснення виділена і/або екзогенна молекула нуклеїнової кислоти знижує продукцію інфекційних частинок вірусу грипу А в клітині тварини в порівнянні з ізогенною клітиною тварини, інфікованою вірусом грипу А, що не містить молекули нуклеїнової кислоти. У ще одному варіанті здійснення виділена і/або екзогенна молекула нуклеїнової кислоти знижує експресію поліпептиду вірусу грипу А в клітині тварини, інфікованій вірусом грипу А, у порівнянні з ізогенною інфікованою вірусом грипу А клітиною тварини, що не містить молекули нуклеїнової кислоти. В іншому варіанті здійснення виділена і/або екзогенна молекула нуклеїнової кислоти за винаходом знижує експресію поліпептиду вірусу грипу А, що кодується будь-якою послідовністю SEQ ID NO:1-5. Переважно, довжина двониткової ділянки виділеної і/або екзогенної молекули нуклеїнової кислоти складає щонайменше 19 п.о. У деяких варіантах здійснення, переважно, довжина двониткової ділянки складає менше ніж 100 п.о. В одному з варіантів здійснення виділена і/або екзогенна молекула нуклеїнової кислоти містить двониткову РНК. Переважно, виділена і/або екзогенна молекула нуклеїнової кислоти являє собою інтерферувальну коротку РНК або коротку РНК-“шпильку". В одному з переважних варіантів здійснення виділена і/або екзогенна молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, вибрану з послідовностей SEQ ID NO:16-21 і 61-63, або їхніх фрагментів, або послідовність, яка щонайменше на 95 % ідентична нуклеотидній послідовності, вибраній із послідовностей SEQ ID NO:16-21 і 61-63. Переважно, фрагмент містить нуклеотидну послідовність, позбавлену 100 нуклеотидів або менше з 5'-кінця і/або 3'кінця послідовності, ще більш переважно, 50 нуклеотидів або менше з 5'-кінця і/або 3'-кінця послідовності, ще більш переважно, 20 нуклеотидів або менше з 5'-кінця і/або 3'-кінця послідовності, ще більш переважно, 10 нуклеотидів або менше з 5'-кінця і/або 3'-кінця послідовності. В одному з варіантів здійснення даного винаходу конструкція нуклеїнової кислоти і/або виділена і/або екзогенна молекула нуклеїнової кислоти присутня в геномі клітини. 3 UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід, крім того, стосується вектора, що містить конструкцію нуклеїнової кислоти за винаходом, і/або виділеної, і/або екзогенної молекули нуклеїнової кислоти за винаходом. Даний винахід, крім того, стосується клітини, що містить конструкцію нуклеїнової кислоти, виділену і/або екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, і/або вектор за винаходом. В одному з варіантів здійснення клітина являє собою примордіальну зародкову клітину, наприклад, курячу примордіальну зародкову клітину. Даний винахід, крім того, стосується трансгенного організму, що не є організмом людини, який містить конструкцію нуклеїнової кислоти, виділену і/або екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, вектор і/або клітину за винаходом. Трансгенний організм може являти собою будь-який організм, наприклад, тварину або рослину. В одному з варіантів здійснення трансгенний організм являє собою тварину, за винятком людини. В іншому варіанті здійснення трансгенний організм являє собою птаха. У переважному варіанті здійснення трансгенний організм являє собою свійських птахів. У ще більш переважному варіанті здійснення, трансгенний організм являє собою курку, індичку або качку. В одному з варіантів здійснення трансгенний організм за винаходом містить нуклеотидну послідовність, вибрану з послідовностей SEQ ID NO:16-21 і 61-63, або їхніх фрагментів, або послідовність, яка щонайменше на 95 % ідентична нуклеотидній послідовності, вибраній із послідовностей SEQ ID NO:16-21 і 61-63, що кодує щонайменше одну молекулу РНК, яка містить двониткову ділянку. Фрагменти і/або послідовності, тісно зв'язані з послідовностями SEQ ID NO:16-21 і 61-63, охоплюються цим варіантом здійснення, оскільки 5'-ділянки і/або 3'ділянки конструкції можуть бути втрачені при інтеграції в геном організму, і/або невеликі мутації під час клітинного поділу по багатьох поколіннях можуть призвести до однієї або декількох відмінностей нуклеотидів у порівнянні з початковою конструкцією. Переважно, фрагмент містить нуклеотидну послідовність, позбавлену 100 нуклеотидів або менше з 5'-кінця і/або 3'-кінця послідовності, ще більш переважно, 50 нуклеотидів або менше з 5'-кінця і/або 3'-кінця послідовності, ще більш переважно, 20 нуклеотидів або менше з 5'-кінця і/або 3'-кінця послідовності, ще більш переважно, 10 нуклеотидів або менше з 5'-кінця і/або 3'-кінця послідовності. У ще одному варіанті здійснення трансгенний організм містить дві або більше конструкції нуклеїнових кислот за винаходом. Даний винахід, крім того, стосується композиції, що містить конструкцію нуклеїнової кислоти за винаходом, виділену і/або екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти за винаходом, вектор за винаходом, клітину за винаходом і/або молекулу нуклеїнової кислоти за винаходом. Конструкції нуклеїнових кислот, виділені і/або екзогенні молекули нуклеїнової кислоти, вектори і клітини-хазяїни за винаходом можуть використовуватися для лікування і/або профілактики інфікування індивіда вірусом грипу А. Наприклад, конструкції нуклеїнових кислот, виділені і/або екзогенні молекули нуклеїнової кислоти, вектори і клітини-хазяїни можуть використовуватися для захисту свійських птахів, таких як, але ними не обмежуючись, курка, індичка або качка, від пташиного грипу. Крім того, у випадку локалізованого спалаху пташиного грипу в популяції птахів, може бути бажаним захист від інфекції птахів у навколишніх ділянках, наприклад, на прилеглих фермах, для посилення стримування спалаху пташиного грипу. Таким чином, даний винахід, крім того, стосується способу лікування і/або профілактики інфікування індивіда вірусом грипу А, причому спосіб включає введення індивіду конструкції нуклеїнової кислоти за винаходом, виділеної і/або екзогенної молекули нуклеїнової кислоти за винаходом, вектора за винаходом і/або клітини за винаходом. В одному з варіантів здійснення спосіб включає введення конструкції нуклеїнової кислоти, виділеної і/або екзогенної молекули нуклеїнової кислоти, вектора і/або клітини в питній воді або аерозолі. В одному з конкретних варіантів здійснення вірус грипу А являє собою вірус пташиного грипу. Переважно, вірус пташиного грипу належить до високопатогенного штаму. У найбільш переважному варіанті здійснення вірус пташиного грипу являє собою вірус штаму H5N1. Переважно, індивідом є птах, переважно, свійські птахи. У найбільш переважному варіанті здійснення індивідом є курка, індичка або качка. Даний винахід, крім того, стосується способу зниження експресії одного або декількох генів вірусу грипу А в клітині, причому спосіб включає введення в клітину виділеної і/або екзогенної молекули нуклеїнової кислоти за винаходом. Даний винахід, крім того, стосується застосування конструкції нуклеїнової кислоти за 4 UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходом, виділеної і/або екзогенної молекули нуклеїнової кислоти за винаходом, вектора за винаходом, і/або клітини за винаходом при виготовленні лікарського засобу для лікування і/або профілактики інфікування вірусом грипу А. Даний винахід, крім того, стосується способу ідентифікації тварини, що містить конструкцію нуклеїнової кислоти за винаходом, і/або виділену і/або екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти за винаходом, причому спосіб включає: визначення присутності або відсутності конструкції за винаходом або виділеної і/або екзогенної молекули нуклеїнової кислоти за винаходом у зразку, одержаному у тварини. В одному з варіантів здійснення спосіб включає ампліфікацію конструкції нуклеїнової кислоти або її фрагмента, або виділеної і/або екзогенної молекули нуклеїнової кислоти або її фрагмента. В іншому варіанті здійснення спосіб включає: приведення зразка, взятого у тварини, у контакт із зондом, який гібридизується в жорстких умовах з конструкцією нуклеїнової кислоти або з виділеною і/або екзогенною молекулою нуклеїнової кислоти з утворенням комплексу, і визначення присутності або відсутності комплексу. Даний винахід, крім того, стосується способу виведення стійкої до грипу трансгенної тварини, за винятком людини, причому спосіб включає: (і) введення конструкції нуклеїнової кислоти за винаходом в клітину тварини, за винятком людини, (ii) вибір трансгенної клітини, що не є клітиною людини, яка містить конструкцію нуклеїнової кислоти, (iii) регенерацію трансгенної тварини, за винятком людини, із трансгенної клітини, що не є клітиною людини, (iv) виведення трансгенної тварини, за винятком людини, для одержання трансгенного потомства і (v) добір трансгенного потомства, яке стійке до грипу. Даний винахід, крім того, стосується способу одержання харчового продукту, причому спосіб включає: (і) введення конструкції нуклеїнової кислоти за винаходом в клітину тварини, (ii) вибір трансгенної клітини, що містить конструкцію нуклеїнової кислоти, (iii) регенерацію трансгенної тварини з трансгенної клітини, (iv) виведення трансгенної тварини для одержання трансгенного потомства і (v) одержання харчового продукту з трансгенного потомства. В одному з варіантів здійснення харчовий продукт вибраний із м'яса та яєць. Даний винахід, крім того, стосується способу одержання стійкої до грипу трансгенної тварини, за винятком людини, що включає: (і) введення в клітину першої нуклеїнової кислоти, що містить транспозон, де нуклеїнова кислота кодує молекулу двониткової РНК, (ii) введення в клітину другої нуклеїнової кислоти, що кодує транспозазу, (ii) вибір трансгенної клітини, що містить першу нуклеїнову кислоту в геномі клітини, (iii) регенерацію трансгенної тварини, за винятком людини, із клітини, і (iv) виведення трансгенної тварини, за винятком людини. Перша і друга нуклеїнові кислоти можуть бути введені в клітину на одну молекулу нуклеїнової кислоти або, альтернативно, можуть бути введені в клітину на окремі молекули нуклеїнової кислоти. Переважно, першу і другу нуклеїнові кислоти вводять у клітину на окремі молекули нуклеїнової кислоти. В одному з варіантів здійснення транспозон являє собою транспозон Tol2, а транспозаза являє собою транспозазу Tol2. У ще одному варіанті здійснення клітина являє собою курячу примордіальну зародкову клітину. Даний винахід, крім того, стосується резистентної до грипу трансгенної тварини, за винятком людини. В одному з варіантів здійснення трансгенна тварина містить конструкцію нуклеїнової кислоти, що кодує молекулу РНК, яка містить двониткову ділянку, де молекула РНК знижує реплікацію вірусу грипу в клітині тварини в порівнянні з інфікованою вірусом грипу ізогенною клітиною тварини, що не містить молекули РНК. В іншому варіанті здійснення трансгенна тварина містить конструкцію нуклеїнової кислоти, що кодує молекулу РНК, яка містить двониткову ділянку, де молекула РНК знижує продукцію частинок вірусу грипу в клітині тварини в порівнянні з інфікованою вірусом грипу ізогенною 5 UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітиною тварини, що не містить молекули РНК. В іншому варіанті здійснення трансгенна тварина містить конструкцію нуклеїнової кислоти, що кодує молекулу РНК, яка містить двониткову ділянку, де молекула РНК знижує експресію поліпептиду в інфікованій вірусом грипу клітині в порівнянні з інфікованою вірусом грипу ізогенною клітиною тварини, що не містить молекули РНК. У ще одному з варіантів здійснення трансгенна тварина, за винятком людини, являє собою курку, а грип являє собою грип А. Переважно, трансгенний організм, за винятком людини, містить конструкцію нуклеїнової кислоти за винаходом, виділену або екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти за винаходом, вектор за винаходом і/або клітину за винаходом. Даний винахід, крім того, стосується застосування трансгенної тварини, за винятком людини, за винаходом або трансгенного організму, за винятком людини, за винаходом для виведення. Даний винахід, крім того, стосується застосування трансгенної тварини, за винятком людини, за винаходом або трансгенного організму, за винятком людини, за винаходом для одержання харчового продукту. Очевидно, що переважні ознаки і характеристики одного з аспектів винаходу можуть використовуватися у великій кількості інших аспектів винаходу. У даному описі слово "містити" або його варіанти, такі як "містить" або "що містить" означає включення зазначених елементів, цілих чисел або стадій, або груп елементів, цілих чисел або стадій, але не виключення будь-якого іншого елемента, цілого числа або стадії, або груп елементів, цілих чисел або стадій. Винахід нижче описаний шляхом таких не обмежувальних прикладів із посиланням на супровідні креслення. Стислий опис креслень Фіг. 1. PCR для касет для експресії shРНК. Схематичне зображення стратегії PCR, що використовується для одержання векторів експресії shРНК. У PCR використовувалися прямі праймери, спарені зі зворотними праймерами, що містять усі компоненти shРНК. Усі кінцеві продукти PCR складалися з курячого промотору U6 або 7SK, смислової shРНК, петлі, антисмислової shРНК, кінцевої послідовності і сайта XhoІ. Фіг. 2. Конструкція трансгена MWH-1. А, окремі одиниці транскрипції були одержані з використанням підходу з використанням PCR за один етап. Продукти PCR містять курячий промотор pol III і компоненти shРНК (смислову, петельну, антисмислову і кінцеву послідовності). В, ці три транскрипційні одиниці лігувалися разом із використанням сумісних сайтів SalІ і XhoІ на 5'-кінці і 3'-кінці продуктів PCR. С, кінцевий трансген містить три транскрипційні одиниці, які експресують 3 окремі shРНК до цільових генів вірусу грипу А. Фіг. 3. Плазмідна карта pStuffit (6151 п.о.). На карті мають мітку і заштриховані 4 клоновані ділянки курячого геному. Зазначені сайти рестрикції клонування, а також інші релевантні сайти рестрикції. Трансгени MWH вставлені в незвичайний сайт EcoRI, розташований між ME1 200 і GRM5 200. Сайти ферменту HindIII pIC20H можуть використовуватися для ексцизії всіх трансгенів MWH, включаючи заповнювальну/буферну фланкувальну послідовність у вигляді одиничного фрагмента для вставки в геном курки. Фіг. 4. Контрольне зараження вірусом грипу трансгенних мишей. А, зміна маси в % у мишей, що експресують shNP-1496, у порівнянні з мишами, що експресують shEGFP. В. Відносна вірусна експресія гена у мишей, що експресують shNP-1496, у порівнянні з мишами, що експресують shEGFP. Покажчик до списку послідовностей SEQ ID NO:1 – Консенсусна нуклеотидна послідовність гена PB2 вірусу грипу А. SEQ ID NO:2 – Консенсусна нуклеотидна послідовність гена PB1 вірусу грипу А. SEQ ID NO:3 – Консенсусна нуклеотидна послідовність гена РА вірусу грипу А. SEQ ID NO:4 – Консенсусна нуклеотидна послідовність гена NP вірусу грипу А. SEQ ID NO:5 – Консенсусна нуклеотидна послідовність гена M1 вірусу грипу А. SEQ ID NO:6-15 – Нуклеотидна послідовність молекул нуклеїнової кислоти, які націлені на гени вірусу грипу А і/або кодовану ними мРНК. SEQ ID NO:16 – Нуклеотидна послідовність MWH1 і послідовності наповнювачів. Наповнювач 5' (нуклеотиди 1-1748); cU6-3 shMP-592 (нуклеотиди 1759-2234); cU6-1 shPA-2087 (нуклеотиди 2235-2622); cU6-4 shNP-1496 (нуклеотиди 2623-2974); наповнювач 3' (нуклеотиди 2985-4745). SEQ ID NO:17 – Нуклеотидна послідовність MWH2 і послідовності наповнювачів. Наповнювач 5' (нуклеотиди 1-1748); cU6-4 shPB1-2257 (нуклеотиди 1774-2125); cU6-1 shPB2 6 UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2240 (нуклеотиди 2126-2513); c7SK shPB1-129 (нуклеотиди 2514-2911); наповнювач 3' (нуклеотиди 2936-4696). SEQ ID NO:18 – Нуклеотидна послідовність MWH3 і послідовності наповнювачів. Наповнювач 5' (нуклеотиди 1-1748); cU6-4 shNP-1484 (нуклеотиди 1774-2129); cU6-1 shPA-2087 (нуклеотиди 2130-2517); c7SK shPB1-2257 (нуклеотиди 2518-2917); наповнювач 3' (нуклеотиди 2947-4702). SEQ ID NO:19 – Нуклеотидна послідовність MWH1. SEQ ID NO:20 – Нуклеотидна послідовність MWH2. SEQ ID NO:21 – Нуклеотидна послідовність MWH3. SEQ ID NO:22 – Нуклеотидна послідовність курячого промотору U6-1 (cU6-1). SEQ ID NO:23 – Нуклеотидна послідовність курячого промотору U6-3 (cU6-3). SEQ ID NO:24 – Нуклеотидна послідовність курячого промотору U6-4 (cU6-4). SEQ ID NO:25 – Нуклеотидна послідовність курячого промотору 7SK. SEQ ID NO:26-51 – Олігонуклеотидні праймери. SEQ ID NO:52-54 – Нуклеотидні послідовності молекул нуклеїнової кислоти, які націлені на гени вірусу грипу А, і/або мРНК, кодовану ними. SEQ ID NO:55-60 – Олігонуклеотидні праймери. SEQ ID NO:61 – Нуклеотидна послідовність MWH4. SEQ ID NO:62 – Нуклеотидна послідовність MWH3 і транспозона Tol2. SEQ ID NO:63 – Нуклеотидна послідовність MWH4 і транспозона Tol2. Детальний опис винаходу Загальні методики та вибрані визначення Якщо немає конкретних вказівок, то всі технічні і наукові терміни, що використовуються в даному описі, мають ті самі значення, які зрозумілі середньому фахівцю в даній галузі (наприклад, у галузі клітинних культур, молекулярної генетики, вірусології, імунології, імуногістохімії, білкової хімії і біохімії). Якщо немає конкретних вказівок, то методики молекулярної біології, вірусології, клітинної культури та імунології, що використовуються в даному винаході, являють собою стандартні процедури, добре відомі фахівцям у даній галузі. Такі методики описані і пояснені в літературі в таких джерелах, як J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 14, IRL Press (1995 і 1996), і F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включаючи всі удосконалення дотепер), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), та J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (включаючи всі удосконалення дотепер), і включені в даний опис шляхом посилання. Використовувані в даному описі терміни "лікування", "лікувати" або "оброблення" включають введення терапевтично ефективної кількості конструкції нуклеїнової кислоти, вектора, клітини і/або молекули нуклеїнової кислоти за винаходом, достатньої для зниження або усунення щонайменше одного симптому інфекції, викликаної вірусом грипу А, зокрема, інфекції, викликаної вірусом пташиного грипу. Термін "профілактика" стосується захисту індивіда, що піддається впливу вірусу грипу А, від розвитку щонайменше одного симптому інфекції, викликаної вірусом грипу А, або зниження тяжкості симптому інфекції в індивіда, що піддається впливу вірусу грипу А. Як використовується в даному винаході, у тварини, "резистентної" до вірусного патогену, відзначають зменшення або відсутність симптомів захворювання в порівнянні зі сприйнятливою твариною, при впливі вірусного патогену, наприклад, при впливі вірусу грипу. Використовуваний у даному описі термін "пташиний" стосується будь-якого виду, підвиду або породи організму таксономічного класу Aves (птахи), такі як, але ними не обмежуючись, курка, індичка, качка, гуска, перепел, фазани, папуги, в'юрки, соколи, ворони і безкільові птахи, включаючи страуса, ему і казуара. Цей термін включає різні відомі лінії Gallus gallus (кури), наприклад, білі леггорни, коричневі леггорни, смугасті, сассекські, ньюгемпширські, родайлендські, австралорпські, корнішські, міноркські, амрокські, каліфорнійські сірі, італійські оранжеві, а також лінії індичок, фазанів, перепелів, качок, страусів та інших свійських птахів, яких розводять у промислових кількостях. Термін "свійські птахи" включає усіх птахів, що утримуються, яких розводять або одомашнених для одержання м'яса або яєць, наприклад, курей, індичок, страусів, диких курей, голубів, цесарок, фазанів, перепелів, качок, гусок і ему. 7 UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Використовуваний у даному описі термін "вірус пташиного грипу" стосується будь-якого вірусу грипу А, який може інфікувати птахів. Приклади вірусів пташиного грипу включають, але ними не обмежуються, будь-які один або декілька з підтипів Н1-Н16 і N1-N9, і включають високопатогенні і низькопатогенні штами. В одному з варіантів здійснення вірус пташиного грипу належить до підтипу Н5. В іншому варіанті здійснення вірус пташиного грипу належить до підтипу Н7. В іншому варіанті здійснення вірус пташиного грипу належить до підтипу H5N1. Термін "поліпептид вірусу грипу А" стосується будь-якого білка, який кодується геном вірусу грипу А, наприклад, PB1, PB1-F2, PB2, полімерази РА (РА), гемаглютиніну (НА), нуклеокапсидного білка (NP), нейрамінідази (NA), матричного білка 1 (М1), матричного білка 2 (М2), неструктурного білка 1 (NS1) і неструктурного білка 2 (NS2). Використовуваний у даному описі термін "реплікація вірусу" стосується ампліфікації вірусного геному в клітині-хазяїні. Під використовуваним у даному описі терміном "частинка вірусу" слід розуміти всю структуру вірусу, що містить нуклеїнову кислоту, оточену білковою капсулою або капсидом. Деякі частинки вірусу також включають глікопротеїнову оболонку, що оточує білкову капсулу, і в цьому випадку термін "частинка вірусу" також включає оболонку вірусу. "Інфекційна частинка вірусу" здатна проникати в клітину організму і реплікуватися в ній. Під терміном "знижує експресію" або "зниження експресії" поліпептиду або гена мають на увазі, що відбувається супресія регуляції або інгібування трансляції поліпептидної послідовності і/або транскрипції нуклеотидної послідовності. Ступінь супресії регуляції або інгібування застосовують у залежності від природи і кількості конструкції нуклеїнової кислоти або молекул нуклеїнової кислоти, введених клітині-хазяїну, ідентичності, природи і рівня молекули (молекул) РНК, експресованих з конструкції, часу після введення, тощо, але очевидно, наприклад, у вигляді виявлюваного зменшення експресії білка гена-мішені і/або зв'язаної мішені або клітинної функції, або, наприклад, зменшення рівня вірусної реплікації, тощо; бажано, ступінь інгібування складає більше ніж 10 %, 33 %, 50 %, 75 %, 90 %, 95 % або 99 %, у порівнянні з клітиною, не обробленою відповідно до даного винаходу. Використовуваний у даному описі термін "індивід" стосується тварини, наприклад, птаха або ссавця. В одному з варіантів здійснення індивідом є людина. В інших варіантах здійснення індивідом може бути птах, наприклад, свійські птахи, такі як курка, індичка або качка. "Зразок" стосується матеріалу, що, як припускають, містить конструкцію нуклеїнової кислоти, молекули нуклеїнової кислоти, вектори і/або клітини за винаходом. Зразок може бути взятий безпосередньо з джерела або після щонайменше однієї стадії (часткової) очищення. Зразок може бути одержаний у будь-якому придатному середовищі, яке не заважає проведенню способу за винаходом. Звичайно, зразок являє собою водний розчин або біологічну рідину, як більш детально описано нижче. Зразок може бути одержаний із будь-якого джерела, такого як фізіологічна рідина, включаючи кров, сироватку, плазму, слину, мокротиння, рідину очних лінз, потову рідину, фекалії, сечу, молоко, асцитичну рідину, слиз, синовіальну рідину, рідину черевної порожнини, трансдермальні ексудати, глоткові ексудати, бронхоальвеолярний лаваж, трахеальні аспірації, спинномозкову рідину, сім'яну рідину, слиз шийки матки, виділення з піхви або уретри, амніотичну рідину, тощо. В одному з варіантів здійснення зразок являє собою кров або її фракцію. Попереднє оброблення може включати, наприклад, одержання плазми з крові, розведення в'язкої рідини, тощо. Способи оброблення можуть включати фільтрування, перегонку, сепарування, концентрування, інактивацію компонентів, що заважають, і додавання реагентів. Вибір і попереднє оброблення біологічних зразків перед тестуванням добре відомі в даній галузі і не вимагають додаткового опису. Використовуваний у даному описі термін "транспозон" стосується генетичного елемента, який може рухатися (зміщуватися) з одного положення в інше в межах геному організму способами, які не вимагають ні великої гомології послідовностей ДНК між транспозоном і сайтом вставки, ні рекомбінаційних ферментів для класичного гомологічного кросинговеру. Використовуваний у даному описі термін "ізогенні" стосується організмів або клітин, які характеризуються по суті ідентичною геномною ДНК, наприклад, геномна ДНК щонайменше приблизно на 92 %, переважно, щонайменше приблизно на 98 %, найбільш переважно, щонайменше приблизно на 99 % ідентична геномній ДНК ізогенного організму або клітини. Використовуваний у даному описі термін "введення, впровадження", що стосується конструкції нуклеїнової кислоти або молекули нуклеїнової кислоти, слід розуміти в найширшому можливому значенні, і він включає будь-який спосіб, що призводить до одержання конструкції нуклеїнової кислоти або молекули нуклеїнової кислоти, присутніх у клітині або організмі. Наприклад, конструкція нуклеїнової кислоти або молекула нуклеїнової кислоти можуть бути доставлені в клітину у вигляді депротеїнізованої ДНК за допомогою будь-якої придатної 8 UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 методики трансфекції або трансформації, такої як, наприклад, електропорація. Альтернативно, конструкція нуклеїнової кислоти або молекула нуклеїнової кислоти можуть бути вставлені в геном і/або експресовані трансгеном у клітині. Інтерференція РНК Терміни "інтерференція РНК", "РНКі" або "одержання мовчазного гена" стосуються, як правило, способу, при якому молекула двониткової РНК пригнічує експресію послідовності нуклеїнової кислоти, з якою молекула двониткової РНК має суттєву або повну гомологію. Однак пізніше було показано, що інтерференції РНК можна досягти з використанням двониткових молекул, що не є молекулами РНК (див., наприклад, заявку на патент США 20070004667). Даний винахід включає молекули нуклеїнової кислоти, що містять і/або кодують двониткові ділянки для інтерференції РНК. Молекули нуклеїнової кислоти звичайно являють собою РНК, але можуть містити хімічно модифіковані нуклеотиди і ненуклеотиди. Двониткові ділянки повинні являти собою щонайменше 19 суміжних нуклеотидів, наприклад, приблизно 19-23 нуклеотиди, або можуть бути довшими, наприклад, 30 або 50 нуклеотидів, або 100 нуклеотидів, або більше. Може використовуватися повнорозмірна послідовність, що відповідає всьому транскрипту гена. Переважно, двониткові ділянки мають довжину від приблизно 19 до приблизно 23 нуклеотидів. Ступінь ідентичності двониткової ділянки молекули нуклеїнової кислоти з транскриптоммішенню повинен складати щонайменше 90 %, а ще більш переважно, 95-100 %. Молекула нуклеїнової кислоти може, звичайно, містити незв'язані послідовності, які можуть функціонувати для стабілізації молекули. Використовуваний у даному описі термін "коротка інтерферувальна РНК" або "sіРНК" стосується молекули нуклеїнової кислоти, яка містить рибонуклеотид, здатний інгібувати або пригнічуванням регулювати експресію гена, наприклад, шляхом опосередкування РНКі специфічним для послідовності чином, де двониткова частина має довжину менше ніж 50 нуклеотидів, переважно, довжину від приблизно 19 до приблизно 23 нуклеотидів. Наприклад, sіРНК може являти собою молекулу нуклеїнової кислоти, що містить аутокомплементарні смислові та антисмислові ділянки, де антисмислова ділянка містить нуклеотидну послідовність, яка комплементарна нуклеотидній послідовності в молекулі-мішені нуклеїнової кислоти або її частини, і смислову ділянку, що має нуклеотидну послідовність, яка відповідає молекулі-мішені нуклеїнової кислоти або її частини. sіРНК може бути зібрана з двох окремих олігонуклеотидів, де одна нитка являє собою смислову нитку, а інша являє собою антисмислову нитку, де антисмислова і смислова нитки є аутокомплементарними. Використовуваний у даному описі термін "sіРНК" еквівалентний іншим термінам, використовуваним для опису молекул нуклеїнової кислоти, які здатні опосередковувати специфічну для послідовності РНКі, наприклад, мікро-РНК (міРНК), коротку "шпильку" РНК (shРНК), короткий інтерферувальний олігонуклеотид, коротку інтерферувальну нуклеїнову кислоту (siNA), короткий інтерферувальний модифікований олігонуклеотид, хімічно модифіковану sіРНК, посттранскрипційну РНК, що викликає мовчання гена (рtgsРНК), та інші. Крім того, використовуваний у даному описі термін РНКі еквівалентний іншим термінам, що використовуються для опису специфічної для послідовності інтерференції РНК, такої як посттранскрипційний виклик мовчання гена, транскрипційне інгібування або епігенетика. Наприклад, молекули sіРНК за винаходом можуть використовуватися для епігенетично мовчазних генів, або на посттранскрипційному рівні або на претранскрипційному рівні. У необмежувальному прикладі, епігенетична регуляція експресії гена молекулами sіРНК за винаходом може відбуватися в результаті опосередкованої sіРНК модифікації структури хроматину для зміни експресії гена. Під "shРНК" або "короткою "шпилькою" РНК" розуміють молекулу РНК, у якій менше ніж приблизно 50 нуклеотидів, переважно, від приблизно 19 до приблизно 23 нуклеотидів, спарені основами з комплементарною послідовністю, розташованою на тій же молекулі РНК, і де зазначена послідовність і комплементарна послідовність розділені неспареною ділянкою щонайменше від приблизно 4 до приблизно 15 нуклеотидів, яка утворює однониткову петлю над стовбуровою структурою, створеною двома ділянками комплементарності основ. Приклад послідовності однониткової петлі включає: 5' UUCAAGAGA 3'. Вбудовані shРНК являють собою подвійні або двопальцеві і багатопальцеві "шпильки" dsРНК, в яких молекула РНК містить дві або більше такі стовбурово-петельні структури, розділені однонитковими спейсерними ділянками. Після конструювання молекули нуклеїнової кислоти, що містять двониткову ділянку, можна одержувати будь-яким способом, відомим у даній галузі, наприклад, транскрипцією in vitro, рекомбінантно або синтетичним засобом. 9 UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Модифікації або аналоги нуклеотидів можуть бути введені для поліпшення властивостей молекул нуклеїнової кислоти за винаходом. Поліпшені властивості включають підвищену стійкість до нуклеази і/або підвищену здатність проникати через клітинні мембрани. Відповідно, терміни "молекула нуклеїнової кислоти" і "молекула двониткової РНК" включають синтетично модифіковані основи, такі як, але ними не обмежуючись, інозин, ксантин, гіпоксантин, 2аміноаденін, 6-метил-, 2-пропіл- та інші алкіладеніни, 5-галоїдурацил, 5-галоїдцитозан, 6азацитозин і 6-азатимін, псевдоурацил, 4-тіоурацил, 8-галоїдаденін, 8-аміноаденін, 8-тіоладенін, 8-тіоалкіладеніни, 8-гідроксиладенін та інші 8-заміщені аденіни, 8-галоїдгуаніни, 8-аміногуанін, 8-тіолгуанін, 8-тіоалкілгуаніни, 8-гідроксилгуанін та інші заміщені гуаніни, інші аза- і деазааденіни, інші аза- і деазагуаніни, 5-трифторметилурацил і 5-трифторцитозин. Нуклеїнові кислоти Під "виділеною молекулою нуклеїнової кислоти" розуміють молекулу нуклеїнової кислоти, яка по суті була відділена від нуклеотидних послідовностей, з якими вона зв'язана, або зв'язана у своєму природному стані (якщо він взагалі існує в природі). Переважно, виділена молекула нуклеїнової кислоти щонайменше на 60 % позбавлена, ще більш переважно, щонайменше на 75 % позбавлена, а ще більш переважно, щонайменше на 90 % позбавлена інших компонентів, з якими вона природно зв'язана. Крім того, термін "молекула нуклеїнової кислоти" у даному описі використовується як взаємозамінний з терміном "полінуклеотид". Термін "екзогенна" у контексті нуклеїнової кислоти стосується нуклеїнової кислоти (включаючи конструкцію нуклеїнової кислоти за винаходом), коли вона присутня в клітині, або в безклітинній експресійній системі, у зміненій кількості, у порівнянні з її природним станом. В особливо переважному варіанті здійснення клітина являє собою клітину, яка в природі не містить нуклеїнову кислоту або конструкцію нуклеїнової кислоти. Терміни "молекула нуклеїнової кислоти" або "полінуклеотид" стосуються олігонуклеотиду, полінуклеотиду або будь-якого їхнього фрагмента. Це може бути ДНК або РНК геномного або синтетичного походження, і комбінується з вуглеводом, ліпідами, білком або іншими матеріалами для реалізації конкретної активності, визначеної в даному описі. Відсоток (%) ідентичності молекули нуклеїнової кислоти визначається аналізом GAP (Needleman and Wunsch, 1970) (програма GCG) зі штрафом за пропуск =5 і штрафом за подовження =0,3. Досліджувана послідовність має довжину щонайменше 19 нуклеотидів, і аналіз GAP вирівнює дві послідовності по ділянці щонайменше 19 нуклеотидів. Альтернативно, досліджувана послідовність має довжину щонайменше 150 нуклеотидів, і аналіз GAP вирівнює дві послідовності по ділянці щонайменше 150 нуклеотидів. Альтернативно, досліджувана послідовність має довжину щонайменше 300 нуклеотидів, і аналіз GAP вирівнює дві послідовності по ділянці щонайменше 300 нуклеотидів. Переважно, дві послідовності вирівнюють по всій їхній довжині. У відношенні визначених молекул нуклеїнової кислоти слід розуміти, що величини % ідентичності, які перевищують зазначені вище, включають переважні варіанти здійснення. Таким чином, коли це застосовне, у світлі величин мінімального % ідентичності, бажано, щоб молекула нуклеїнової кислоти містила нуклеотидну послідовність, яка щонайменше на 90 %, ще більш переважно, щонайменше на 91 %, ще більш переважно, щонайменше на 92 %, ще більш переважно, щонайменше на 93 %, ще більш переважно, щонайменше на 94 %, ще більш переважно, щонайменше на 95 %, ще більш переважно, щонайменше на 96 %, ще більш переважно, щонайменше на 97 %, ще більш переважно, щонайменше на 98 %, ще більш переважно, щонайменше на 99 %, ще більш переважно, щонайменше на 99,1 %, ще більш переважно, щонайменше на 99,2 %, ще більш переважно, щонайменше на 99,3 %, ще більш переважно, щонайменше на 99,4 %, ще більш переважно, щонайменше на 99,5 %, ще більш переважно, щонайменше на 99,6 %, ще більш переважно, щонайменше на 99,7 %, ще більш переважно, щонайменше на 99,8 %, а найбільш переважно, щонайменше на 99,9 % ідентична релевантній номінованій SEQ ID NO. Молекула нуклеїнової кислоти за даним винаходом може селективно гібридизуватися з полінуклеотидом, який кодує поліпептид вірусу грипу А в жорстких умовах. Використовувані в даному описі жорсткі умови являють собою умови, при яких (1) використовується низька іонна сила і висока температура для промивання, наприклад, 0,015 M NaCl/0,0015 M цитрат натрію/0,1 % NaDodSO4 при 50ºС; (2) використовується під час гібридизації денатурувальний агент, такий як формамід, наприклад, 50 % (об./об.) формамід з 0,1 % бичачим сироватковим альбуміном, 0,1 % Фіколлом, 0,1 % полівінілпіролідоном, буфером 50 мМ фосфату натрію при рН 6,5 з 750 мМ NaCl, 75 мМ цитрату натрію при 42ºС, або (3) використовується 50 % формамід, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M цитрату натрію), 50 мМ фосфату натрію (рН 6,8), 0,1 % пірофосфат натрію, 5 × розчину Denhardt, ДНК обробленої ультразвуком сперми лосося (50 10 UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 г/мл), 0,1 % SDS і 10 % декстран сульфат при 42ºС в 0,2 × SSC і 0,1 % SDS. Молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом можуть, у порівнянні з природними молекулами, мати ділянки (наприклад, природні промотори), які мають одну або декілька мутацій, що являють собою делеції, вставки або заміщення нуклеотидних залишків. Мутанти можуть бути або природними (тобто, виділеними з природного джерела), або синтетичними (наприклад, одержаними виконанням сайт-спрямованого мутагенезу на нуклеїновій кислоті, як описано вище). Таким чином, очевидно, що полінуклеотиди за винаходом можуть бути або природними, або рекомбінантними. Звичайно мономери нуклеїнової кислоти зв'язані зв'язками складного фосфодіефіру або його аналогів з утворенням олігонуклеотидів у діапазоні розміру від відносно коротких мономерних одиниць, наприклад, 12-18, до декількох сотень мономерних одиниць. Аналоги зв'язків складного фосфодіефіру включають: фосфортіоат, фосфордитіоат, фосфорселеноат, фосфордиселеноат, фосфоранілотіоат, фосфоранілідат, фосфорамідат. Конструкції нуклеїнових кислот Використовуваний у даному описі термін "конструкція нуклеїнової кислоти" стосується будьякої молекули нуклеїнової кислоти, яка кодує молекулу двониткової РНК, як визначено в даному описі, і включає молекулу нуклеїнової кислоти у векторі, молекулу нуклеїнової кислоти, якщо вона присутня в клітині у вигляді молекули позахромосомної нуклеїнової кислоти, і молекулу нуклеїнової кислоти, яка інтегрована в геном. Звичайно конструкція нуклеїнової кислоти являє собою двониткову ДНК або двониткову РНК або їхню комбінацію. Крім того, конструкція нуклеїнової кислоти звичайно містить придатний промотор, функціонально зв'язаний з відкритою рамкою зчитування, що кодує двониткову РНК. Конструкція нуклеїнової кислоти може містити першу рамку зчитування, що кодує першу одну нитку молекули двониткової РНК, причому комплементарна (друга) нитка кодується другою відкритою рамкою зчитування іншої, або переважно тієї ж конструкції нуклеїнової кислоти. Конструкція нуклеїнової кислоти може являти собою лінійний фрагмент або циркулярну молекулу, і вона може або не може бути здатна до реплікації. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що конструкція нуклеїнової кислоти за винаходом може бути включена всередину придатного вектора. Трансфекція або трансформація конструкції нуклеїнової кислоти в клітину-реципієнт забезпечує можливість клітині експресувати молекулу РНК, кодовану конструкцією нуклеїнової кислоти. Конструкція нуклеїнової кислоти за винаходом може експресувати її множинні копії, і/або одна або декілька (наприклад, 1, 2, 3, 4, 5 або більше) включають численні різні молекули РНК, що містять двониткову ділянку, наприклад, коротку "шпильку" РНК. Молекули РНК, які розглядають як "такі ж" як кожна інша з тих, які містять лише таку ж двониткову послідовність, і молекули РНК, які розглядають як "відмінні" одна від одної, будуть містити інші двониткові послідовності, незалежно від того, чи будуть послідовності, передбачувані бути мішенями кожної іншої двониткової послідовності, у межах того самого або іншого гена, чи послідовностями двох різних генів. Конструкція нуклеїнової кислоти може також містити додаткові генетичні елементи. Типи елементів, які можуть бути включені в конструкцію, жодним чином не обмежуються і можуть бути вибрані фахівцем у даній галузі. У деяких варіантах здійснення конструкцію нуклеїнової кислоти вводять у клітину-хазяїн як трансген. У таких випадках може бути бажаним введення в цю конструкцію "допоміжних" фрагментів, які призначені для захисту послідовностей, що кодують молекулу РНК, від процесу вставки трансгена і для зниження ризику зчитування зовнішньої транскрипції. Допоміжні фрагменти можуть також бути включені в конструкцію для збільшення відстані між, наприклад, промотором і послідовністю, що кодує, і/або компонентом термінатора. Довжина фрагмента допоміжної послідовності може складати будь-яку довжину від 5 до 5000 або більше нуклеотидів. Між промоторами може бути один або кілька допоміжних фрагментів. У випадку численних допоміжних фрагментів їхня довжина може бути однаковою або різною. Допоміжні фрагменти ДНК переважно являють собою різні послідовності. Переважно, допоміжні послідовності містять послідовність, ідентичну послідовності, що виявляється всередині клітини, або її потомства, в які вони були вставлені. В інших варіантах здійснення конструкція нуклеїнової кислоти містить допоміжні ділянки, які фланкують відкриту рамку(и) зчитування, що кодують одну або декілька двониткових РНК. Альтернативно, конструкція нуклеїнової кислоти може включати елемент, здатний до переміщення, наприклад, транспозон, який характеризується кінцевими, інвертованими послідовностями повторів, що фланкує відкриті рамки зчитування, що кодує одну або декілька двониткових РНК. Приклади придатних транспозонів включають Tol2, міні-Tol, "Sleeping Beauty", Mariner and Galluhop. Інші приклади додаткового генетичного елемента, які можуть бути включені в конструкцію 11 UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеїнової кислоти, включають ген-репортер, такий як один або декілька генів для флуоресцентного маркерного білка, такого як GFP або RFP; легко аналізований фермент, такий як бета-галактозидаза, люцифераза, бета-глюкуронідаза, хлорамфенікол ацетилтрансфераза або секретована ембріональна лужна фосфатаза; або білки, для яких загальнодоступні імуноаналізи, такі як гормони або цитокіни. Інші генетичні елементи, які можуть знайти застосування у варіантах здійснення даного винаходу, включають ті, які кодують білки, що надають клітинам селективної переваги росту, такі як аденозиндеаміназа, аміногліколева фосфотрансфераза, дигідрофолатредуктаза, гігроміцин-В-фосфотрансфераза, або стійкості до лікарських засобів. Якщо конструкція нуклеїнової кислоти трансфекується тварині, то бажано, щоб промотор і будь-які додаткові генетичні елементи складалися з нуклеотидних послідовностей, які зустрічаються в природі в геномі тварини. Крім того, бажано, щоб послідовності, що кодують молекули РНК, складалися з послідовностей вірусу грипу А. Промотори Використовуваний у даному описі термін "промотор" стосується послідовності нуклеїнової кислоти, яка здатна спрямовувати транскрипцію функціонально зв'язаної молекули нуклеїнової кислоти, і включає, наприклад, промотори РНК полімерази II і РНК полімерази III. У це визначення також включені ті транскрипційні регуляторні елементи (наприклад, підсилювачі), які достатні для надання регульованості залежній від промотору експресії гена специфічним для типу клітини, специфічним для тканини або специфічним для часу чином, або які є індукованими зовнішніми агентами або сигналами. Якщо конструкція нуклеїнової кислоти, що містить промотор, трансфекована у тваринухазяїна, то бажано, щоб промотор був тим, який зустрічається в природі в геномі тварини. Наприклад, коли трансгенна тварина являє собою курку, то промотор являє собою переважно курячий промотор; коли трансгенна тварина являє собою індичку, то промотор являє собою переважно індичий промотор; і коли трансгенна тварина являє собою качку, то промотор являє собою переважно качиний промотор. Використовуваний у даному описі термін "функціонально зв'язаний" стосується функціонального зв'язку між двома або більше сегментами нуклеїнових кислот (наприклад, ДНК). Звичайно він стосується функціонального зв'язку транскрипційного регуляторного елемента з транскрибованою послідовністю. Наприклад, промотор функціонально зв'язаний з послідовністю, що кодує, такою як відкрита рамка зчитування, яка кодує визначену в даному описі молекулу двониткової РНК, якщо вона стимулює або модулює транскрипцію послідовності, що кодує, у відповідній клітині. Як правило, транскрипційні регуляторні елементи промотору, які функціонально зв'язані з транскрибованою послідовністю, є фізично суміжними з транскрибованою послідовністю, тобто вони є цис-діючими. Однак деякі транскрипційні регуляторні елементи, такі як підсилювачі, не повинні бути фізично суміжними або розташованими в безпосередній близькості до послідовностей, що кодують, чию транскрипцію вони підсилюють. Під термінами "промотор РНК полімерази III" або "промотор РНК pol III", або "промотор полімерази III", або "промотор pol III" мають на увазі промотор будь-якого безхребетного, хребетного або ссавця, наприклад, курки, людини, миші, свині, корови, примата, мавпи, тощо, який у своєму природному контексті в клітині асоціюється або взаємодіє з РНК полімеразою III для транскрипції її функціонально зв'язаного гена або будь-якого його варіанта, природного або одержаного методами генної інженерії, який взаємодіє з вибраною клітиною-хазяїном із РНК полімеразою III для транскрипції функціонально зв'язаної послідовності нуклеїнової кислоти. Під промотором U6 (наприклад, курячим U6, людським U6, мишачим U6), промотором Н1 або промотором 7SK мають на увазі промотор будь-якого безхребетного, хребетного або ссавця, або поліморфний варіант або мутант, який, як виявляється в природі, взаємодіє з РНК полімеразою III для транскрипції його спорідненого по жіночій лінії продукту РНК, тобто, відповідно, U6 РНК, Н1 РНК або 7SK РНК. Приклади придатних промоторів включають cU6-1 (SEQ ID NO:22), cU6-3 (SEQ ID NO:23), cU6-4 (SEQ ID NO:24) і c7SK (SEQ ID NO:25). Переважно, при деяких варіантах застосування використовують промотори РНК pol III типу III, включаючи U6, Н1 і 7SK, які існують в ділянці, що фланкує 5', і включають ТАТА-блоки та позбавлені внутрішніх промоторних послідовностей. Внутрішні промотори зустрічаються для pol III 5S рРНК, тРНК або VA РНК генів. Ген 7SK pol РНК III містить слабкий внутрішній промотор і послідовність у ділянці, що фланкує 5'-кінець гена, необхідного для транскрипції. Промотори pol III для використання в конструкції нуклеїнової кислоти для конкретного застосування, наприклад, для експресії молекул двониткової РНК, таких як "шпильки" РНК проти пташиного або людського вірусу, можуть бути переважно вибрані для оптимального зв'язування і 12 UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 транскрипції РНК полімерази III клітини-хазяїна, наприклад, включаючи пташині промотори pol III у конструкції експресії, призначеній для транскрипції великої кількості "шпильок" dsРНК проти пташиного вірусу, такого як вірус пташиного грипу (H5N1) у пташиних клітинах-хазяїнах. Під "різними" промоторами полімерази мають на увазі будь-які два промотори РНК полімерази, такі як промотори РНК полімерази II або РНК полімерази III, включаючи варіанти, такі як їх поліморфізми і мутанти, які у певному вигляді запустять транскрипцію різних споріднених по материнській лінії транскриптів, таких як, наприклад, людський промотор 7SK, людський промотор U6 і людський промотор H1, які вважаються трьома "різними" промоторами полімерази. "Різні" промотори полімерази також стосуються окремих членів родини промоторів, таких як, наприклад, родина курячих промоторів U6, в якій промотори cU6-1, cU6-2, cU6-3 і/або cU6-4 вважаються "різними" промоторами. Використання різних промоторів полімерази в конструкціях за даним винаходом знизить можливість явищ внутрішньо- і/або міжмолекулярної рекомбінації, таких як перебудови або делеції. У деяких аспектах множинні копії "одного і того самого" промотору РНК полімерази II або РНК полімерази III можуть бути включені в конструкцію нуклеїнової кислоти за винаходом. У деяких варіантах здійснення конструкції нуклеїнової кислоти за винаходом можуть містити множинні копії одного і того самого промотору полімерази без "іншого" промотору полімерази; наприклад, 3, 4, 5 або більше промоторів U6, кожний з яких функціонально зв'язаний із послідовністю, що кодує молекулу РНК, таку як shРНК. Необов'язково, у деяких варіантах здійснення інші промотори можуть бути включені на додаток до двох або більше промоторів полімерази, наприклад, один або декілька промоторів полімерази I, один або декілька мітохондріаальних промоторів, тощо. В одному аспекті конструкція експресії, що містить множинні промотори полімерази (2, 3, 4, 5 або більше) піддається маніпуляціям генної інженерії для експресії численних "шпильок" dsРНК або shРНК, і в цьому випадку можуть використовуватися 2, 3, 4, 5 або більше копій одного і того самого промотору полімерази, незалежно від того, чи включений також "інший" промотор РНК полімерази, чи ні. У деяких випадках може також бути бажаним, щоб конструкція нуклеїнової кислоти містила промотор, специфічний для тканини або специфічний для клітини. Термін "специфічний для тканини", відповідно до промотору, стосується промотору, який здатний спрямовувати селективну експресію нуклеотидної послідовності, що становить цікавість, на певний тип тканини (наприклад, легені) при відносній відсутності експресії тієї ж нуклеотидної послідовності, що становить цікавість, в іншому типі тканини (наприклад, мозку). Такі специфічні для тканини промотори включають такі промотори як Ick, міогенін або thy1. Термін "специфічний для клітини", відповідно до промотору, стосується промотору, який здатний спрямовувати селективну експресію нуклеотидної послідовності, що становить цікавість, на певний тип клітини при відносній відсутності експресії тієї ж нуклеотидної послідовності, що становить цікавість, в іншому типі клітини в межах тієї ж тканини (див., наприклад, Higashibata, et al. (2004); Hoggatt, et al. (2002); Sohal, et al., (2001); і Zhang, et al., (2004)). Термін "специфічний для клітини", стосовно до промотору, також означає промотор, здатний сприяти селективній експресії нуклеотидної послідовності, що становить цікавість, в ділянці в межах однієї тканини. Альтернативно, промотори можуть бути конститутивними або регульованими. Крім того, промотори можуть бути модифіковані так, щоб мати різні специфічності. Ампліфікація нуклеїнової кислоти "Полімеразна реакція синтезу ланцюга" ("PCR") являє собою реакцію, при якій одержують копії реплікатів полінуклеотиду-мішені з використанням "пар праймерів" або "набору праймерів", що складаються з праймера "вище по ходу транскрипції" і "нижче по ходу транскрипції", і каталізатора полімеризації, такого як ДНК полімераза, і звичайно термічно стійкого ферменту полімерази. Способи PCR відомі в даній галузі, і про них іде мова, наприклад, у "PCR" (Ed. M.J. McPherson and S.G Moller (2000), BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford). PCR може виконуватися на кДНК, одержаній в результаті зворотної транскрипції мРНК, виділеної з біологічних зразків. Праймер часто являє собою олігонуклеотид, як правило, довжиною приблизно 20 нуклеотидів, при мінімумі приблизно 15 нуклеотидів, який здатний гібридизуватися специфічним для послідовності типом з послідовністю-мішенню і розтягується під час PCR. Як праймер можуть також використовуватися більш довгі молекули нуклеїнової кислоти, наприклад, молекули нуклеїнової кислоти довжиною щонайменше 50 або 100, або більше нуклеотидів. Амплікони або продукти PCR, або фрагменти або продукти ампліфікації PCR являють собою продукти розтягування, які містять праймер і заново синтезовані копії послідовностей-мішеней. Мультиплексні системи PCR містять множинні набори праймерів, що призводить до одночасної продукції більше ніж одного амплікона. Праймери можуть бути досконалим чином підібрані для відповідності послідовностям-мішеням, або вони можуть містити внутрішні помилково спарені 13 UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 основи, що може призвести до введення рестрикційного ферменту або сайтів розпізнавання/розщеплення каталітичної нуклеїнової кислоти у специфічні послідовності-мішені. Праймери можуть також містити додаткові послідовності і/або модифіковані або мічені нуклеотиди для сприяння захопленню або виявленню ампліконів. Повторні цикли теплової денатурації ДНК, відпал праймерів у їхні комплементарні послідовності і розтягування праймерів полімеразою після відпалу призводять до експонентної ампліфікації послідовностімішені. Терміни "мішень", або "послідовність-мішень", або "матриця" стосуються послідовностей нуклеїнових кислот, які є ампліфікованими. Іншою методикою ампліфікації нуклеїнових кислот є зворотна транскрипція-полімеразна реакція синтезу ланцюга (RT-PCR). По-перше, комплементарну ДНК (кДНК) одержують з матриці РНК із використанням ферменту зворотної транскриптази, а потім виконується PCR на одержаній кДНК. Іншим способом ампліфікації є лігазна реакція синтезу ланцюга ("LCR"), розкрита в ЕР 0320308. При LCR одержують 2 пари комплементарних зондів, і в присутності послідовностімішені кожна пара зв'язується з протилежними комплементарними нитками мішені так, що вони прилягають одна до одної. У присутності лігази дві пари зондів зв'яжуться для утворення однієї одиниці. Шляхом циклічної зміни температури, як при PCR, зв'язані ліговані одиниці дисоціюються від мішені і потім служать як "послідовності-мішені" для лігування надлишкових пар зондів. У патенті США № 4883750 описаний спосіб, аналогічний LCR, для зв'язування пар зондів із послідовністю-мішенню. Інші способи ампліфікації молекул нуклеїнової кислоти відомі фахівцям у даній галузі і включають способи ізотермічної ампліфікації та системи ампліфікації на основі транскрипції. Будь-який придатний спосіб ампліфікації конструкції нуклеїнової кислоти, або її фрагмента, або виділеної або екзогенної молекули нуклеїнової кислоти, або її фрагмента може використовуватися в способах за даним винаходом. Вектори і клітини-хазяїни У деяких випадках може бути бажана вставка конструкції нуклеїнової кислоти і/або молекули нуклеїнової кислоти за винаходом у вектор. Вектор може являти собою, наприклад, плазміду, вірус або штучну хромосому, одержану, наприклад, із бактеріофага, аденовірусу, аденоасоційованого вірусу, ретровірусу, поксвірусу або герпесвірусу. Такі вектори включають хромосомні, епісомні та одержані з вірусу вектори, наприклад, вектори, одержані з бактеріальних плазмід, бактеріофагів, дріжджових епісом, дріжджових хромосомних елементів і вірусів, вектори, одержані з їхніх комбінацій, такі як вектори, одержані з плазміди і генетичних елементів бактеріофага, космід і фагемідів. Таким чином, один ілюстративний вектор являє собою вектор фага двониткової ДНК. Інший ілюстративний вектор являє собою вірусний вектор двониткової ДНК. Вектор, в який вставлена конструкція нуклеїнової кислоти, може також включати переміщуваний елемент, наприклад, транспозон, що характеризується кінцевими інвертованими послідовностями повторів, які фланкують відкриті рамки зчитування, що кодують одну або декілька двониткових РНК. Приклади придатних транспозонів включають Tol2, мініTol2, "Sleeping Beauty", Mariner and Galluhop. Посилання на транспозон Tol2 у даному описі включає транспозон, одержаний з Tol2, такий як міні-Tol2. Даний винахід також стосується клітини-хазяїна, в яку була введена конструкція нуклеїнової кислоти, молекула нуклеїнової кислоти і/або вектор за даним винаходом. Клітину-хазяїн за даним винаходом можна використовувати, наприклад, як продукційну систему для одержання або експресії молекули dsРНК. Для одержання in vitro, можуть використовуватися еукаріотичні клітини або прокаріотичні клітини. Придатні для використання еукаріотичні клітини-хазяїни можуть являти собою тваринні, рослинні або грибкові клітини. Як клітини тварин можуть використовуватися клітини ссавців, такі як CHO, COS, 3T3, DF1, CEF, мієломи MDCK, нирок дитинчати хом'ячка (BHK), HeLa або клітини Vero, клітини амфібій, такі як ооцити Xenopus, або клітини комах, такі як клітини Sf9, Sf21 або Tn5. Можуть також використовуватися клітини CHO, що не мають гена DHFR (dhfr-CHO) або CHO K-1. Вектор може бути введений у клітину-хазяїн, наприклад, способом з використанням фосфату кальцію, способом з використанням DEAE-декстрану, способом з використанням катіонної ліпосоми DOTAP (Boehringer Mannheim), електропорацією, ліпофекцією, тощо. Придатні для використання прокаріотичні клітини включають бактеріальні клітини, такі як E.сoli, наприклад, JM109, DH5a і HB101, або Bacillus subtilis. Для клітин тварин може використовуватися культуральне середовище, таке як DMEM, MEM, RPM11640 або IMDM. Культуральне середовище може використовуватися з додаванням сироватки, такої як фетальна теляча сироватка (FCS), або без неї. рН культурального 14 UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 середовища складає переважно приблизно від 6 до 8. Клітини звичайно культивуються при приблизно 30-40ºС протягом приблизно 15-200 годин, і культуральне середовище може за необхідності заміщатися, аеруватися або перемішуватися. Трансгенні тварини, за винятком людини Термін "трансгенна тварина, за винятком людини" стосується тварини, за винятком людини, яка містить конструкцію нуклеїнової кислоти ("трансген"), що не виявляється у тварини дикого типу того ж виду або породи. Зазначений у даному описі "трансген" має звичайне значення в галузі біотехнології і включає генетичну послідовність, яка була одержана або змінена технологією рекомбінантної ДНК або РНК, і яка була введена в клітину тварини, переважно, птаха. Трансген може включати генетичні послідовності, одержані з клітини тварини. Звичайно трансген вводиться тварині маніпуляцією людини, такою як, наприклад, трансформація, але може використовуватися будь-який спосіб, як відомо фахівцю в даній галузі. Трансген включає генетичні послідовності, які вводяться в хромосому, а також ті, які є позахромосомними. Методики для одержання трансгенних тварин добре відомі в даній галузі. Корисним посібником з цього предмета є Houdebine, Transgenic animals – Generation and Use (Harwood Academic, 1997). Гетерологічна ДНК може вводитися, наприклад, у запліднену яйцеклітину. Наприклад, тотипотентні або плюрипотентні стовбурові клітини можуть бути трансформовані мікроін'єкцією, осадженням, опосередкованим фосфатом кальцію, злиттям ліпосом, ретровірусною інфекцією або іншими засобами, трансформовані клітини потім вводяться в ембріон, і ембріон потім розвивається у трансгенну тварину. В одному способі ембріони, що розвиваються, інфікуються ретровірусом, який містить бажану ДНК, і трансгенних тварин одержують з інфікованого ембріона. Однак в альтернативному способі відповідні ДНК спільно вводяться ін'єкцією в пронуклеус або цитоплазму ембріонів, переважно, на одній клітинній стадії, і ембріонам надається можливість розвитися у зрілих трансгенних тварин. Інший спосіб, використовуваний для одержання трансгенної тварини, включає мікроін'єкцію стандартними способами нуклеїнової кислоти в яйцеклітини на пронуклеарній стадії. Потім ін'єковані яйцеклітини культивуються перед перенесенням у яйцепроводи несправжньо вагітних реципієнтів. Трансгенні тварини можуть також бути одержані технологією ядерного перенесення. З використанням цього способу фібробласти від тварин-донорів стійко трансфекуються плазмідою, яка включає послідовності, що кодують, для домену зв'язування або зв'язування партнера, що становить цікавість, під контролем регуляторних послідовностей. Потім стійкі трансфектанти зливаються з енуклейованими ооцитами, культивуються і переносяться у самокреципієнтів. Опосередковане спермою перенесення гена (SMGT) являє собою інший спосіб, який може використовуватися для генерування трансгенних тварин. Цей спосіб був вперше описаний Lavitrano et al. (1989). Інший спосіб одержання трансгенних тварин являє собою технологію основаного на лінкері опосередкованого спермою перенесення гена (LB-SMGT). Ця процедура описана в патенті США № 7067308. Стисло, свіжозібрана сперма промивається та інкубується з мишачим моноклональним антитілом mAbС (що секретується гібридомою із присвоєним номером доступу в АТСС РТА-6723)) і потім ДНК конструкції. Моноклональне антитіло сприяє зв'язуванню ДНК зі спермою. Потім проводиться штучне запліднення самок комплексом сперми/ДНК. Трансгенні кури зародкової лінії можуть бути одержані ін'єкцією ретровірусу з дефектною реплікацією в підзародкову порожнину курячих бластодерм у свіжовідкладені яйця (патент США № 5162215; Bosselman et al., 1989; Thoraval et al., 1995). Ретровірусна нуклеїнова кислота, що несе чужорідний ген, безладно вставляється в хромосому ембріональних клітин, генеруючи трансгенних тварин, деякі з яких несуть трансген в їхній зародковій лінії. Було описане застосування ізоляторних елементів, вставлених у 5'-ділянці або 3'-ділянці конструкції гібридного гена, для подолання впливів положення в сайті вставки (Chim et al., 1993). Інший спосіб генерування трансгенних тварин зародкової лінії здійснюється використанням транспозона, наприклад, транспозона Tol2, для інтеграції конструкції нуклеїнової кислоти за винаходом в геном тварини. Транспозон Tol2, який був вперше виділений з риби медака Oryzias latipes, і належить до родини hAT транспозонів, описаний у публікації Koga et al. (1996) і Kawakami et al. (2000). Міні-Tol2 являє собою варіант Tol2 і описаний у публікації Balciunas et al. (2006). Транспозони Tol2 і Міні-Tol2 полегшують інтеграцію трансгена в геном організму при спільній дії з Tol2 транспозази. Шляхом доставки Tol2 транспозази на окремій плазміді, що не реплікується, лише транспозон Tol2 або Міні-Tol2 і трансген інтегровані в геном, і плазміда, що містить Tol2 транспозазу, втрачається в межах обмеженого числа клітинних поділів. Таким 15 UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 чином, інтегрований транспозон Tol2 або Міні-Tol2 більше не має здатності піддаватися подальшому явищу транспозиції. Крім того, оскільки Tol2, як відомо, не є природним пташиним транспозоном, у клітині птаха, наприклад у курячій клітині, то ендогенна активність транспозази для виклику подальших явищ транспозиції відсутня. У способах за даним винаходом може використовуватися будь-яка інша придатна система транспозона. Наприклад, система транспозона може являти собою систему транспозона "Sleeping Beauty", "Frog Prince" або MosІ, або може використовуватися будь-який транспозон, що належить до родини tc1/mariner або hAT транспозонів. Ін'єкція пташиних ембріональних стовбурових клітин в ембріони реципієнтів для одержання химерних птахів описана в патенті США № 7145057. Виведення одержаної химери дає трансгенних птахів, чий геном складається з екзогенної ДНК. Способи одержання трансгенних курей з довгострокових культур пташиних примордіальних зародкових клітин (PGC) описані в заявці на патент США 20060206952. При комбінуванні з пташиним ембріоном-хазяїном відомими процедурами ці модифіковані PGC переносяться по зародковій лінії для одержання трансгенного потомства. Вірусна система доставки на основі будь-якого відповідного вірусу може використовуватися для доставки конструкції нуклеїнової кислоти за даним винаходом в клітину. Крім того, можуть використовуватися гібридні вірусні системи. Вибір вірусноїсистеми доставки залежить від різних параметрів, таких як ефективність доставки в клітину, тканину або орган, що становлять цікавість, ефективність трансдукції системи, патогенність, імунологічні аспекти і побоювання токсичності, тощо. Ясно, що немає однієї вірусної системи, яка підходить для усіх видів застосування. При виборі вірусної системи доставки для використання в даному винаході важливо вибрати систему, де вірусні частинки, що містять конструкцію нуклеїнової кислоти, переважно: 1) відтворювано і стійко поширюються; 2) здатні очищатися до високих титрів; і 3) здатні опосередковувати спрямовану доставку (доставку конструкції експресії нуклеїнової кислоти в клітину, тканину або орган, що становлять цікавість, без широко розповсюдженої дисемінації). Композиції і введення У переважному варіанті здійснення композиція за винаходом являє собою фармацевтичну композицію, що містить придатний носій. Придатні фармацевтичні носії, ексципієнти і/або розріджувачі включають, але ними не обмежуються, лактозу, сахарозу, порошок крохмалю, порошок тальку, складні ефіри алканоєвих кислот целюлози, стеарат магнію, оксид магнію, кристалічну целюлозу, метилцелюлозу, карбоксиметилцелюлозу, желатин, гліцерин, альгінат натрію, антибактеріальні засоби, протигрибкові засоби, гуміарабік, аравійську камедь, солі натрію і калію фосфорної і сірчаної кислот, полівінілпіролідон і/або полівініловий спирт, сольовий розчин і воду. У деяких варіантах здійснення конструкція(ї) нуклеїнової кислоти і/або молекули нуклеїнової кислоти за винаходом утворюють комплекси з одним або декількома катіонними ліпідами або катіонними амфіфілами, такі як композиції, розкриті в патентах США № 4897355; 5264618 або 5459127. В інших варіантах здійснення вони утворюють комплекси з ліпосомою/ліпосомною композицією, яка включає катіонний ліпід і, необов'язково, включає інший компонент, такий як нейтральний ліпід (див., наприклад, патенти США № 5279833; 5283185 і 5932241). В інших варіантах здійснення вони утворюють комплекси з багатофункціональними молекулярними комплексами за патентами США № 5837533; 6127170 і 6379965 або, бажано, багатофункціональними молекулярними комплексами або масляно/водними катіонними амфіфільними емульсіями за WO 03/093449. В останній заявці мова йде про композицію, яка включає нуклеїнову кислоту, ендосомолітичний спермін, який включає холестерин або жирну кислоту, і спермін, що націлює, який включає ліганд для молекули клітинної поверхні. Співвідношення між позитивним і негативним зарядом композиції складає від 0,1 до 2,0, переважно, 0,5 і 1,5, включно; ендосомолітичний спермін складає щонайменше 20 % молекул, що містять спермін, у композиції; і спермін, що націлює, складає щонайменше 10 % молекул, що містять спермін, у композиції. Бажано, щоб співвідношення між позитивним і негативним зарядом композиції складало від 0,8 до 1,2, включно, наприклад, від 0,8 до 0,9, включно. Введення конструкції нуклеїнової кислоти, молекули і/або композиції нуклеїнової кислоти може придатним чином досягатися ін'єкцією в куряче яйце і, як правило, ін'єкцією в повітряний мішок. Незважаючи на те, що повітряний мішок є переважним шляхом введення in ovo, інші ділянки, такі як жовтковий мішок або алантоїсна рідина хоріона, також можуть інокулюватися ін'єкцією. Частота вилуплення з яєць може трохи знизитися, коли повітряний мішок не є мішенню для введення, хоча необов'язково на промислово неприйнятних рівнях. Механізм ін'єкції не має вирішального значення для здійснення даного винаходу, хоча бажано, щоб голка 16 UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 не викликала непотрібного ушкодження яйця або тканин і органів ембріона, що розвивається, або позаембріональних мембран, що оточують ембріон. Як правило, шприц для підшкірних ін'єкцій, оснащений голкою приблизно 22 калібру, підходить для введення в пташине яйце. Спосіб за даним винаходом особливо добре пристосований для використання з автоматизованим ін'єкційним пристроєм, таким як пристрої, описані в патентах США № 4903635; 5056464; 5136979 і заявці на патент США US 20060075973. В іншому варіанті здійснення конструкція нуклеїнової кислоти, молекула і/або композиція нуклеїнової кислоти вводиться за допомогою легеневої доставки, наприклад, інгаляцією висушеної суміші у вигляді аерозолю або спрею. Наприклад, аерозоль може вводитися інгаляційним пристроєм або розпилювачем (див., наприклад, патент США № 4501729), що забезпечують швидке місцеве поглинання молекул нуклеїнової кислоти, у відповідні легеневі тканини. Тверді композиції у формі частинок, що містять вдихувані сухі частинки мікронізованих композицій нуклеїнової кислоти, можуть бути одержані помелом висушених або ліофілізованих композицій нуклеїнової кислоти і потім пропусканням мікронізованої композиції, наприклад, через сито 400 меш для руйнування або відділення великих агломератів. Тверда композиція у формі частинок, що містить композиції нуклеїнової кислоти за винаходом, може, необов'язково, містити диспергент, який служить для сприяння утворенню аерозолю, а також терапевтичних сполук. Придатним диспергентом є лактоза, яка може змішуватися зі сполукою нуклеїнової кислоти в будь-якому придатному співвідношенні, наприклад, у співвідношенні 1 до 1, за масою. Розпилювачі являють собою пристрої, що випускаються промисловістю, які перетворюють розчини або суспензії активного інгредієнта на туман терапевтичного аерозолю, або за допомогою прискорення стиснутого газу, звичайно повітря або кисню, крізь вузький отвір Вентури або за допомогою ультразвукового перемішування. Придатні суміші для використання в розпилювачах містять активний інгредієнт у рідкому носії в кількості до 40 %, за масою, переважно, менше ніж 20 %, за масою, сполуки. Носій являє собою звичайно воду або розведений водний спиртовий розчин, переважно, виготовлений ізотонічним з біологічними рідинами додаванням, наприклад, хлориду натрію або інших придатних солей. Необов'язкові добавки включають консерванти, якщо суміш не одержана стерильною, наприклад, метилгідроксибензоат, антиоксиданти, ароматизатори, леткі олії, забуферувальні агенти та емульгатори, та інші поверхнево-активні речовини суміші. Аерозолі твердих частинок, що містять активну композицію і поверхнево-активну речовину, можуть бути аналогічним чином одержані будь-яким генератором аерозолю твердих частинок. Генератори аерозолю для введення індивіду терапевтичних засобів у формі твердих частинок продукують частинки, які можуть вдихатися, як пояснюється вище, і генерують об'єм аерозолю, що містить задану відміряну дозу терапевтичної композиції зі швидкістю, яка підходить для введення людині. Конструкція нуклеїнової кислоти, молекули і/або композиція за винаходом може також додаватися в корм або питну воду тварини. Може бути зручним складання композиції корму і питної води так, щоб тварина приймала їх у терапевтично доцільній кількості разом з її раціоном. Може також бути зручним надання композиції у вигляді преміксу для додавання в корм або питну воду. Приклади Приклад 1. Вибір послідовностей shРНК для включення в трансгени Для націлювання на РНКі були вибрані найбільш висококонсервативні гени, PB1, PB2, PA, NP і M1 вірусу грипу А. Автори використовували siVirus (комп'ютерну програму на основі інформації з Інтернету конструкції антивірусної sіРНК для високодивергентних вірусних послідовностей, Naito et al., 2006) для ідентифікації висококонсервативних ділянок усередині вибраних генів, а також для прогнозування послідовностей sіРНК, скринінг яких може робитися для вибору shРНК. Ця комп'ютерна програма виявила ряд ділянок у межах аналізованих геномних сегментів вірусу грипу А, які становили особливу цікавість для конструкції shРНК, а саме, 3'-ділянки PB1, PB2, PA і NP. Конкретніше, вони являли собою Сегмент 1 (ген PB2), нуклеотиди 2240-2341; Сегмент 2 (ген PB1), нуклеотиди 2257-2341; Сегмент 3 (ген PA), нуклеотиди 2087-2233 і Сегмент 5 (ген NP), нуклеотиди 1484-1565. Автори вибрали 29 прогнозованих послідовностей sіРНК із програми siVirus для скринінгу з метою вибору shРНК (таблиця 1). Існують кілька алгоритмів для вибору потенційних послідовностей sіРНК для певних генів-мішеней. Однак було показано, що багато з цих прогнозованих sіРНК ефективно не функціонують при одержанні з експресованих shРНК. Taxman et al. (2006), зокрема, сконструювали алгоритм для прогнозу ефективних молекул shРНК, і автори розробили свою власну модифікацію алгоритму для поліпшення прогнозу shРНК. Автори застосували модифікований алгоритм Taxman до 29 shРНК, вибраних із використанням програми siVirus для того, щоб вибрати послідовності для тестування як shРНК 17 UA 102069 C2 для специфічного інгібування реплікації вірусу грипу А. Таблиця 1 Алгоритм вибору послідовностей shРНК, націлених на гени вірусу грипу А 5 10 Існують 4 критерії для вибору shРНК із використанням алгоритму Taxman. Три критерії оцінені в балах із максимального числа 4 очка. Цими критеріями є: 1) C або G на 5'-кінці послідовності = 1 очко, А або Т на 5'-кінці = -1 очко; 2) А або Т на 3'-кінці = 1 очко; C або G на 3'кінці = -1 очко; 3) 5 або більше А або Т в семи основах 3'=2 очка, 4 А або Т у семи основах 3'=1 очко. Кращими є послідовності shРНК із найвищими бальними оцінками. Четвертий критерій оснований на розрахунку вільної енергії 6 центральних основ послідовності shРНК (основи 6-11 смислової нитки, гібридизованої з основами 9-14 антисмислової нитки) для 19-нуклеотидної послідовності. Кращими є shРНК із центральним дуплексом ΔG>-12,9 ккал/моль. Модифікація алгоритму Taxman авторами полягає у використанні інших параметрів вільної енергії для прогнозів стійкості дуплекса РНК, як опубліковано Freier et al. (1986). На основі алгоритму автори вибрали 13 послідовностей shРНК із використанням програми siVirus для застосування в 18 UA 102069 C2 потенційно ефективних shРНК із метою тестування їхньої здатності інгібувати реплікацію вірусу грипу А. Вибрані послідовності виділені жирним шрифтом у таблиці 1, а їхня послідовність 5'-3' показана в таблиці 2. Ці 13 послідовностей використовували для побудови плазмід ddРНКi для експресії 10 shРНК. 5 Таблиця 2 Послідовність shPHK, вибраних для аналізів інгібування віруса 10 15 20 25 30 Приклад 2. Курячі промоторні послідовності Відомо, що при конструюванні конструкції трансгена бажано включити промотори, які включають послідовність, що знаходиться вище по ходу транскрипції, для забезпечення можливості ефективного прикріплення ферменту полімерази до промоторних послідовностей. Незважаючи на це, курячі промотори U6 були призначені і тестовані для вмісту мінімальної кількості промоторної послідовності, необхідної для виклику транскрипції shРНК, таким чином, забезпечуючи можливість зменшення загального розміру конструкції трансгена. Два варіанти конструкцій, pcU6-4 shNP-1496 і pcU6-4 (+100) shNP-1496, тестували для виявлення експресії shРНК за допомогою аналізів захисту РНКази або на викликане мовчання вірусу. Перша плазміда містить мінімальну курячу послідовність U6-4, необхідну для експресії короткої РНК-“шпильки" shNP-1496. Друга плазміда містить додаткову послідовність розміром 100 п.о. вище по ходу транскрипції промотору cU6-4. Очікувалося, що друга конструкція, яка містить додаткову послідовність розміром 100 п.о., забезпечила б кращу експресію shРНК. У таблиці 3 наведені деталі результатів експерименту з аналізом гемаглютинації (аналізу ГА) для вимірювання інгібування продукції вірусу, викликаної експресією shРНК з обох плазмід. Для проведення цього аналізу клітини MDCK вирощували до логарифмічної фази і потім піддавали електропорації плазмідами shРНК із використанням приладу Amaxa Nucleofector. Потім трансфековані клітини через 8 годин інфікували низькопатогенним вірусом грипу А H1N1 A/PR/8/34 (PR8) у діапазоні множинності інфекцій (moi). Титр вірусу (в одиницях ГА) вимірювали через 48 годин після інфекції виконанням аналізів ГА. Аналізи проводили в 96-лунковому планшеті з V-подібним дном. Серійні дворазові розведення зразків вірусу змішували з однаковим об'ємом 0,5 % суспензії (об./об.) курячих еритроцитів та інкубували на льоду протягом 1 години. Лунки, що містять прилиплий однорідний шар еритроцитів, оцінювали в балах як позитивний результат. В експерименті з аналізом ГА, pcU6-4 shNP-1496, що містить мінімальну промоторну послідовність, був більш ефективним у виклику мовчання вірусу при всіх тестованих MOI, ніж pcU6-4 (+100) shNP-1496, який містив додаткову промоторну послідовність вище по ходу транскрипції і несправжню плазміду. 35 19 UA 102069 C2 Таблиця 3 Результати аналізу гемаглютинації (аналізу ГА) 5 10 15 20 25 30 35 40 Приклад 3. Конструкція плазмід ddРНКi для експресії вибраних shРНК Промотори курячої полімерази III cU6-1 (номер доступу в GenBank DQ531567), cU6-3 (DQ531569), cU6-4 (DQ531570) і c7SK (EF488955) використовували як матриці для конструкції плазмід експресії ddРНКі для вибраних shРНК, за допомогою одноетапної PCR (фіг. 1). У PCR для конструкції плазмід використовувався праймер TD135, спарений з TD218 або TD275 для промотору cU6-1; TD175, спарений з TD216, TD274 або TD302 для промотору cU6-4; TD176, спарений з TD217 для промотору cU6-3; TD269, спарений з TD307 або TD316 для промотору c7SK (послідовність праймера і деталі певної ампліфікованої shРНК показані в таблиці 4). Зворотні праймери в кожній PCR були сконструйовані для вмісту останніх 20 нуклеотидів кожної промоторної послідовності, смислової shРНК, петлі та антисмислової послідовності shРНК і були очищені ВЕРХ. Ампліфіковані продукти експресійної повнорозмірної касети лігували в pGEM-T Easy і потім проводили визначення послідовностей. З вибраних 13 shРНК експресійні плазміди були успішно сконструйовані для 7 із послідовностей. Кінцеві експресійні плазміди shРНК, використані в аналізах інгібування вірусу, були названі pcU6-1-shPB2-2240, pcU6-1-shPA-2087, pcU6-3-shMP-592, pcU6-4-shNP-1496, pcU6-4-shNP-1484, pc7SK-shPB1-129, pcU6-4-shPB1-2257 і pc7SK-shPB1-2257. Також конструювали контрольну плазміду, що не стосується cU6-1, і використовували для несправжнього порівняння в аналізах інгібування вірусу (див. нижче). Для цієї несправжньої плазміди прямий праймер TD135 спарювали зі зворотним праймером TD155, що містить останні 20 нуклеотидів промотору chU6-11 і всіх інших нерелевантних компонентів shРНК (shirr). Продукт PCR лігували в pGEM-T Easy і потім проводили визначення послідовностей. Кожну плазміду ddРНКi конструювали так, що початок кожної послідовності shРНК знаходився у положенні +1 нативних транскриптів U6 або 7SK snРНК. Сайт рестрикційного ферменту XhoІ створювали методом генної інженерії нижче по ходу транскрипції від сигналу термінації для забезпечення можливості скринінгу для виявлення продуктів повнорозмірної snРНК, вставлених у pGEM-T Easy. Усі кінцеві вектори експресії snРНК складалися з будь-якого із курячих повнорозмірних промоторів U6 або 7SK, смислової послідовності snРНК, петельної послідовності, антисмислової послідовності snРНК, кінцевої послідовності і сайта XhoІ. Петельна послідовність, використана у всіх snРНК, являла собою 5' UUCAAGAGA 3'. Приклад 4. Тестування вибраних snРНК на інгібування вірусу У таблиці 5 зведені результати експериментів з аналізом гемаглютинації (аналізом ГА) для вимірювання інгібування продукції вірусу, викликаної плазмідами експресії snРНК. Для проведення цих аналізів клітини MDCK вирощували до логарифмічної фази і потім піддавали TM електропорації плазмідами shРНК із використанням приладу Amaxa Nucleofector . Потім трансфековані клітини через 8 годин інфікували вірусом грипу А, або низькопатогенним H1N1 A/PR/8/34 (PR8), або високопатогенним H5N1 A/курячий/в'єтнамський/008/2004 (Р5Т1), у діапазоні множинності інфекцій (moi). Титр вірусу (в одиницях ГА) вимірювали через 48 годин після інфекції виконанням аналізів ГА. Аналізи проводили в 96-лункових планшетах з Vподібним дном. Серійні дворазові розведення зразків вірусу змішували з рівним об'ємом 0,5 % суспензії (об./об.) курячих еритроцитів та інкубували на льоду протягом 1 години. Лунки, що містять прилиплий однорідний шар еритроцитів, оцінювали в балах як позитивний результат. 20 UA 102069 C2 Таблиця 4 Послідовність і деталі використаних праймрів 5 10 15 20 25 30 35 У всіх експериментах з аналізом ГА, підсумованих у таблиці 5, плазміди, що експресують shPB1-2257, shNP-1484 і shNP-1496, були здатні дуже ефективно інгібувати продукцію і PR8, і H5N1 вірусів, у порівнянні з несправжньою плазмідою. У випадку shPB1-2257 і shNP-1484, вони були здатні повністю інгібувати реплікацію обох вірусів у ряді експериментів, підтверджуючи їхню ефективність. Плазміди, що експресують shPA-2087 і shMP-592, також були здатні ефективно інгібувати продукцію вірусів, але не так ефективно, як shPB1-2257, shNP-1484 і shNP-1496. Молекула shPB1-129 інгібувала продукцію низькопатогенного штаму PR8, але не інгібувала високопатогенний штам H5N1. Нарешті, незважаючи на спочатку ідентифіковану як потенційну послідовність-мішень shРНК, shPB2-2240 була нездатна інгібувати реплікацію будьякого з тестованих вірусів. Приклад 5. Конструкція трансгенів з Multi-Warhead (MWH) Було визначено, що суттєву вигоду має експресія великої кількості shРНК з одного трансгена для подальшого зниження ризику варіабельності вірусної послідовності-мішені для стратегії РНКі. Ці трансгени з Multi-Warhead (MWH) складаються з численних транскрипційних одиниць, кожної з іншим курячим промотором pol III (cU6-1, cU6-3, cU6-4 і c7SK), що експресує окремі молекули shРНК, націленої на консервативні послідовності описаних вище різних генів вірусу грипу А. Промоторні послідовності є природними для курей, і невеликі послідовності shРНК із 21 п.о. уже були б присутні в інфікованих А1 або вакцинованих птахів. Мішені РНКi є абсолютно специфічними для вірусів грипу А, і, таким чином, не було б ефектів у вигляді промахів мішені при такому специфічному трансгені. Були сконструйовані 4 трансгени MWH з вибраних shРНК у такий спосіб: a. MWH1-cU6-3 shMP-592; cU6-1 shPA-2087; cU6-4 shNP-1496 Кожен трансген MWH містить три транскрипційні одиниці, які незалежно експресують одну молекулу shРНК із курячого промотору pol III. Три окремі транскрипційні одиниці ампліфікували, використовуючи одноетапну PCR, і одержані фрагменти потім лігували разом для одержання трансгена MWH (фіг. 2). Потім MWH може експресувати три окремі shРНК з одного трансгена. Ці три транскрипційні одиниці для MWH 1 являють собою: cU6-4 shNP-1496; cU6-3 shMP-592; і cU6-1 shPA-2087. Транскрипційну одиницю cU6-4 shNP-1496 ампліфікували, використовуючи прямий праймер TD233 і зворотний праймер TD216, транскрипційну одиницю cU6-3 shMP-592 ампліфікували, використовуючи прямий праймер TD234 і зворотний праймер TD217, і транскрипційну одиницю cU6-1 shPA-2087 ампліфікували, використовуючи прямий праймер TD232 і зворотний праймер TD218 (деталі праймерів описані в таблиці 4). Кожний із продуктів PCR клонували в pGEM-T Easy, і кожний містив рестрикційний ферментний сайт 5' SalІ і рестрикційний ферментний сайт 3' SalІ. Обидва ці рестрикційні сайти мають сумісні виступаючі 21 UA 102069 C2 кінці, які забезпечували можливість послідовного лігування разом окремих транскрипційних одиниць для одержання кінцевого трансгена MWH (фіг. 2). Таблиця 5 Впливи shPHK на продукцію вірусу в клітинах MDSK. Цифри в дужках представляють величини множинності інфекції (moi) b. MWH2-cU6-4 shPB1-2257; cU6-1 shPB2-2240; c7SK shPB1-129 5 10 Ці три транскрипційні одиниці для MWH 2 являють собою: cU6-4 shPB1-2257; cU6-1 shPB22240; і c7SK shPB1-129. Транскрипційну одиницю cU6-4 shPB1-2257 ампліфікували, використовуючи прямий праймер TD233 і зворотний праймер TD274, транскрипційну одиницю cU6-1 shPB2-2240 ампліфікували, використовуючи прямий праймер TD232 і зворотний праймер TD275, і транскрипційну одиницю c7SK shPB1-129 ампліфікували, використовуючи прямий праймер TD306 і зворотний праймер TD307 (деталі праймерів описані в таблиці 4). Кожний із 22 UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 продуктів PCR клонували в pGEM-T Easy і послідовно лігували для побудови кінцевого трансгена MWH, як описано вище і на фіг. 2. c. MWH3-cU6-4 shNP-1484; cU6-1 shPA-2087; c7SK shPB1-2257 Ці три транскрипційні одиниці для MWH 3 являють собою: cU6-4 shNP-1484; cU6-1 shPA2087; і c7SK shPB1-2257. Транскрипційну одиницю cU6-4 shNP-1484 ампліфікували, використовуючи прямий праймер TD233 і зворотний праймер TD302, транскрипційну одиницю cU6-1 shPA-2087 ампліфікували, використовуючи прямий праймер TD232 і зворотний праймер TD218, і транскрипційну одиницю c7SK shPB1-2257 ампліфікували, використовуючи прямий праймер TD306 і зворотний праймер TD316 (деталі праймерів описані в таблиці 4). Кожний із продуктів PCR знову клонували в pGEM-T Easy і послідовно лігували для побудови кінцевого трансгена MWH, як описано вище і на фіг. 2. d. MWH4-cU6-4 shPB1-2257; cU6-3 shNP-1484; cU6-1 shPA-2087 Ці три транскрипційні одиниці для MWH 4 являють собою: cU6-4 shPB1-2257; cU6-3 shNP1484; і cU6-1 shPA-2087. Транскрипційну одиницю cU6-4 shPB1-2257 ампліфікували, використовуючи прямий праймер TD233 і зворотний праймер TD274, транскрипційну одиницю cU6-3 shNP-1484 ампліфікували, використовуючи прямий праймер TD234 і зворотний праймер TD343, і транскрипційну одиницю cU6-1 shPA-2087 ампліфікували, використовуючи прямий праймер TD232 і зворотний праймер TD218 (деталі праймерів описані в таблиці 4). Кожний із продуктів PCR знову клонували в pGEM-T Easy і послідовно лігували для побудови кінцевого трансгена MWH, як описано вище і на фіг. 2. Чотири кінцеві трансгени MWH також тестували на їхню здатність інгібувати продукцію вірусу в аналізі ГА з використанням вірусу грипу А H5N1 (таблиця 4, експеримент 8). MWH 3 і 4 були найбільш ефективними трансгенами. MWH 1 також ефективно інгібував продукцію вірусу H5N1, тоді як MWH 2 не був таким ефективним, як MWH 1. Приклад 6. Клонування трансгенів MWH у вектор pStuffit Кожен MWH клонували в плазміду pStuffit (фіг. 3). Ця плазміда сприяє вставці трансгенів MWH між фрагментами наповнювача/буфера курячої геномної ДНК для потенційного захисту послідовностей MWH і від процесу вставки трансгена, і від прочитаної зовнішньої транскрипції. Фрагменти наповнювача ME1 і GRM5 були вибрані з великих інтронних послідовностей з курячого геному (тобто геномні "пустелі"), і вони позбавлені транскрипційних елементів, які могли б заважати експресії трансгена MWH. Визначені ділянки, описані в GenBank, являють собою: ME1 1500 (chr3) gb|AADN02002420.1 30995-32489 п.о.; ME1 200 (chr 3) gb|AADN02002420.1 5079-5276 п.о. і GRM5 1500 (chr 1) gb|AADN02004814.1 13141-13113, 13078-12911, 12848-11638 п.о.; GRM5 200 (chr 1) gb|AADN02004814.1 10126-9927 п.о. Конструювання плазміди pStuffit Плазміду pStuffit конструювали клонуванням чотирьох ділянок курячого геному у визначеному порядку, продиктованому використанням рестрикційних ферментних сайтів, у вектор клонування pIC20H (фіг. 3). Перераховані в таблиці 6 фрагменти спочатку ампліфікували PCR, використовуючи праймери, перераховані в таблиці 7, а потім окремо клонували в pGEM-T Easy (Invitrogen) і визначали послідовності. Потім ці фрагменти піддавали ексцизії з pGEM-T Easy і послідовно клонували, використовуючи рестрикційні ферментні сайти, перераховані в таблиці 5. По-перше, GRM5 200 клонували в pIC20H, а потім у ME1 200, GRM5 1500 і ME1 1500. На кожній стадії клонування одержану плазміду перевіряли переваром рестрикційного ферменту і визначенням послідовностей ДНК. Кінцева зібрана плазміда була позначена як pStuffit. Таблиця 6 Конструювання pStuffit. Позначення клонованих фрагментів і праймерів, використаних при їхній ампліфікації 23 UA 102069 C2 Таблиця 7 Конструювання pStuffit. Позначення і послідовність праймерів PCR Підкреслені рестрикційні ферментні сайти 5 10 15 20 25 30 Вставка трансгенів MWH у pStuffit Вектор pStuffit має незвичайний рестрикційний сайт EcoRI, розташований між послідовностями GRM5 200 і ME1 200 для забезпечення можливості вставки кожного трансгена MWH. Кожен трансген MWH був вставлений у pStuffit лігуванням у цей рестрикційний сайт EcoRI. Були також включені PacІ і SwaІ для забезпечення можливості ексцизії конструкції з кількостями фланкуючої послідовності, що варіюються (фіг. 3). Рестрикційні ферментні сайти HindIII вектора pIC20H можуть використовуватися для ексцизії всієї клонованої послідовності. Тому кінцеві плазміди pStuffit, що містять кожну зі вставок MWH, переварювали рестрикційним ферментом HindIII для вивільнення кінцевої вставки для очищення і використання для опосередкованого спермою процесу перенесення гена (SMGT). Приклад 7. Основане на лінкері опосередковане спермою перенесення гена Процес доставки конструкції в запліднену курячу яйцеклітину може досягатися основаним на лінкері опосередкованим спермою перенесенням гена. Ця процедура проводиться, як описано в патенті США № 7067308. Стисло, свіжозібрану курячу сперму промивають та інкубують із мишачим моноклональним антитілом mAbС (що секретується гібридомою із присвоєним номером доступу в АТСС РТА-6723) і потім із конструкцією ДНК. Додане моноклональне антитіло сприяє зв'язуванню ДНК зі спермою. Потім курей штучно запліднюють комплексом сперми/ДНК. Процес повторюють чотири рази з інтервалом 72 години між заплідненнями. Яйця збирають щодня через інтервал два дні після першого запліднення, до 3 днів після кінцевого запліднення. Приклад 8. Вставка трансгенів MWH у Tol2 і доставка курям Трансгени MWH 3 (SEQ ID NO:21) і MWH 4 (SEQ ID NO:61) клонували у вектор pminiTol2/MCS (SEQ ID NO:64); Balciunas et al., 2006) транспозона Tol2. Обидва трансгени видаляли з вектора pGEM-T Easy подвійним переварюванням SalІ і XhoІ. Потім цей фрагмент лігували в незвичайний сайт XhoІ у межах множинного клонування вектора транспозона Tol2. Процес доставки конструкції MWH 3 Tol2 (SEQ ID NO:62) і конструкції MWH 4 Tol2 (SEQ ID NO:63) у курячий ембріон може бути досягнутий використанням примордіальних зародкових клітин (PGC). Стисло, PGC збирають із донорських курячих ембріонів, або з крові, коли вік ембріона складає 2 дні, або з гонад ембріона у віці 5,5 днів. PGC очищають із крові або тканини гонад, використовуючи магнітний антитільний розподіл клітин (MACS). Очищені PGC потім піддають електропорації конструкціями Tol2 і окремою плазмідою, що кодує транспозазу Tol2 24 UA 102069 C2 5 10 15 20 (pCMV-Tol2; SEQ ID NO:66; Balciunas et al., 2006), з використанням приладу Amaxa Nucleofector. Потім ці клітини ін'єкують назад в ембріон-реципієнт у віці 2,5 днів. Трансформовані PGC мігрують для формування гонад ембріона, що розвивається. Процес доставки конструкцій Tol2 у курячий ембріон може також досягатися прямою електропорацією бластодерми свіжознесених яєць. Стисло, свіжознесене запліднене яйце розкривають для виявлення бластодерми. У бластодерму ін'єкують ДНК конструкції Tol2 разом із плазмідою, що кодує транспозазу Tol2, використовуючи мікрокапілярну піпетку. Потім проводять електропорацію бластодерми in ovo, використовуючи пристрій для електропорації BTX ECM830 Electro Square Porator. PGC локалізуються в центрі бластодерми, і якщо ці клітини трансформовані конструкцією після електропорації, вони будуть продовжувати ставати зародковими клітинами усередині гонад ембріона, що розвивається. Приклад 9. Скринінг потомства покоління G0 для виявлення трансгенів Невелику кількість крові беруть або з вени крила, або з кінчиків пер однотижневого потомства покоління G0. Геномну ДНК одержують із вени крила, використовуючи міні-набір для аналізу ДНК у крові QIAmp DNA Blood Mini kit (Qiagen). ДНК із крові кінчиків пер одержують, TM використовуючи розчин для екстракції ДНК QuickExtract DNA Extraction Solution (Epicentre Biotechnologies). Проводять два тести цих зразків для підтвердження присутності конструкції. Саузерн блотинг PCR проводять на геномних зразках, використовуючи прямі і зворотні праймери, перераховані в таблиці 8. Потім суміш PCR наносять на агарозний гель, переносять на мембрану і гібридизують радіоактивно міченим зондом блокованої нуклеїнової кислоти (таблиця 8). Після гібридизації і промивання в розчині з високою суворістю вимог до його складу на мембрану впливають рентгенівською плівкою. На позитивний результат вказує смуга правильного розміру, що виявляється на підсумковій ауторентгенограмі. 25 Таблиця 8 Олігонуклеотиди, використані в PCR аналізі Саузерн блотингу 30 Кількісна PCR у реальному масштабі часу PCR у реальному масштабі часу проводять на геномних зразках, використовуючи праймери, перераховані в таблиці 9. В аналізі використовується зв'язування реагенту SYBR Green із двонитковою ДНК і подальший аналіз кривої плавлення для визначення позитивного зразка. Таблиця 9 Праймери, використані в аналізі PCR в реальному масштабі часу 25 UA 102069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклад 10. Тестування для виявлення трансгенних птахів LB-SMGT Птахи, ідентифіковані як трансгенні у популяції покоління G0, зберігаються і утримуються до статевого дозрівання. Після статевого дозрівання птахи використовуються в експериментах спарювання для генерування трансгенного потомства покоління G1, яке має копію конструкції в кожній клітині. Саузерн блотинг і PCR у реальному масштабі часу знову використовуються для демонстрації трансгенної природи потомства покоління G1. Більш детальний аналіз із використанням геномних Саузерн блотингів і PCR у відношенні сайта вставки і числа копій конструкції проводиться на цих птахах. Птахи покоління G1, ідентифіковані як такі, що мають релевантну вставку конструкції, вирощуються до статевої зрілості. Деякі з потомства покоління G2 від цих птахів використовуються у випробуваннях на тваринах для верифікації їхньої стійкості до різних штамів пташиного грипу. Інші птахи покоління G2 аналізуються для виявлення експресії конструкції в різних тканинах і у різному віці. Транспозон Tol2 Вилуплюватися будуть ембріони покоління G0, які одержали або PGC, трансформовані Tol2, або були піддані електропорації конструкцією Tol2. Утримуються і вирощуються до статевої зрілості лише самці курчат покоління G0. Сперму птахів збирають у самців птахів, і PCR виконують для підтвердження того, чи містять птахи релевантну конструкцію. Птахів, які дають позитивний результат у відношенні PCR, використовують в експериментах спарювання для генерування трансгенного потомства покоління G1, яке має копію конструкції в кожній клітині. Знову використовують Саузерн блотинг і PCR у реальному масштабі часу для демонстрації трансгенної природи потомства покоління G1. Приклад 11. Модельна система – трансгенна миша, стійка до грипу А Автори сконструювали дві касети shРНК трансгена для генерування трансгенних мишей. Кожна касета містила промотор U6 миші для експресії або shNP-1496, або shEGFP. Потім обидва трансгени використовували для генерування трансгенних мишей із використанням лентивірусної технології. Стисло, касети shРНК трансгена shNP-1496 і shEGFP клонували у вектор перенесення лентивірусного гена (AusGene, Bentleigh, Australia). Потім трансгенні вірусні конструкції упаковували в лентивірусні частинки. Визначали лентивірусні титри і лентивірусні частинки ін'єкували в перивітеліновий простір ранньої стадії мишачих ембріонів. Ембріони повторно імплантували несправжньо вагітним самкам мишей, і проводили скринінг одержаного потомства аналізом Саузерн блотингу. Одержували трансгенних мишей-засновників, які мали стійку інтеграцію будь-якого трансгена. Потім засновників спарювали з мишами дикого типу для генерування потомства покоління F1. Потім трансгенних мишей покоління F1 тестували в експерименті з контрольним зараженням для визначення стійкості до інфекції, викликаної вірусом грипу А. До експерименту з контрольним зараженням були включені три групи, кожна з яких включала 5 мишей. Кожна з груп 1 і 2 включала 5 мишей з shРНК shNP-1496. Група 3 включала 5 мишей з shРНК shEGFP. Групи 2 і 3 одержували інтраназальне контрольне зараження 2 низькопатогенним вірусом грипу А H1N1 A/PR/8/34 (PR8) у кількості 5×10 TCID50. Контрольне зараження групи 1 проводили сольовим розчином із фосфатним буфером (PBS) без вірусу. Масу тіла контролювали щодня протягом 10 днів після контрольного зараження і наприкінці експерименту, мишей умертвляли, і зразки легенів відбирали для вимірювання вірусної РНК із використанням qPCR. Як показано на фіг. 4, у трансгенних мишей із трансгеном shNP-1496 були чудові рівні стійкості до інфекції в порівнянні з мишами з нерелевантним трансгеном shEGFP. Миші shNP1496 не втрачали масу тіла в ході експерименту при порівнянні з контрольною групою, що одержувала PBS. Миші shEGFP виявили статистично значиме зниження маси тіла, що вказує на активну інфекцію вірусом грипу. При вимірюванні вмісту вірусної РНК у зразках легенів від мишей у групах 2 і 3, у мишей із трансгеном shNP-1496 спостерігалося зменшення вірусної РНК більше ніж на 90 %, у порівнянні з мишами, що містять нерелевантний трансген shEGFP. Як правило, ці результати вказують на те, що трансгенні миші, які містять молекулу shРНК, що специфічно націлена на вірус грипу А, таку як shNP-1496, високостійкі до експериментального контрольного зараження вірусом грипу А H1N1 A/PR/8/34 (PR8). Фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що до винаходу, показаного у певних варіантах здійснення, можуть бути внесені численні варіації і/або модифікації без відходу від суті або широко описаного обсягу винаходу. Тому дані варіанти здійснення слід розглядати у всіх відношеннях як ілюстративні, а не обмежуючі. Усі публікації, обговорені або зазначені в посиланнях, повністю включені в даний опис. 26 UA 102069 C2 5 Дана заявка запитує пріоритет заявки на патент США 60/938315 і заявки на патент Австралії 2007902616, повний зміст яких включений у даний опис шляхом посилання. Будь-яке обговорення документів, актів, матеріалів, пристроїв, виробів, тощо, яке було включене в даний опис, призначене винятково для мети забезпечення контексту для даного винаходу. Це не слід сприймати як припущення того, що будь-яке або всі ці питання складають частину основи попереднього рівня техніки або є загальновідомими в галузі, релевантній даному винаходу, оскільки вони існували до дати пріоритету кожного пункту формули даної заявки. Посилання 10 27 UA 102069 C2 28