Гуманізоване антитіло до cd44, яке опосередковує цитотоксичність відносно ракових клітин

Реферат: Винахід належить до гуманізованого антитіла, що специфічно зв'язується з тим же епітопом людського CD44, що і виділене моноклональне антитіло, яке продукується лінією клітин гібридоми Н460-16-2, що має реєстраційний номер АТСС РТА-4621. Також даний винахід належить до композиції, що містить гуманізоване антитіло, та має ефективність відносно лікування людської пухлини. UA 98332 C2 (12) UA 98332 C2 UA 98332 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід відноситься до діагностики й лікування ракових захворювань, насамперед до досягнення цитотоксичної дії відносно пухлинних клітин; і найбільше переважно до застосування антитіл, що модифікують ракові захворювання (CDMAB), необов'язково у складі комбінації, що включає один або декілька CDMAB/хіміотерапевтичних агентів, як засоби, що ініціюють цитотоксичну відповідь. Винахід відноситься також до аналізів зв'язування, у яких застосовують CDMAB, запропонований у даному винаході. Роль CD44 при раку: Вироблення моноклональних антитіл до людських лейкоцитів приводить до виявлення антигену CD44, одноланцюгову єднальну гіалуронову кислоту (ГК) глікопротеїну, що експресується у широкій розмаїтості здорових тканин і на всіх типах гематопоетичних клітин. Раніше вважали, що він асоційований з активацією й хомінгом лімфоцитів. У цей час передбачається, що його фізіологічна роль полягає також в активації запальних генів, модуляції клітинного циклу, індукції клітинної проліферації, індукції диференціювання й розвитку, індукції реорганізації цитоскелета й міграції клітин і виживанні/стійкості клітин, а апоптозу. У людей одноколійний ген CD44 локалізований на короткому плечі хромосоми 11, 11р13. Ген містить 19 екзонів; перші 5 є константними, наступні 9 є варіабельними, наступні 3 є константними й останні 2 є варіабельними. Диференційний сплайсінг може приводити до утворення понад 1000 різних ізоформ. Однак до теперішнього часу ідентифіковано тільки кілька дюжин варіантів, що зустрічаються у природних умовах. Стандартний глікопротеїн CD44 складається з N-кінцевого позаклітинного домену (який включає лідерну послідовність, що складається з 20 амінокислот (а.к.), і проксимальну щодо мембрани область (85 а.к.)) (270 а.к.), трансмембранної області (21 а.к.) і цитоплазматичного «хвоста» (72 а.к.). Позаклітинна область містить також модуль у вигляді єднальної ланки (шарнір) нa N-кінці. Ця область складається з 92 а.к. і має гомології з іншими ГК-зв'язаними білками-шарнірами. Існує високий ступінь гомології між мишачими й людськими формами CD44. Варіантні форми білка мають вставки на карбоксильному кінці екзону 5 і при експресії локалізуються позаклітинно. У природних умовах зустрічається також розчинна у сироватці форма CD44, і її виникнення може бути обумовлено або наявністю стоп-кодона (у варіабельній області), або протеолітичною активністю. Активація клітин під дією різних стимулів, включаючи TNF-α, приводить до виділення рецепторів CD44. Виділення рецепторів виявлене також у випадку пухлинних клітин, і воно може приводити до підвищення концентрації CD44 у людській сироватці аж до 10 разів. Високий рівень концентрації CD44 у сироватці асоційований зі злоякісним розвитком (виключенням є рак яєчника). Відома стандартна форма CD44 з молекулярною масою приблизно 37 кДа. Посттрансляційні модифікації приводять до підвищення молекулярної маси до 80-90 кДа. Ці модифікації включають N-зв'язане глікозілування на залишках аспарагіну на амінокінці позаклітинного домену, О-зв'язане глікозілування на залишках серину/треоніну на карбоксикінці позаклітинного домену й додавання глікозаміногліканів. Розмір сплайсінгових варіантів може становити від 80 до 250 кДа. ГК, полісахарид, локалізований у позаклітинному матриксі (ЕСМ) у ссавців, імовірно, є основним лігандом CD44. Однак установлено, що CD44 зв'язується також з такими білками як колаген, фібронектин, ламінін тощо. Імовірно, існує кореляція між зв'язуванням ГК і глікозілуванням. Неактивний CD44 (який не зв'язується із ГК) має найбільш високі рівні глікозілування, активний CD44 (який зв'язується із ГК) має найменші рівні глікозілування, а індуцибельний CD44 (який не зв'язується взагалі або зв'язується лише в незначному ступені із ГК без активації цитокінами, моноклональними антитілами, факторами росту тощо) має рівні глікозілування, які перебувають між рівнями, характерними для активних і неактивних форм. CD44 може опосередковувати деякі із властивих йому функцій через шляхи трансдукції сигналів, які залежать від взаємодії клітини, стимулу й навколишнього середовища. Деякі із цих шляхів включають каскад сигналів NFκВ (що приймають участь у запальній відповіді), шлях трансдукції сигналу Ras-MAPK (що приймають участь в активації циклічного розвитку й проліферації клітин), Rho-сімейство білків (які беруть участь у реорганізації цитоскелета й клітинної міграції) і родинний РІ3-К шлях передачі сигналу (пов'язаний з виживанням клітин). Усі з перерахованих вище функцій тісно пов'язані з ініціацією й розвитком пухлинного захворювання. Роль, що грає CD44 при раку, зв'язана також з різними додатковими механізмами. Вони включають презентацію факторів росту, хемокінів і цитокінів за допомогою протеогліканів клітинної поверхні розташованим на клітинній поверхні рецепторам CD44, які беруть участь у розвитку злоякісного захворювання. Крім того, внутрішньоклітинне розщеплення ГК лізосомальними гіалуронідазами після інтерналізації комплексу CD44-FK 1 UA 98332 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 потенційно може підвищувати ймовірність інвазивності пухлини й індукції ангіогенезу через ЕСМ. Крім того, встановлено, що трансмісія сигналів виживання або апоптоза має місце або через стандартний, або через варіабельний CD44-рецептор. Передбачається також, що CD44 бере участь у диференціюванні й міграції клітин. Багато, якщо не всі, із цих механізмів залежать від навколишнього середовища й клітини, і це іноді приводить до одержання варіабельних результатів. Таким чином, перед видачею висновків необхідно більше докладне дослідження. Для обґрунтування потенційної функціональної ролі CD44 при раку були проведені дослідження експресії CD44 для рішення питання про те, чи корелює різна експресія рецептора з розвитком захворювання. Однак для більшості типів пухлин були отримані результати, які не погоджуються між собою, що, імовірно, було обумовлено комбінацією факторів, включаючи реагенти, методики, оцінку патології й типи клітин, які були різними у різних дослідженнях. Печінковоклітинна карцинома й неходжкінська лімфома, імовірно, є виключенням, тому що для пацієнтів з пухлинами, у яких має місце високий рівень експресії CD44, як правило, характерно більш короткий час життя, чим для аналогічних пацієнтів, у яких виявлений низький рівень експресії або відсутність експресії CD44. Через його асоціацію з раком CD44 використали як мішень при розробці протиракових терапій. Існують протилежні думки, що стосуються того, стандартні або варіантні форми CD44 необхідні для розвитку пухлини. Відомі отримані in vivo з використанням створених на тваринних моделях дані, що підтверджують обидві точки зору, і це також може залежати від типу пухлини й навіть типу клітин. Різні терапевтичні підходи включають ін'єкцію розчинних білків CD44, кДНК гіалуронсинтази, гіалуронідази, застосування антисенсових конструкцій до CD44 і специфічних антитіл до CD44. Кожен підхід забезпечував певний ступінь успіху й підтверджує перспективність анти-CD44-протиракових терапій. Експериментально були створені як варіанти, так і стандартні CD44-специфічні моноклональні антитіла, але більшість цих антитіл не мають властиву їм біологічну активність, скоріше вони специфічно зв'язуються з типом CD44, який вони розпізнають. Однак відомий ряд антитіл, які мають активність або ш vitro, або in vivo, але практично відсутні антитіла, що мають обидва види активності. Встановлено, що деякі антитіла до CD44 опосередкують події в клітині. Наприклад, встановлено, що мишаче антитіло A3D8 до стандартної форми людського еритроцитарного лютеранського антигену CD44 підвищує опосередковувану CD2 (антитіло 9-1) і CD3 (антитіло ОКТ3) Т-клітинну активацію; інше антитіло до CD44 має аналогічні дії. A3D8 індукувало також вивільнення IL-1 моноцитами й вивільнення IL-2 Т-лімфоцитами. Важливо відзначити, що застосування A3D8 у сполученні з лікарськими засобами, такими як даунорубіцин, мітоксантрон й етопозід, інгібувало індукцію апоптоза клітин ліній HL60 й NB4 AML (гострий мієлобластий лейкоз) шляхом припинення утворення вторинного месенджера цераміду. Антитіло Л 73, що не має вроджену активність і спрямовано проти подібного епітопу CD44, не інгібувало індукуємий лікарським засобом апоптоз. Крім того, A3D8 й інше моноклональне антитіло до CD44, Н90, а також гіалуронан, індукували диференціювання лейкозних бластних клітин, отриманих з організму страждаючих гострим мієлобластним лейкозом (AML) пацієнтів. Однак у цьому ж дослідженні встановлено, що антитіло J173, що зв'язується також зі стандартною формою CD44, не індукується диференціювання цих же клітин. Важливо відзначити, що Н90 не зв'язувалося з AML-клітинами з підгрупи пацієнтів, AMLклітини яких зв'язувалися з J173, що свідчить про те, що ці антитіла розпізнають різні епітопи. В іншому дослідженні й A3D8, і Н90 індукували остаточне диференціювання деяких виведених з AML клітинних ліній. Антитіло NIH44-1 до форм CD44 з молекулярною масою 85-110 кДа й 200 кДа підсилювало Т-клітинну проліферацію через шлях, що, по припущенню авторів цього дослідження, залежить або від перехресного зшивання, або від агрегації CD44. У цілому, відсутні доказу того, що антитіла як такі можна застосовувати у терапії раку, оскільки вони або не мають спрямований вплив на рак (наприклад, активують лімфоцити), індукують клітинну проліферацію, або при їхньому застосуванні у сполученні із цитотоксичним лікарським засобом відбувається інгібування індукуємої лікарським засобом загибелі ракових клітин. Описано кілька антитіл до CD44, для яких продемонстрована протипухлинна активність in vivo. Антитіло Н90 являє собою моноклональне мишаче антитіло, отримане шляхом імунізації мишей людськими еритроцитами (RBC), і яке, як установлено, зв'язується з усіма ізоформами CD44. Введення цього антитіла тричі на тиждень протягом 4 тижнів опроміненим мишам лінії NOD-SCID, яким попередньо інокулювали людські AML-клітини, блокувало повторне заселення цими клітинами. Крім того, серійний пасаж AML-клітин із цих тварин не приводив до повторного заселення мишей-реципієнтів, коли клітини одержували з організму тварин, яких піддавали обробці антитілом Н90. Дія цього антитіла, імовірно, опосередковується взаємодією з диференціюванням лейкозних стовбурних клітин і взаємодією AML-клітин з відповідною нішею. 2 UA 98332 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, не виявлено впливів обробки на повторне заселення опромінених тваринні лінії NODSCID стовбурними клітинами пуповинної крові людини, що свідчить про виборчу дію антитіла, а також про важливі фенотипові розходження між AML-клітинами й здоровими людськими гематопоетичними стовбурними клітинами. Встановлено, що антитіло 1.1ASML, мишаче антитіло у вигляді IgG1 до v6-варіанта CD44, знижує метастази у лімфатичні вузли й легеню щурячої аденокарциноми підшлункової залози лінії BSp73ASML. Відповідно підвищувалася виживаність оброблених тварин. Антитіло мало ефективність тільки при його введенні до колонізації лімфатичних вузлів й, як передбачається, впливає на клітинну проліферацію у лімфатичному вузлі. Не виявлено безпосереднього цитотоксичного впливу антитіла на пухлинні клітини in vitro, і антитіло не підвищувало комплементзалежну цитотоксичність або функцію імунних ефекторних клітин. Можливість застосування антитіла відносно людських клітин не описана. Вrеуеr зі співавторами описали застосування антитіла, що поступив у продаж, до CD44 для порушення розвитку ортотопічно імплантованої щурячої гліобластоми. Клітинну лінію щурячої гліобластоми С6 імплантували у лобову частку й через 1 тиждень пацюкам тричі вводили антитіло за допомогою інтрацеребральної ін'єкції. В оброблених пацюків виявлене вповільнення росту пухлин і більша вага тіла у порівнянні з пацюками, обробленими буфером або контрольним ізотипом. Антитіло мало також здатність інгібувати адгезію in vitro клітин до покривних стекол, на які були нанесені компоненти позаклітинного матрикса, але не мали ніякої безпосередньої цитотоксичної дії на клітини. Це антитіло не оцінювали відносно людських клітин. Було проведено також дослідження, у якому порівнювали ефективність антитіла до CD44 (ІМ-7.8.1) з ефективністю антитіла до CD44v10 (K926). Мишам імплантували внутрівенно лінію мишачої меланоми B16F10, що має більший метастатичний потенціал, яка експресувала обидві ізоформи CD44. Через 2 дні антитіла вводили кожні три дні протягом усього часу досліду. Обидва антитіла викликали помітне зниження більше ніж на 50 % кількості метастазів у легеню; не виявлено істотного розходження в ефективності двох антитіл. Антитіло не робило впливу на проліферацію in vitro, і автори цього дослідження, Zawadzki зі співавторами, припустили, що інгібування росту пухлин було пов'язане з тим, що антитіло блокувало взаємодію CD44 з його лігандом. В іншому дослідженні з використанням ІМ-7.8.1, Zahalka зі співавторами продемонстрували, що антитіло і його Р(аb')2-фрагмент мали здатність блокувати інфільтрацію мишачої Т-клітинної лімфоми LB у лімфатичні вузли. Це робило виражений сприятливий вплив на виживаність мишей. Wallach-Dayan зі співавторами продемонстрували, що трансфекція мишачої лімфоми LB-TRs, що спонтанно не утворює пухлини, CD44v4-v10 надавала здатність формувати пухлини. Введення ІМ-7.8.1 приводило до зниження розміру пухлин з імплантованих трансфектованих клітин у порівнянні з обробкою антитілом, що застосовувалось як контроль, відповідного ізотипу. У жодному із цих досліджень не продемонстрована можливість застосування зазначеного антитіла для лікування людини. GKW.A3, мишаче антитіло у вигляді IgG2a, є специфічним для людського CD44 і попереджає утворення метастазів ксенотрансплантату людської меланоми у мишей лінії SCID. Антитіло змішували лінією людських клітин SMMU-2, що утворює метастази, а потім ін'єктували підшкірно. Обробку продовжували протягом 3 тижнів. Через 4 тижні тільки в однієї миші з 10 розвилася пухлина в області ін'єкції, у порівнянні з 100 % у неопрацьованих тварин. Для Р(аb')2фрагмента антитіла продемонстрована така ж здатність інгібувати утворення пухлин, це дозволяє припустити, що механізм дії не залежить від комплемент- або антитілообумовленої клітиннозалежної цитотоксичності. Якщо пухлинні клітини ін'єктували за 1 тиждень до першої ін'єкції антитіла, то у 80 % тварин розвивалися пухлини в області первинної ін'єкції. Однак виявлено, що тривалість виживання знижувалося ще істотніше. Хоча відкладене введення антитіло не впливало на утворення первинної пухлини, воно повністю придушувало метастази у легеню, нирку, надниркову залозу, печінку й очеревину, які мали місце у неопрацьованих тварин. Це антитіло не мало якої-небудь безпосередньої цитотоксичності відносно ліній клітин in vitro і не робило впливу на проліферацію SMMU-2-клітин, і імовірно, головним шляхом впливу на утворення пухлини був вплив на метастази або ріст пухлин. Однією з головних особливостей цього антитіла є його здатність розпізнавати всі ізоформи CD44, що, імовірно, обмежує можливість його терапевтичного застосування. Strobel зі співавторами описали застосування антитіла до CD44 (клон 515) на мишачій моделі ксенотрансплантату для інгібування перитонеально імплантованих людських ракових клітин яєчника. Лінію людських клітин рака яєчника 36М2 імплантували внутрішньочеревинно мишам у присутності антитіла до CD44 або контрольного антитіла й потім здійснювали обробки протягом наступних 20 днів. Через 5 тижнів у тварин обробленої антитілом групи виявлене 3 UA 98332 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 істотне зменшення кількості вузлів у черевній порожнині. Вузли, отримані як з організму оброблених антитілом до CD44 мишей, так й оброблених контролем тварин, мали однаковий розмір, що дозволяє припустити, що після того, як клітини імплантовані, антитіло не робило впливу на ріст пухлин. Коли клітини імплантували підшкірно, також не виявлено впливи на ріст пухлин, це свідчить про те, що саме антитіло не мало антипроліферативної або цитотоксичної дії. Крім того, не виявлено ніякого впливу антитіла на ріст клітин in vitro. VFF-18, позначене також як BIWA 1, являє собою високоафінне антитіло до варіанта v6 CD44, специфічному відносно 360-370-області поліпептиду. Це антитіло застосовували у 99m вигляді міченого технецієм кон'югата на фазі 1 клінічного випробування на 12 пацієнтах. Оцінювали безпеку антитіла й потенціал його цілеспрямованого впливу відносно пацієнтів, що страждають плоскоклітинною карциномою голови й шиї. Через 40 год після ін'єкції 14 % ін'єктованої дози поглиналося пухлиною, при цьому виявлене мінімальне нагромадження в інших органах, включаючи нирки, селезінку й кістковий мозок. Висока вибірковість зв'язування з пухлиною дозволяє припустити можливість застосування цього антитіла у радіоімунотерапії, хоча надмірно висока афінність цього антитіла перешкоджає його проникненню у більш глибокі шари пухлини. Ще одне обмежуюче застосування BIWA 1 фактором є імуногенність мишачого антитіла (в 11 з 12 пацієнтів утворилися людські антимишачі антитіла (НАМА)), гетерогенне нагромадження у пухлини й утворення комплексів антитіло-розчинний CD44. У WO 02/094879 описана гуманізована версія VFF-18, створена для того, щоб уникнути НАМА-відповіді, яка позначена як BIWA 4. Встановлено, що BIWA 4 має істотно більш низьку афінність до зв'язування антигену, чим батьківське антитіло VFF. Зненацька було встановлено, що антитіло BIWA 4, яке має більш низьку афінність, мало підвищену здатність поглинатися пухлиною у порівнянні з антитілом BIWA 8, яке має більш високу афінність, представляє собою 99m 186 гуманізоване антитіло VFF-18. Як мічені технецієм, так і мічені ренієм антитіла BIWA 4 оцінювали у відношенні 33 пацієнтів на фазі 1 клінічного випробування з метою визначення 186 безпеки, перенесення, накопичення пухлиною й максимально стерпної дози для Rе-міченого 99m BIWA 4. Виявлено аналогічне нагромадження пухлиною Тс-міченого BIWA 4. Не виявлено 186 відповідей пухлин на всі дози Re-міченого BIWA 4, хоча у ряді випадків виявлене стабільне 2 захворювання; обмежуюча дозу токсичність відповідала 60 мКи/м . Рівень побічних дій становив 50-65 %, при цьому у 12 з 33 пацієнтів виявлені серйозні побічні дії (тромбоцитопенія, 186 лейкопенія й лихоманка) і з них 6 пацієнтів, яких усіх лікували за допомогою Re-міченого BIWA 4, померли у процесі лікування або пізніше через прогресування захворювання. У двох пацієнтів виявлене утворення людських антилюдських антитіл (НАНА). Фазу 1 випробування з 186 використанням зростаючих доз Rе-міченого BIWA 4 здійснювали на 20 пацієнтах. Виявлений оральний мукозит й обмежуючу дозу тромбоцитопенія й лейкоцитопенія; в одного пацієнта розвилася НАНА-відповідь. Стабільний стан хвороби виявлений у 5 пацієнтів, яких лікували з 2 використанням найбільш високої з вивчених доз, що становить 60 мКи/м . Хоча лікування вважається прийнятним з позицій і безпеки, і перенесення з урахуванням отриманої ефективності, у цих випробуваннях ступінь побічних дій виявилася вище у порівнянні з вивченими в клінічних випробуваннях терапіями, заснованими на застосуванні біологічних засобів у вигляді кон'югатів з нерадіоактивними агентами. У заявці US 2003/0103985 описана гуманізована версія VFF-18, кон'югована з майтансиноїдом, позначена як BIWI1, призначена для протипухлинного лікування. Встановлено, що гуманізоване антитіло VFF 18, BIWA 4, при кон'югації з токсином, тобто BIWI 1, мало виражену протипухлинну дію на створених на мишах моделях людської епідермоїдної карциноми вульви, плоскоклітинної карциноми глотки або карциноми молочної залози. Не кон'югована версія, тобто BIWA 4, не мала протиракову дію. На фазі 1 одного з випробувань BIWI 1, у якому брали участь пацієнти з неоперабельним раком голови й шиї, не вдалося визначити максимальну стерпну дозу (MTD) через передчасне переривання випробування внаслідок смерті одного з пацієнтів у результаті масивної шкірної токсичності. У паралельному другому випробуванні BIWI 1, у якому також брали участь пацієнти, що страждають раком голови й шиї, MTD була визначена й була результатом шкірної токсичності. У третьому випробуванні BIWI 1, у якому брали участь пацієнти з метастатичним раком легені, що раніше піддавалися хіміотерапії, найпоширенішими ознаками токсичності були слабкі й короткочасні шкірні порушення. У цьому випробуванні, хоча в ньому не були виявлені об'єктивні критерії ефективності, у 50 % пацієнтів, що піддавалися лікуванню, виявлений незалежний від дози стабільний стан хвороби. У всіх цих випробуваннях співвідношення загального ризику виникнення негативних впливів й ефективності, через відсутність можливості пророкувати летальні випадки, привело до припинення подальшого дослідження цього лікарського засобу. 4 UA 98332 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 МАт U36 являє собою мишаче моноклональне антитіло у вигляді IgG1, отримане у результаті імунізації лінією клітин людської карциноми гіпофарінкса UM-SCC-22B і селекції відносно раку й тканеспецифічності. Характеризація антигену за допомогою клонування й секвенування до ДНК дозволила ідентифікувати v6-домен кератиноцитспецифічного сплайсінгового варіанта епіка на (гепаран/хондроітинсульфатпротеоліканова форма CD44) CD44 як мішень МАт U36. Імуногістохімічні дослідження дозволили встановити, що епітоп обмежено клітинною мембраною. Крім того, виявлений значний рівень включення (мічення) МАт U36 94 % зразків плоскоклітинних карцином рака голови й шиї (HNSCC), і в цих пухлинах забарвлювання клітин було однорідним. У 10 пацієнтів, які входили в групу, що обробляли 99m Тс-міченим МАт U36, виявлене виборче накопичення антитіла у клітинах HNSCC (20,4+/-12,4 % ін'єкуємої дози/кг протягом 2 днів); не описані побічні дії, але у двох пацієнтів розвилася НАМА-відповідь. При випробуванні міченого радіоактивним йодом мишачий МАт U36 у 3 з 18 пацієнтів виявлені НАМА-відповідь і селективне гомогенне поглинання HNSCC. З метою зниження антигенності МАт U36 і зниження рівня НАМА конструювали химерне антитіло. Ні химерне, ні вихідне мишаче МАт U36 не мало ADCC-активність. Відсутні дані про нативну функціональну активність МАт U36. Для оцінки можливості застосування МАт U36 як 186 терапевтичний агент використовували Rе-мічене химерне МАт U36. На фазі 1 випробування з 99m використанням зростаючих доз 13 пацієнтам уводили попередньо встановлену дозу Тс186 міченого химерного МАт U36, а потім Rе-міченого химерного МАт U36. Не описані гострі 2 побічні дії, але після обробки виявлена мієлотоксичність, що обмежує дозу (1,5 ГБк/м ), у 2 з 3 пацієнтів і тромбоцитопенія в одного пацієнта, обробленого максимальнодопустимою дозою 2 (1,0 ГБк/м ). Хоча виявлено певний вплив на розмір пухлини, ця ефективність не задовольняла 186 критеріям об'єктивних реакцій на лікування. У додатковому випробуванні Re-міченого химерного МАт U36 застосовували стратегію, засновану на застосуванні реінфузії цільної крові, стимульованої колонностимулуючим фактором гранулоцитів, для подвоєння максимально допустимої активності до 2,8 Гр. У цьому випробуванні брало участь 9 пацієнтів з різними пухлинам голови й шиї, 3 мали потребу у трансфузіях через пов'язану з лікарським засобом анемію. Інші прояви токсичності включали мієлотоксичність третього ступеня й мукозит другого ступеня. Не описано об'єктивних відповідей пухлин, хоча стабільний стан хвороби виявлений у 5 пацієнтів протягом 3-5 місяців. Таким чином, очевидно, що хоча МАт U36 являє собою високоспецифічне антитіло, недоліком є те, що длядосягнення протиракової ефективності його потрібно застосовувати у вигляді радіоімунокон'югата, що обмежує можливість його використання через токсичність, асоційовану з терапією, що необхідна для досягнення клінічної дії. У цілому, встановлено, що моноклональні антитіла до CD44v6 (1.1ASML) і CD44v10 (K926) знижують метастатичну активність у пацюків, яким ін'єктували клітини метастатичної аденокарциноми підшлункової залози, або мишей, яким ін'єктували клітини злоякісної меланоми відповідно. Встановлено, що інше антитіло до CD44v6 (VFF-18 і його похідні) має протипухлинну активність тільки після кон'югації з майтансиноїдом або радіоактивним ізотопом. Встановлено також, що моноклональні антитіла до стандартного CD44 придушують внутрішньоцеребральний розвиток щурячої гліобластоми (антитіла до CD44), інвазію у лімфатичні вузли мишачої Тклітинної лімфоми (ІМ-7.8.1), а також інгібують імплантацію лінії клітин людського раку яєчника у безтимусних мишей (клон 515), метастази у легеню лінії клітин мишачої меланоми (ІМ-7.8.1) і метастази лінії клітин людської меланоми у SCID-мишей (GKW.A3). Кон'юговане з радіоактивним ізотопом антитіло МАт U36 до CD44v6 і його похідні мали протипухлинну активність у клінічних випробуваннях, але це супроводжувалося вираженою токсичністю. Ці результати, хоча вони є підбадьорюючими й підкріплюють перспективність створення моноклональних антитіл до CD44 у якості потенційних протиракових засобів, свідчать про обмежену ефективність, недостатню безпеку або обмежену можливість застосування для лікування раку у людини. Таким чином, якщо буде створена композиція антитіл, яка опосередковує цитотоксичність відносно ракових клітин у результаті її атрактивності до експресованого на поверхні зазначених клітин CD44, можна буде реалізувати корисні діагностичні й терапевтичні процедури. Моноклональні антитіла як засоби протиракової терапії: Кожний страждаючий раком індивідуум є сам по собі унікальним і має злоякісний стан, відмінний від злоякісних станів, ідентифікованих в інших індивідуумів. Незважаючи на це, за допомогою сучасної терапії всіх пацієнтів з однаковим типом раку на однаковій стадії розвитку лікують однаковим чином. Щонайменше 30 % цих пацієнтів не піддаються терапії першої лінії, що приводить до додаткових циклів лікування й до підвищення ймовірності безуспішності лікування, до утворення метастазів і зрештою до смерті. Найбільш ефективним підходом до 5 UA 98332 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лікування повинно бути «підстроювання» терапії під конкретного пацієнта. Єдиним видом сучасної терапії, що задовольняє вимозі «підстроювання» під конкретного пацієнта, є хірургічне втручання. Хіміотерапія й променева терапія не можуть бути спеціально пристосовані для пацієнта, а хірургія сама по собі в більшості випадків є неадекватною з позицій досягнення лікування. З появою моноклональних антитіл можливість створення методів, придатних для конкретного пацієнта, стала більше реалістичною, оскільки кожне антитіло може бути спрямоване проти індивідуального епітопу. Крім того, це дозволяє створювати комбінацію антитіл, спрямовану проти групи епітопів, які є унікальними для конкретної пухлини в індивідуума. Після встановлення того факту, що істотне розходження між злоякісними й здоровими клітинами полягає в тому, що злоякісні клітини містять антигени, специфічні для трансформованих клітин, наукове співтовариство протягом довгого часу дотримувалося тієї думки, що можна створювати моноклональні антитіла, призначені для специфічного впливу на трансформовані клітини шляхом специфічного зв'язування із зазначеними раковими антигенами; це привело до переконання, що моноклональні антитіла можуть служити в якості «магічної кулі» для елімінації ракових клітин. Однак у цей час широко відомо, що жодне індивідуальне моноклональне антитіло не може мати ефективність при всіх стадіях раку, і що варто розробляти моноклональні антитіла, як цілий клас, для цілеспрямованого лікування раку. Встановлено, що моноклональні антитіла, виділені відповідно до способів, запропонованих у даному винаході, модифікують процес плину ракового захворювання найбільш сприятливим для пацієнта чином, наприклад, шляхом зниження пухлинного навантаження, і в контексті даного опису всю їх розмаїтість можна позначати як антитіла, що модифікують ракові захворювання (CDMAB), або «протиракові» антитіла. У цей час раковий хворий, як правило, має обмежений вибір шляхів лікування. Регламентований підхід до терапії раку забезпечив поліпшення з позицій виживаності й коефіцієнтів захворюваності у цілому. Однак для конкретного індивідуума ці статистичні поліпшення не обов'язково корелюють із поліпшенням його власної ситуації. Таким чином, створення методології, що дозволяє практикуючому лікареві лікувати кожну пухлину незалежно від інших пацієнтів у цій же групі, повинно забезпечити унікальний підхід, заснований на спеціальному підборі терапії для конкретного індивідуума. В ідеалі заснована на такому підході терапія повинна підвищувати рівень зцілення й забезпечувати поліпшений результат, задовольняючи тим самим давно назрілій вимозі. Історично для лікування раку в людей застосовувалися полікональні антитіла, але з обмеженим успіхом. З використанням людської плазми лікували лімфоми й лейкози, але при цьому лише у деяких випадках ремісія або відповідь були тривалими. Крім того, при цьому були відсутні відтворюваність і додаткова сприятлива дія у порівнянні з хіміотерапією. Щільні пухлини, такі як різні види раку молочної залози, меланоми й печінковоклітинні карциноми, також лікували з використанням людської крові, сироватки шимпанзе, людської плазми й кінської сироватки з аналогічними непередбаченими й неефективними результатами. Був проведений цілий ряд клінічних випробувань моноклональних антитіл по оцінці їхньої дії відносно щільних пухлин. У 1980-і роки проведено щонайменше чотири клінічних випробування за участю пацієнтів, що страждають раком молочної залози, з використанням антитіл до специфічних антигенів або тих, що мають селективність відносно конкретної тканини, у яких серед щонайменше 47 пацієнтів був виявлений тільки один респондер. Ця ситуація зберігалася аж до 1998 p., коли клінічне випробування успішно пройшло гуманізоване антитіло до Her2/neu (Herceptin®), що застосовується у сполученні із цисплатином. У цьому випробуванні оцінювали відповіді у 37 пацієнтів, серед яких приблизно в однієї чверті була виявлена часткова відповідь і ще в однієї чверті був виявлений слабкий або стабільний прогрес захворювання. Медіана часу до початку прогресування захворювання для респондерів становила 8,4 місяці, а медіана тривалості відповіді становила 5,3 місяці. У 1998 p. Herceptin® був дозволений як засіб для першої лінії терапії у сполученні з Тахоl®. Результати клінічного випробування продемонстрували збільшення медіани часу до початку прогресування захворювання для людей, яких лікували з використанням антитіла плюс Тахоl® (6,9 місяців), у порівнянні із групою, що лікували тільки з використанням Тахоl® (3,0 місяці). Було виявлено також невелике збільшення медіани виживаності; 22 місяця для варіанта лікування з використанням Herceptin® плюс Тахоl® проти 18 місяців для варіанта лікування з використанням тільки Тахоl®. Крім того, було виявлене збільшення кількості «повних» респондерів (8 % проти 2 %) і «часткових» респондерів (34 % проти 15 %) у групі, яку лікували комбінацією антитіло плюс Тахоl® у порівнянні із групою, яку лікували тільки Тахоl®. Однак 6 UA 98332 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лікування Herceptin® й Тахоl приводило до зростання випадків кардіотоксичності у порівнянні з лікуванням тільки Тахоl® (13 % проти 1 % відповідно). Крім того, терапія з використанням Herceptin® мала ефективність тільки для пацієнтів, для яких була характерна надекспресія (що встановлено по даним імуногістохімічного (ІГХ) аналізу) рецептора 2 людського епідермального фактора росту (Her2/neu), рецептора, для якого до теперішнього часу не встановлена функція й не виявлений біологічно важливий ліганд; тобто приблизно для 25 % пацієнтів з метастатичним раком молочної залози. Таким чином, усе ще існує більша група пацієнтів, що страждають раком молочної залози, потреби яких не задоволені. Навіть ті пацієнти, на яких лікування Herceptin® робило сприятливу дію, усе ще продовжують мати потребу у хіміотерапії, і тому вони можуть піддаватися, принаймні до деякої міри, побічним діям цього типу лікування. Для клінічних випробувань засобів проти колоректального рака використовували антитіла, мішенню яких були як глікопротеїни, так і гліколіпіди. Таке антитіло, як 17-1 А, що має певну специфічність відносно аденокарцином, пройшло фазу 2 клінічних випробувань, у яких брало участь понад 60 пацієнтів, при цьому тільки в одного пацієнта виявлена часткова відповідь. В інших випробуваннях 17-1А була виявлена тільки 1 повна відповідь й 2 слабких відповіді у групі, що складається з 52 пацієнтів, при використанні протоколу лікування, у якому додатково використовувався циклофосфамід. Результати, отримані до теперішнього часу на фазі III клінічних випробувань 17-1 А, не продемонстрували його підвищену ефективність при застосуванні як засіб допоміжної терапії відносно стадії III рака ободової кишки. Застосування гуманізованого мишачого моноклонального антитіла, використання якого спочатку було дозволено як засіб візуалізації, також не приводило до регресу пухлин. Тільки у цей час отримані деякі позитивні результати клінічних випробувань у відношенні колоректального рака із застосуванням моноклональних антитіл. У 2004 р. ERBITUX® був дозволений для застосування як засіб для другої лінії терапії для пацієнтів з характерною експресією EGFR метастатичним колоректальним раком, які мали стійкість до хіміотерапії на основі іринотекана. Результати як проведеного з використанням двох варіантів фази II клінічного випробування, так і проведеного з використанням одного варіанта клінічного випробування ERBITUX® у сполученні з іринотеканом продемонстрували відповідь на рівні 23 % й 15 % відповідно, при цьому медіана часу до початку прогресування захворювання становила 4,1 й 6,5 місяці відповідно. Результати цього ж проведеного з використанням двох варіантів фази II клінічного випробування й іншого проведеного з використанням одного варіанта клінічного випробування продемонстрували, що лікування тільки ERBITUX® приводило до відповіді на рівні 11 % й 9 % відповідно, при цьому медіана часу до початку прогресування захворювання становила 1,5 й 4,2 місяці відповідно. Таким чином, і у Швейцарії, і у Сполучених Штатах лікування з використанням ERBITUX® у сполученні з іринотеканом, а в Сполучених Штатах також і лікування з використанням тільки ERBITUX® схвалений як засіб для другої лінії терапії для пацієнтів, що страждають раком ободової кишки, які не піддавалися терапії першої лінії на основі іринотекана. Таким чином, також як у випадку Herceptin®, у Швейцарії дозволене лікування з використанням моноклонального антитіла тільки у комбінації з хіміотерапією. Крім того, і у Швейцарії, і у США для лікування пацієнтів дозволене його застосування тільки як терапія другої лінії. Крім того, у 2004 р. було дозволене застосування AVASTIN® у сполученні із заснованою на використанні 5фторурацилу внутрішньовенною хіміотерапією як терапія першої лінії для лікування метастатичного колоректального рака. Результати фази III клінічного випробування продемонстрували подовження медіани виживаності пацієнтів, яких лікували AVASTIN® плюс 5фторурацилом, у порівнянні з пацієнтами, яких лікували тільки 5-фторурацилом (20 місяців проти 16 місяців відповідно). Однак, так само як й у випадку Herceptin® й ERBITUX®, застосування моноклонального антитіла дозволено тільки у вигляді комбінації з хіміотерапією. Продовжують залишатися незадовільними також результати, досягнуті у відношенні лікування рака легені, головного мозку, яєчника, підшлункової залози, передміхурової залози й шлунка. Найбільш перспективні до теперішнього часу результати, що стосуються ефективності відносно не дрібноклітинного раку легені, були отримані на фазі II клінічних випробувань, у яких для лікування застосовували моноклональне антитіло (SGN-15; dox-BR96, анти-Sialyl-LeX), кон'юговане з лікарським засобом, що має здатність знищувати клітини, таким як доксорубіцин, у сполученні з хіміотерапевтичним засобом TAXOTERE®. TAXOTERE® є єдиним схваленим FDA хіміотерапевтичним засобом для терапії другої лінії рака легені. Попередні дані свідчать про підвищення загальної виживаності у порівнянні із застосуванням тільки TAXOTERE®. З 62 пацієнтів, що приймали участь у цьому випробуванні, дві третини лікували SGN-15 у сполученні з TAXOTERE®, а одна третина - тільки TAXOTERE®. Для пацієнтів, яких лікували SGN-15 у сполученні з TAXOTERE®, медіана загальної виживаності становила 7,3 місяці у порівнянні з 7 UA 98332 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 5,9 місяця для пацієнтів, яких лікували тільки TAXOTERE®. Загальна виживаність протягом 1 року й 18 місяців була виявлена у 29 % й 18 % пацієнтів відповідно, яких лікували SNG-15 плюс TAXOTERE®, у порівнянні з 24 % й 8 % відповідно в групі пацієнтів, яких лікували тільки TAXOTERE®. Плануються додаткові клінічні випробування. У доклінічних випробуваннях виявлена лише обмежена ефективність застосування моноклональних антитіл у випадку меланоми. Лише досить небагато із цих антитіл дійшли до етапу клінічних випробувань, і до теперішнього часу жодне з них не дозволено для застосування й ні для одного з них не продемонструвало сприятливу дію на фазі III клінічних випробувань. Розробці нових лікарських засобів, призначених для лікування захворювання, перешкоджає відсутність ідентифікації відповідних мішеней серед продуктів 30000 генів, для яких відомо, що вони можуть брати участь у патогенезі захворювання. В онкологічних дослідженнях потенційні мішені лікарських засобів часто вибирають просто на основі того факту, що для них характерна надекспресія у пухлинних клітинах. Ідентифіковані у такий спосіб мішені потім піддають скринінгу відносно взаємодії з безліччю сполук. Якщо є потенційна можливість їхнього застосування у терапіях, заснованих на використанні антитіл, то ці сполуки-кандидати, як правило, одержують традиційними методами шляхом створення моноклональних антитіл відповідно до фундаментальних принципів, розробленим Kohler й Milstein (Kohler й Milstein, Nature, 256, 1975, cc. 495-497). Одержують спленоцити з організму мишей, імунізованих антигеном (наприклад, із цілих клітин, клітинних фракцій, очищеного антигену), і зливають із іморталізованими клітинами гібридом як партнерів. Ці отримані гібридоми піддають скринінгу й відбирають по ознаці секреції антитіл, які зв'язуються з найбільшою авидністю з мішенню. Багато терапевтичних і діагностичних антитіл проти ракових клітин, включаючи Herceptin® й RITUXIMAB (ритуксимаб), були отримані за допомогою цих методів і відібрані на основі їх афінності. Відомо два недоліки цієї стратегії. По-перше, вибір відповідних мішеней для зв'язування терапевтичного або діагностичного антитіла обмежений недостатнім рівнем знань, що стосуються тканеспецифічних процесів онкогенезу й, як наслідок, спрощених методів, таких як добір по ознаці надекспресії, за допомогою яких ідентифікують ці мішені. По-друге, припущення про те, що молекула лікарського засобу, що зв'язується з рецептором з найбільшої афінністю, з високою часткою ймовірності буде ініціювати або інгібувати сигнал, не завжди виправдується. Незважаючи на певний прогрес в області лікування рака молочної залози й ободової кишки, ідентифікація й розробка ефективних заснованих на застосуванні антитіл терапій, або як індивідуальних агентів, або як компонент комбінованої терапії, для всіх типів раку є недостатньою. Патенти, що виступають як прототипи: В US 5750102 описаний процес, при здійсненні якого клітини з пухлини пацієнта трансфектують генами ГКГ, які можна клонувати із клітин або тканин з організму пацієнта. Ці трансфектовані клітини потім використовують для вакцинації пацієнта. В US 4861581 описаний процес, що включає стадії, на яких одержують моноклональні антитіла, що специфічно зв'язуються із внутрішнім клітинним компонентом неопластичних і здорових клітин ссавця, але не зв'язуються із зовнішніми компонентами, мітять моноклональне антитіло, приводять у контакт мічене антитіло із тканиною ссавця, що одержує терапію, яка призначена для знищення неопластичних клітин, і визначають ефективність терапії шляхом оцінки зв'язування міченого антитіла із внутрішнім клітинним компонентом, що піддаються дегенерації неопластичних клітин. При одержанні антитіл до людських внутрішньоклітинних антигенів при створенні зазначеного патенту було встановлено, що злоякісні клітини являють собою придатне джерело зазначених антигенів. В US 5171665 описане нове антитіло й спосіб його одержання. Зокрема, у патенті описане одержання моноклонального антитіла, що має виражену здатність до зв'язування з білковим антигеном, асоційованим з людськими пухлинами, наприклад пухлинами ободової кишки й легені, при цьому його здатність до зв'язування зі здоровими клітинами є істотно більш низькою. В US 5484596 описаний спосіб терапії рака, який полягає в тому, що видаляють хірургічним шляхом пухлинну тканину з організму, що страждає раком хворої людини, обробляють пухлинну тканину з одержанням пухлинних клітин, опромінюють пухлинні клітини, які повинні бути життєздатними, але не онкогенними, і застосовують ці клітини для створення вакцини для пацієнта, що може інгібувати рецидив первинної пухлини, одночасно інгібуючи метастази. У патенті описане створення моноклональних антитіл, які можуть вступати у взаємодію з поверхневими антигенами пухлинних клітин. Як зазначено у колонці 4, рядка 45 і далі, у патенті 8 UA 98332 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використовують автохтонні пухлинні клітини для створення моноклональних антитіл, які мають активність, що дозволяє використати їх для специфічної імунотерапії неоплазій у людини. В US 5693763 описаний глікопротеїновий антиген, характерний для людських карцином і незалежний від походження епітеліальної тканини. В US 5783186 описані антитіла до Неr2, які індукують апоптоз експресуючих Неr2 клітин, лінії клітин гібридом, продукуючих антитіла, способи лікування рака за допомогою антитіл і фармацевтичні композиції, до складу яких входять зазначені антитіла. В US 5849876 описані нові лінії клітин гібридом, призначені для одержання моноклональних антитіл до муцинових антигенів, виділених з пухлини й джерел, що не представляють собою пухлинну тканину. В US 5869268 описаний спосіб створення людських лімфоцитів, продукуючих антитіла, специфічні для необхідного антигену, спосіб одержання моноклонального антитіла, а також моноклональні антитіла, отримані зазначеним способом. У патенті описано, зокрема, одержання людського моноклонального антитіла до HD, яке можна застосовувати для діагностики й лікування раку. В US 5869045 описані антитіла, фрагменти антитіл, кон'югати антитіл й одноланцюгові імунотоксини, що мають здатність до взаємодії з клітинами людської карциноми. Механізм, за допомогою якого функціонують ці антитіла, є подвійним, і він полягає в тому, що молекули мають реактивність відносно антигенів клітинних мембран, які присутні на поверхні людських карцином, а, крім того, у тому, що антитіла мають здатність до інтерналізації всередині клітин карцином, з наступним зв'язуванням, що робить їх особливо цінними компонентами для утворення кон'югатів антитіл-лікарський засіб й антитіло-токсин. У не модифікованій формі у певних концентраціях антитіла також проявляють цитотоксичні властивості. В US 5780033 описане застосування аутоантитіл для лікування й профілактики пухлин. При цьому зазначене антитіло являє собою антиядерне аутоантитіло з організму старих ссавців. У цьому випадку вважається, що аутоантитіло відноситься до одного типу з антитілом, що зустрічається в природних умовах, імунної системи. Оскільки аутоантитіло одержують із організму «старих ссавців», не потрібно, щоб аутоантитіло було отримано конкретно з організму пацієнта, що підлягає лікуванню. Крім того, у патенті описане моноклональне аутоантитіло, що зустрічається у природних умовах, зі старого ссавця й лінії клітин гібридом, продукуючих моноклональне антиядерне аутоантитіло. В US 5916561 описане специфічне антитіло VFF-18 і його варіанти до варіанта екзону v6 гена CD44. Це антитіло має перевагу у порівнянні з порівнюваним антитілом, яка полягає в тому, що воно розпізнає варіант v6 людського CD44 більш ефективно, ніж варіант v6 щурячого CD44. Крім того, для цього антитіла описана можливість застосування у діагностичних аналізах експресії v6 CD44. Для цього антитіла не описана функція ні in vitro, ні in vivo. В US 5616468 описане моноклональне антитіло Var3.1 до синтетичного пептиду, що містить послідовність, яка кодується геном людського екзону 6A CD44. Зокрема, це антитіло не зв'язується з 90 кДа-формою людського CD44 і відрізняється від антитіла Hermes-3. Описано спосіб виявлення варіанта v6 CD44, а також спосіб скринінгу й аналізу злоякісної трансформації на основі цього антигену. Описаний також спосіб скринінгу запального захворювання на основі виявлення антигену у сироватці. В US 5879898 описане специфічне антитіло, що зв'язується зі екзоном варіанта 6 людського CD44, яке складається з 129 пар основ, що кодує пептид, який складається з 43 амінокислот. Моноклональне антитіло одержували з використанням декількох ліній клітин гібридом: MAKM-1.1.12, MAKM-2.42.3, MAKM-4.3.16. Антитіло створювали у вигляді злитого білка, що містить щонайменше гексапептид нової амінокислотної послідовності v6 CD44. Крім того, описаний імуноаналіз, призначений для виявлення варіанта екзону 6, який можна застосовувати для діагностики раку. Важливо відзначити, що для цього антитіла не описана функція ні in vitro, ні in vivo. В US 5942417 описаний полінуклеотид, що кодує CD44-подібний поліпептид, і спосіб одержання рекомбінантного білка за допомогою полінуклеотиду і його варіантів. Заявлено антитіла до цих поліпептидів, однак не представлені їхні конкретні приклади й не депоновані клони, секретуючі зазначені антитіла. Аналіз методом Нозерн-блоттінгу продемонстрував появу у тканинах декількох типів полінуклеотидів, але відсутні дані про трансляцію й експресію цього полінуклеотиду. Таким чином, відсутній доказ того, що отримано антитіла до генного продукту цього полінуклеотиду, і що ці тіла можуть мати функцію або in vitro, або in vivo, і що їх можна застосовувати для лікування ракового захворювання у людини. В US 5885575 описане антитіло, що взаємодіє з варіантом епітопу CD44, і способи ідентифікації варіанта за допомогою антитіла. Виділений полінуклеотид, що кодує цей варіант, 9 UA 98332 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виділяли із щурячих клітин, і антитіло МАт 1.1ASML до цього варіанта розпізнавало білки з молекулярною масою 120, 150, 180 й 200 кДа. Введення моноклонального антитіла 1.1ASML сповільнювало ріст і розвиток метастазів щурячого раку BSp73ASML в ізогених пацюків. Важливо відзначити, що 1.1ASML не розпізнавало людські пухлини, що продемонстровано по відсутності його реактивності у відношенні людської великоклітинної карциноми легені LCLC97. Людський гомолог виділяли з LCLC97, але не було отримано еквівалентне антитіло, що розпізнає цей гомолог. Таким чином, хоча було отримане антитіло, специфічне відносно варіанта щурячого CD44, і встановлено його вплив на ріст і метастази щурячої пухлини, не вдалося одержати доказ впливу цього антитіла на людські пухлини. Більш конкретно, автори зазначеного винаходу відзначають, що це антитіло не розпізнає людський рак. Короткий виклад сутності винаходу При створенні даного винаходу для виділення ліній клітин гібридом, які кодують модифіковані ракове захворювання моноклональні антитіла, використовували методологію одержання специфічних для пацієнта протиракових антитіл, викладену в US 6180357. Ці антитіла можна створювати специфічно для індивідуальної пухлини, і це уможливлює забезпечувати «підстроювання» протиракової терапії під конкретного пацієнта. У контексті даного опису протиракові антитіла, які мають здатність, як знищувати клітини (цитотоксична активність), так й інгібувати клітинний ріст (цитостатична активність), позначені нижче як цитотоксичні антитіла. Ці антитіла можна застосовувати з метою визначення стадії захворювання й діагностики раку і їх можна застосовувати для лікування метастазів пухлин. Ці антитіла можна застосовувати також для попередження раку як засіб профілактичного лікування. На відміну від антитіл, створених на основі традиційних принципів розробки лікарських засобів, антитіла, отримані таким шляхом, можна застосовувати для цілеспрямованого виявлення молекул і шляхів, для яких раніше не встановлено, що вони асоційовані з ростом й/або життєздатністю злоякісної тканини. Крім того, афінності до зв'язування цих антитіл відповідають вимогам, необхідним для ініціації випадків цитотоксичності, які можуть не задовольняти зазначеним вимогам при більш сильних афінних взаємодіях. Крім того, під обсяг даного винаходу підпадає кон'югація зі стандартними хіміотерапевтичними субстанціями, наприклад, радіонуклідами, CDMAB, запропонованими у даному винаході, що забезпечує сфальцьоване застосування зазначених хіміотерапевтичних засобів. CDMAB можна кон'югувати також з токсинами, цитотоксичними фрагментами, ферментами, наприклад, кон'югованими з біотином ферментами, цитокінами, інтерферонами, що представляють собою мішені або репортерними залишками або гематогенними клітинами, з одержанням кон'югата антитіла. CDMAB можна застосовувати індивідуально або в комбінації з одним або декількома CDMAB/хіміотерапевтичними агентами. Перспектива індивідуалізованого протиракового лікування повинна змінити шлях надання допомоги пацієнтові. Кращий клінічний сценарій передбачає вилучення зразка пухлини в момент її появи й переміщення зразка у банк. Із цього зразка пухлину можна типувати із використанням панелі раніше існуючих антитіл, що модифікують ракове захворювання. Пацієнт може мати встановлену загальноприйнятим шляхом стадію захворювання, але для додаткового уточнення стадії захворювання можна застосовувати доступні антитіла. Пацієнта можна лікувати безпосередньо за допомогою існуючих антитіл, і панель антитіл, специфічних для пухлини, можна одержувати або з використанням методів, викладених у даному описі, або шляхом застосування фагових дисплейних бібліотек у сполученні зметодами скринінгу, викладеними у даному описі. Всі створені антитіла можна додавати у бібліотеку протиракових антитіл, оскільки існує ймовірність того, що інші пухлини можуть нести деякі з таких же епітопів, що й підлягаюча лікуванню пухлина. Антитіла, отримані відповідно до цього способу, можна застосовувати для лікування ракового захворювання у будь-яких інших пацієнтів, у яких рак асоційований із цими антитілами. Крім терапії з використанням протиракових антитіл пацієнта можна піддавати рекомендованим у цей час терапіям як частину мультимодального підходу до лікування. Той факт, що антитіла, виділені з використанням представленої у даному описі методології, є відносно нетоксичними відносно неракових клітин, дозволяє застосовувати комбінації з високими дозами антитіл або індивідуально, або у сполученні із загальноприйнятою терапією. Високий терапевтичний індекс повинен також дозволяти проводити повторну обробку протягом відносного невеликого проміжку часу, що повинно знижувати ймовірність появи стійких до лікування клітин. Якщо пацієнт є несприйнятливим до початкового курсу терапії або в нього утворюються метастази, то процес створення специфічних для пухлини антитіл можна повторювати для здійснення повторної обробки. Крім того, протиракові антитіла можна кон'югувати із 10 UA 98332 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 еритроцитами, отриманими з організму пацієнта, і здійснювати реінфузію для лікування метастазів. Відомо небагато ефективних режимів лікування метастатичного раку й метастазів, які, як правило, є провісниками несприятливого результату, що приводить до смерті. Однак метастатичний рак, як правило, характеризується розвиненою системою кровоносних судин і введення протиракових антитіл за допомогою еритроцитів може впливати на концентрацію антитіл в області пухлини. Навіть до виникнення метастазів виживання більшості ракових клітин залежить від поставки крові хазяїна, і протиракові антитіла, кон'юговані з еритроцитами, можуть мати ефективність також відносно пухлин in situ. В альтернативному варіанті антитіла можна кон'югувати із іншими гематогенними клітинами, наприклад, лімфоцитами, макрофагами, моноцитами, природними клітинами-кіл ерами тощо. Відомо п'ять класів антитіл і кожний з них асоційований з функцією, що обумовлюється його важким ланцюгом. Як правило, вважається, що знищення ракових клітин «оголеними» антитілами опосередковується або антитіло-обумовленою клітиннозалежною цитотоксичністю (ADCC), або комплементзалежною цитотоксичністю (CDC). Наприклад, мишачі антитіла типу IgM й IgG2a можуть активувати людський комплемент шляхом зв'язування С-1 компонента системи комплементу, активуючи тим самим класичний шлях активації комплементу, що може приводити до лізису пухлини. Серед людських антитіл найбільш ефективного антитіла, що активують комплемент, як правило, відносяться до типу IgM й IgG1. Мишачі антитіла ізотипу IgG2a й IgG3 мають ефективність у відношенні рекрутменту цитотоксичних клітин, які мають Fcрецептори, що приводить до знищення клітин моноцитами, макрофагами, гранулоцитами й певними видами лімфоцитів. Людські антитіла ізотипу IgG1 й IgG3 опосередкують ADCC. Для цитотоксичності, опосередкованої Fc-областю, необхідна присутність ефекторних клітин, відповідних типів рецепторів або білків, наприклад, NK-клітин, Т-клітин і комплементу. У відсутності цих ефекторних механізмів Fc-фрагмент антитіла є інертним. Fc-фрагмент антитіла може обумовлювати властивості, які впливають на фармакокінетичні характеристики антитіла in vivo, але не є функціональними in vitro. Інший можливий механізм опосередкованого антитілами знищення клітин пов'язаний із застосуванням антитіл, так званих каталітичних антитіл, функцією яких є каталіз гідролізу різних хімічних зв'язків у клітинних мембранах й асоційованих з ними глікопротеїнів або гліколіпідів. Відомо три додаткових механізми опосередкованого антитілами знищення клітин. Перший механізм заснований на застосуванні антитіл як вакцини для індукції здатності організму продукувати імунну відповідь проти передбачуваного антигену, що присутній на раковій клітині. Другий механізм заснований на застосуванні антитіл для спрямованого переносу до асоційованого з факторами росту рецепторам і впливу на їхню функцію або для регуляції по типу негативного зв'язку зазначеного рецептора, у результаті чого відбувається ефективне зниження його функції. Третій механізм заснований на впливі зазначених антитіл на безпосереднє лігування залишків, що перебувають на клітинній поверхні, що може приводити до безпосередньої клітинної загибелі, наприклад, лігування з доменами «рецепторів смерті», таких як TRAIL R1 або TRAIL R2, або з молекулами інтегрина, такими як альфа V бета 3 тощо. Клінічна застосовність протиракового лікарського засобу заснована на сприятливому впливі лікарського засобу за умови прийнятного профілю ризику для пацієнта. У протираковій терапії, як правило, найбільш важливим після сприятливого впливу показником є виживаність, однак відомо декілька інших добре відомих показників сприятливого впливу крім подовження життя. До таких інших сприятливих дій, якщо лікування не робить негативного впливу на виживаність, відносяться тимчасове полегшення симптомів, захист від побічних дій, подовження часу до рецидиву або життя без ознак захворювання й подовження часу до прогресування захворювання. Зазначені критерії є загальноприйнятими й такими регулюючими організаціями, як Департамент по контролю за якістю харчових продуктів, медикаментів і косметичних засобів США (F.D.A.), дають дозвіл на застосування лікарських засобів, які мають зазначені сприятливі дії (Hirschfeld й ін., Critical Reviews in Oncology/Hematology 42, 2002, cc. 137-143). Добре відомо, що крім зазначених критеріїв існують інші показники (критерії), за допомогою яких можна прогнозувати зазначені типи сприятливих дій. Зокрема, прискорений процес твердження, офіційно представлений U.S. F.D.A., розроблений на основі визнання того, що існують сурогатні маркери, за допомогою яких можна прогнозувати сприятливий вплив на пацієнта. За допомогою цього процесу до кінця 2003 р. було зареєстровано 16 лікарських засобів і з них 4 пройшли повну процедуру реєстрації, тобто за допомогою проведених надалі випробувань продемонстрований їх безпосередній сприятливий вплив на пацієнтів, передбачений на основі сурогатних критеріїв. Одним з важливих критеріїв визначення впливів лікарського засобу на щільні пухлини є виявлення пухлинного навантаження шляхом оцінки відповіді на лікування (Therasse й ін., Journal of the National Cancer Institute 92(3), 2000, cc. 205-216). Клінічні критерії 11 UA 98332 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (критерії відповіді щільних (солідних) пухлин на терапію (RECIST-критерії) для такої оцінки були опубліковані робочою групою по розробці критеріїв відповіді щільних (солідних) пухлин на терапію (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group), що представляє собою групу міжнародних експертів в області раку. Лікарські засоби, для яких продемонстрований вплив на пухлинне навантаження на основі об'єктивних відповідей відповідно до RECISTкритеріїв при порівнянні з відповідною контрольною групою, мають тенденцію зрештою робити безпосередню сприятливу дію на пацієнтів. Як правило, найбільш простим шляхом є оцінка й документування пухлинного навантаження у доклінічних випробуваннях. З урахуванням того, що результати доклінічних випробувань можна транслювати у клінічні, лікарські засоби, що приводять до пролонгованого виживання при використанні доклінічних моделей, є найбільш перспективними з погляду можливості знайти застосування у клінічних умовах. Так само, як і при одержанні позитивних відповідей на клінічне лікування, лікарський засіб, що викликає зниження пухлинного навантаження у доклінічних умовах, може також робити виражений безпосередній вплив на захворювання. Хоча пролонговане виживання є найбільш важливим клінічним результатом протиракового медикаментозного лікування, існують інші сприятливі дії, які мають клінічну значимість, і очевидно, що зниження пухлинного навантаження, яке може корелювати із прогресуванням захворювання, подовжувати виживання або обумовлювати обидва ці показники, може приводити також до безпосередніх сприятливих дій і мати клінічне значення (Eckhardt й ін., Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds; ASCO Educational Book, 39-ий Annual Meeting, 2003, cc. 209219). За допомогою процесу, практично аналогічного процесу, описаному в US 6180357, одержували моноклональне антитіло Н460-16-2 шляхом імунізації мишей як клітинами, отриманими з організму пацієнта за допомогою біопсії пухлини легені, так і лінією клітин рака легені NCI-H460. Антиген Н460-16-2 експресується на клітинній поверхні широкої розмаїтості ліній людських клітин з різних тканин. Лінія клітин рака молочної залози MDA-MB-231 і лінія клітин рака шкіри А2058 мали чутливість до цитотоксичної дії Н460-16-2 in vitro. Дані про цитотоксичність Н460-16-2 відносно клітин MDA-MB-231 у культурі були додатково підтверджені його протипухлинної активністю відносно цих видів рака при трансплантації мишам (відповідно до методу, описаному в S.N. 10/603000). Доклінічні моделі ксенотрансплантату пухлини розглядаються як валідні засоби оцінки терапевтичної ефективності. На створеній для оцінки превентивної дії in vivo моделі рака молочної залози людини обробка Н460-16-2 виявилася істотно (р