Гуманізоване антитіло, яке специфічно зв’язує с-kit

1. Гуманізоване антитіло або його антигензв’язуючий фрагмент, який специфічно зв'язуює c-Kit і який містить послідовність амінокислот, щонайменше на 90 % ідентичну послідовності амінокислот, приведеній в SEQ ID NО:4, та послідовність амінокислот, щонайменше на 95 % ідентичну послідовності амінокислот, приведеній в SEQ ID NO:2. 2. Антитіло або антигенз’язуючий фрагмент за п.1, який містить послідовність амінокислот, на 95 % або більше ідентичну послідовності амінокислот варіабельної області, приведеної в SEQ ID NО:4. 3. Антитіло або антигензв’язуючий фрагмент за п.1, який містить послідовність амінокислот, на 98 % або більше ідентичну послідовності амінокислот варіабільної області, приведеної в SEQ ID NО:4. 4. Антитіло або антигензв’язуючий фрагмент за п.1, який додатково містить послідовність амінокислот SEQ ID NО:2. 5. Антитіло або антигензв’язуючий фрагмент за. п.1, який відрізняється тим, що містить щонайменше одну консервативну заміну амінокислоти в ділянці, що визначає комплементарність, причому аффінність антитіла або його антигензв’язуючого фрагмента до c-Kit зберігається. 6. Антитіло або антигензв’язуючий фрагмент за п.1, який відрізняється тим, що містить одну консервативну заміну амінокислоти. 7. Антитіло або антигензв’язуючий фрагмент за будьяким з пп.1-6, який проявляє авідність до c-Kit з kd ме-2 нше, ніж 10 , при визначенні способом поверхневого плазмонного резонансу. 8. Нуклеїнова кислота, що кодує антитіло або антигензв’язуючий фрагмент за п.1. 9. Нуклеїнова кислота, яка кодує антитіло або антигензв’язуючий фрагмент за п.1, що містить послідовність нуклеїнових кислот, щонайменше на 90 % ідентичну послідовності нуклеїнових кислот, приведених в SEQ ID NO:1 та 3. UA (21) a200813489 (22) 24.04.2007 (24) 10.08.2011 (86) PCT/US2007/010155, 24.04.2007 (31) 60/794,771 (32) 24.04.2006 (33) US (46) 10.08.2011, Бюл.№ 15, 2011 р. (72) Нг Гордон, US, Шен Веньян, US (73) АМДЖЕН ІНК., US (56) US 5919911 A, 06.07.1999. [X] DATABASE Geneseq [Online] 31 March 1999 (1999-03-31), "Human antiFc epsilon RI alpha chain antibody #1." XP002454751 retrieved from EBI accession no. GSP:AAW73873 Database accession no. AAW73873. DATABASE Geneseq [Online] 20 May 2004 (200405-20), "BHA10 VL#2 protein plus heavy constant domain of human IgG1 SeqID 62." XP002454752 retrieved from EBI accession no. GSP:ADJ11354 Database accession no. ADJ11354. DATABASE EPO Proteins [Online] 11 December 2001 (2001-12-11), "Sequence 28 from Patent WO0187981." XP002454753 retrieved from EBI accession no. EPOP:AX306528 Database accession no. AX306528. RASPOLLINI M R ET AL: "c-KIT expression and correlation with chemotherapy resistance in ovarian carcinoma: an immunocytochemical study" ANNALS OF ONCOLOGY : OFFICIAL JOURNAL OF THE EUROPEAN SOCIETY FOR MEDICAL ONCOLOGY / ESMO APR 2004, vol. 15, no. 4, April 2004 (200404), pages 594-597, XP002454740 ISSN: 0923-7534. ASHMAN L K ET AL: "EPITOPE MAPPING AND FUNCTIONAL STUDIES WITH THREE MONOCLONAL ANTIBODIES TO THE C-KIT RECEPTOR TYROSINE KINASE, YB5.B8, 17F11, AND SR-1" JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY, LISS, NEW YORK, NY, US, vol. 158, 2 (19) 1 3 95478 4 10. Вектор, який містить нуклеїнову кислоту за пп.8, 9. 11. Клітина-хазяїн, яка містить вектор за п.10. 12. Спосіб одержання антитіла або його антигензв’язуючого фрагмента, який специфічно зв'язує c-Kit, що включає культивування клітини-хазяїна за п.11 таким чином, що відбувається експресія нуклеїнової кислоти з утворенням вказаного антитіла або його антигензв`язуючого фрагмента. 13. Спосіб за п.12, який додатково включає етап виділення антитіла або його антигензв’язуючого фрагмента з культури клітин-хазяїнів. 14. Спосіб зменшення або лікування фіброзу, запалення, аутоімунної реакції або раку, зв'язаних з c-Kit захворюваннями або розладами y суб'єкта, що включає введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості антитіла або його антигензв’язуючого фрагмента за п.1. 15. Спосіб за п.14, який відрізняється тим, що розладом або захворюванням є фіброз. 16. Спосіб за п.14, який відрізняється тим, що антитіло є вибраним з групи, яка складається з гуманізованого антитіла, одноланкового антитіла або антигензв’язуючого фрагмента антитіла. 17. Спосіб за п.16, який відрізняється тим, що антитіло або його антигензв’язуючий фрагмент, який зв'язує пептид або поліпептид, розчинний рецептор або розчинний гетеродимерний рецептор, додатково містить Fс домен. 18. Спосіб за п.15, який відрізняється тим, що фіброзний розлад є вибраним з групи, яка складається з склеродермії, інтерстиціального захворювання легені, ідіопатичного фіброзу легені, фіброзу, обумовленого хронічним гепатитом В або С, індукованого радіацією фіброзу і фіброзу, обумовленого загоєнням рани. 19. Спосіб за п.18, який додатково включає введення другого антагоніста профіброзного цитокіну, який відрізняється тим, що цитокін вибирається з трансформуючого фактора зростання ß (ТGF-ß), інтерлейкіну-4 (ІL-4), інтерлейкіну-5 (IL-5), інтерлейкіну-9 (IL9), інтерлейкіну-13 (IL-13), гранулоцитарномакрофагального колоностимулюючого фактора (ГМКСФ), фактора некрозу пухлин альфа (ФНО-α), інтерлейкіну-1 бета (lL-1ß), фактора росту сполучної тканини (ФРСТ), інтерлейкіну-6 (IL-6), онкостатину M (OSM), фактора росту тромбоцитів (ТРФ), моноцитарного хемотоксичного протеїну 1 (CCL2/MCP-1) і хемокіну, регульованого легенями і активацією (CCL18/PARC). 20. Фармацевтична композиція для зменшення або запобігання фіброзу y суб'єкта, страждаючого від фіброзного розладу, що містить терапевтично ефективну кількість антитіла або його антигензв’язуючого фрагмента за п.1. Пріоритетною заявкою відносно даної є заявка на патент США, серійний номер 60/794,771, подана 24 квітня, 2006 року, на яку в описі здійснюються посилання. Даний винахід відноситься до композицій для лікування, пов'язаних з c-Kit запальних, фіброзних, аутоіммунних і ракових захворювань, і до композицій, що містять гуманізовані антитіла до c-Kit. Було показано, що тучні клітини залучені в осередок запальних станів, таких, як астма, ревматоїдний артрит і запальне захворювання кишечника, і їх роль в алергічному запаленні широко відома. Число тучних клітин підвищене в експлантатах легких пацієнтів, тяжкохворих астмою, і вони є основним джерелом клінічно значущих запальних медіаторів, таких як лейкотрієни, гістамін і Тh2цитокіни. Тучні клітини є основним джерелом ЧНП (чинник некрозу пухлин), що раніше утворився в схильних до хвороби тканинах. Чинником стволових клітин (ЧСК- англ-SCF) є глікопротеїн, який передає сигнали через асоційований з клітиною і мембраною рецептор з тирозинкіназною активністю, далі іменований c-Kit, і цей шлях передачі сигналів грає ключову роль при гемопоезі, діючи як позитивний і негативний регулятор, часто синергічно з іншими цитокінами. Що розчинний відокремився від клітини c-Kit рецептор може грати роль в регуляції SCF. С-Kit експресується на плюрипотентних гематопоетичних стволових клітинах, які є попередниками зрілих клітин, що належать лімфоїдній і еритроідній лініям. На відміну від інших гематопоетичних клітин, попередники тучних клітин і зрілі тучні клітини зберігають високі рівні експресії c-Kit. Отже, передача сигналів SCF через c-Kit життєво важлива для розвитку, функціонування, транспортування і виживання тучних клітин. Він також грає роль в гаметогенезі і меланогенезі. Миші з інактивуючими c-Kit мутаціями в W локусі фактично не мають тучних клітин. Активуючі c-Kit мутації у людей пов'язані з мастоцитозом. C-Kit-позитивні плюрипотентні гематопоетичні стволові клітини є попередниками безлічі типів клітин, включаючи мезенхімальні клітини, фібробласти і тучні клітини. Фіброзне захворювання характеризується частково надмірною активністю і проліферацією фібробластів, що приводить до відкладення позаклітинного матриксу. Було виявлено, що c-Kit позитивні плюрипотентні гематопоетичні стволові клітини кісткового мозку є джерелом фібробластів і тучних клітин у фіброзних тканинах. Тучні клітини можуть забезпечити постійне джерело запальних, ангіогенних, мітогенних і фіброгенних медіаторів. Тучні клітини функціонально і структурно пов'язані з фібробластами, і грають безпосередню роль в активації фібробластів. Тучні клітини збільшують кінетику і масштаб опосередкованого фібробластами скорочення колагену, відкладення позаклітинного матриксу, і можуть перетворювати фібробласти на міофібробласти. Фібробласти, у свою чергу, секретують SCF, що приводить до ще більшої активировації і збільшення кількості тучних клітин, і обидва типи клітин є компонентами фиброгенної мережі. Кількість тучних клітин і медіаторів тучних клітин значно підвищена при більшості фіброзних захворювань людини, включаючи ідіопатичний фіброз легенів (ІФЛ) і склеродермію. Відмітні фе 5 нотипи відносно тучних клітин виявляються у деяких пацієнтів з склеродермією і в Tsk моделі склеродермії на мишах. Агресивна системна форма мастоцитозу може бути охарактеризована мієлофіброзом, що указує на те, що тучні клітини можуть бути ефекторними клітинами при фіброзі. Глівек™ (GLEEVECTM) і інші препарати даного класу, подібні Сутенту™ (SUTENTTM), являють собою такі, що мають безліч мішеней інгібіторів рецептора з тирозин-кіназною активністю, які можуть впливати на сигнальну активність c-Kit, але також інгібують ряд інших кіназ. Ці інгібітори кіназ призначені для онкологічних захворювань. Відомо, що застосування Глівек™а викликає міелосупресію, анемію і ряд побічних ефектів, включаючи кардіотоксичність і периферичні набряки. Таким чином, вказані молекули не володіють якнайкращим співвідношенням користь/ризик при тривалому лікуванні захворювань, пов'язаних з передачею сигналів c-Kit. Отже, існує необхідність в створенні нових способів лікування і реагентів, особливо таких, які є дієвішими і селективними, і мають кращі показники безпеки відносно лікування пов'язаних з c-Kit запальних і фіброзних захворювань. Такі сполуки можуть також проявляти значно кращі показники ефективності і безпеки при онкологічних захворюваннях, таких, як лейкоз міелоідного походження, захворюваннях, пов'язаних з мутаціями cKit, таких, як стромальна пухлина шлунковокишкового тракту (GIST) і мастоцитоз, захворюваннях, пов'язаних з надмірною експресією c-kit і/або надмірною аутокринною активністю SCF, як при меланомі і різних дрібноклітинних раках легені (SCLC). На даний момент відсутні способи лікування і реагенти, що націлені на c-Kit людину і володіють терапевтичною користю у відсутності значних несприятливих ефектів. Даний винахід забезпечує агенти, які є антагоністами і нейтральними антагоністами SCF, які діють на асоційовані з клітиною і мембранні c-Kit рецептори, такі, як моноклональні антитіла. У конкретніших варіантах реалізації, передбачені гуманізовані (не мишасті) моноклональні антитіла, які сполучають c-Kit. У ще конкретніших варіантах реалізації, вказані гуманізовані антитіла згідно даного винаходу містять послідовність амінокислот, вибрану з тих, які представлені послідовностями SEQ ID NO 2, 4 і 6. Даний винахід також забезпечує нуклеїнові кислоти, що кодують будь-які з вищезгаданих антитіл або специфічно зв'язуючих агентів. У зв'язаному варіанті реалізації даного винаходу, передбачений вектор, який містить будь-яку з вищезгаданих послідовностей нуклеїнових кислот. У ще одному варіанті реалізації даний винахід забезпечує клітину-власника, яка містить будь-яку з вищезгаданих нуклеїнових кислот або векторів. У одному варіанті реалізації, c-Kit - зв'язуючі агенти і нейтральні антагоністи можуть містити послідовність амінокислот, відповідну SEQ ID NO: 2, 4 або 6. У іншому варіанті реалізації, будь-який з вищезгаданих агентів містить послідовність амінокислот, яка щонайменше на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або більш 95478 6 ідентична одній або більш за послідовність амінокислот, приведену в SEQ ID NO: 2, 4 або 6. У таких варіантах реалізації, вказана відмінність послідовності від SEQ ID NO: 2, 4 або 6, відповідно, може бути, наприклад, консервативну заміну у відповідній каркасній області IGG з застосуванням альтернативної амінокислоти людини в цьому положенні. У прикладах варіантів реалізації, вказане антитіло або специфічно зв'язуючий агент, який зв'язує c-Kit, містить послідовність амінокислот, відповідну SEQ ID NO: 2, 4 або 6. Однак, передбачено, що антитіла згідно даного винаходу можуть бути сумішшю ізотипів антитіл IGG (наприклад, суміш підтипів IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4). Будь-яке з вищезгаданих антитіл може бути, наприклад, нативним або мутованим IGG антитілом (наприклад, підтипу IgG1 або IgG3, або будьякого іншого підтипу IGG). Вищезгадані антитіла можуть проявляти авидність, kd, що характеризу-2 -3 ється, менш, ніж 1×10 , або менш, ніж 1×10 , або -4 -5 -6 -7 -8 -9 1×10 , 1×10 , 1×10 , 1×10 , 1×10 або 1×10 , при визначенні за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (аналіз ВІАсоге). Вищезгадані антитіла можуть мати значення ІС50, відповідне нейтральним антагоністам, -2 -3 -4 менш, ніж 1×10 , або менш, ніж 1×10 , або 1×10 , -5 -6 -7 -8 -9 1×10 , 1×10 , 1×10 , 1×10 або 1×10 при визначенні за допомогою аналізу в клітинній системі. У певному варіанті реалізації, аффінність і функціональна ефективність вказаного гуманізованого антитіла щонайменше порівнянна з аффінністю і антитілами миші з якого воно одержане. У переважному варіанті реалізації, вказане гуманізоване антитіло не є агоністом с-Kit рецептора і не активує тучні клітини, що могло б привести до анафілактичних реакцій, і повинно проявляти фармакодинаміку/фармакокінетику (Фд/фк) і профіль імуногенності, які щонайменше порівняні з такими для батьківського антитіла миші. Даний винахід охоплює безліч способів. Наприклад, передбачений спосіб одержання вищезгаданого антитіла або специфічно зв'язуючого агента, що включає культивування вищезгаданої клітини-власника таким чином, що відбувається експресія вказаної нуклеїнової кислоти з утворенням антитіла або агента. Такі способи можуть також включати етап одержання вказаного антитіла або агента з культури клітин-господарів. У спорідненому варіанті реалізації даний винахід забезпечує очищене антитіло або агент, одержані вищезгаданим способом. Даний винахід додатково забезпечує способи застосування будь-якого з вищезазначеного антитіла або специфічно зв'язуючого агента, наприклад, для лікування або запобігання зв'язаного з cKit розладу шляхом введення ефективної кількості вказаного антитіла або агента. Одним прикладом подібного розладу, який лікують, є фіброзне захворювання. Фігура 1: SR-1 інгібує тучні клітини в моделі активізації пораненням. Фігура 2: Кількість тучних клітин в моделі загоєння ран. Фігура 3: Гуманізовані ізоформи SR-1 інгібують індуковану чинником стволових клітин (SCF) акти 7 вацію c-Kit і подальше фосфорування за допомогою c-Kit. Антитіло миші проти c-Kit людини SR-1 описане в патенті США номер 5,919,911, і патенті США номер 5,489,516, на кожен з яких в даному описі здійснюються посилання. SR-1 проявило відповідні властивості відносно зв'язаного з c-Kit і блокувало SCF-опосередковану передачу сигналів через рецептор ця молекула не проявляла всі властивості, які були б бажані при терапії людини, окрім існування очевидної проблеми імуногенності. Broudy повідомив, що SR-1 в деякій мірі проявляло схожу з агоністичною активність, яка могла привести до інтерналізації і фосфорування рецептора. J Cell Physiol., березень 1994;158(3):545-54. Такі функціональні активності робили вказану молекулу менш ефективною і менш безпечною. Не дивлячись на те, що гуманізація моноклональних антитіл є добре відомою методикою і те, що біологічні молекули, що володіють активністю як правило мають на увазі належну трансляцію, конформація вказаного гуманізованого антитіла SR-1, залежна від каркасної частини антитіла людини, може служити причиною різних властивих активностей, що проявляються відносно c-Kit і біологічних функцій. У цьому окремому прикладі, слід було б добиватися необхідних фармакологічних, а не небажаних "агоністичних" властивостей, але методика для досягнення цього результату ще не була опублікована. Ділянки, що визначають комплементарність SR-1 антитіла, вставили в унікальну комбінацію важких і легких ланцюгів що розрізняються по структурі IgG1 і IgG2, і IgG4 людини, при дивовижному збереженні схожої аффінності відносно c-Kit. Однак, як виявилось, кожна з вказаних каркасних областей мала свої недоліки. Було показано, що гуманізоване антитіло SR-1 на основі IgG2 мало високу аффінність до c-Kit, 95478 8 але в клітинах багатьох типів було неможливо повністю блокувати SCF-опосередковану інтерналізацію рецептора, і тести з культивованими тучними клітинами приводили до фосфорування c-Kit, сигналу виживаності, і опосередковувало незвичайну агрегацію вказаних клітин. Вказані властивості теоретично небажані, оскільки метою терапевтичної стратегії є зменшення популяції тучних клітин і попередників за рахунок апоптозу шляхом блокування сигналу виживаності SCF і уникнення активації тучних клітин, яка може привести до анафілактичних реакцій in vivo. Коли CDR області (області, що визначають комплементарність) SR-1 миші вставляли в каркас IgG1 людини, аффінність і функціональна ефективність також залишалися незмінними, але ця основа є менш бажаною унаслідок активації комплементу і клітинноопосередкованої цитотоксичності, що часто виявляються при застосуванні цього ізотипу антитіл. Коли CDR області SR-1 миші вставляли в каркас IgG4 людини, аффінність і функціональна ефективність також зберігалися, але несподівано ця молекула проявила значну аггрегацію при очищенні і напрацюванні. Відповідно, автори даного винаходу шукали способи подолати недоліки кожній з цих молекул шляхом створення антитіла, яке не активує комплемент, і не активує c-kit і тучні клітини, при цьому зберігаючи необхідні аффінності, ефективність нейтрального антагоніста відносно мембранного cKit рецептора, але не розчинного c-Kit рецептора. Таке антитіло повинне також проявляти належні Фд/фк і повинне ефективно зменшувати популяцію тучних клітин і не проявляти ознак агонізму тучних клітин in vivo. Легка каппа ланцюг гуманізованого SR-1 SEQ ID NO: 1 представляє нуклеїнову кислоту, кодуючу легку каппа ланцюг гуманізованого SR-1. 9 95478 10 11 95478 12 13 95478 14 15 NO: 10). 95478 16 17 Очевидно, що кожен з важких і легких ланцюгів, описаних в даній заявці, процесується в клітині до зрілої форми. Відповідно, сигнальні пептиди відщеплюються і, у разі важких ланцюгів антитіл, відщеплюється С-кінцевий лізин. Відповідно, зріла форма процесується протеолітично і також проходить інші модифікації посттрансляцій, такі, як глікозілірування у разі експресії в клітинах ссавця. Сигнальний пептид для кожного важкого і легкого ланцюга є амінокислотами з 1 по 20 послідовностей SEQ ID NO: 2 і 10, і амінокислоти з 1 по 19 послідовностей SEQ ID NO: 4, 6 і 10. Послідовності нуклеотидів і амінокислот легкого ланцюга SR-1 миші приведені в SEQ ID NO: 7 і SEQ ID NO: 8. Послідовності нуклеотидів і амінокислот важкого ланцюга SR-1 миші приведені в SEQ ID NO: 9 і SEQ ID NO: 10. Варіанти з додатковими замінами (наприклад, консервативними замінами амінокислот миші) також можуть зберігати високу аффінність сполучення. Заміни, делеції або вставки в положеннях усередині CDR і каркаса можна проводити, не роблячи впливу на аффінність. У одному варіанті реалізації, вказане гуманізоване антитіло містить легкий ланцюг, в якому збережені початкові CDR миші з антитіла SR-1 миші, наприклад, амінокислоти в положеннях приблизно 44-58, приблизно 74-80 і приблизно 113-121 послідовності SEQ ID NO: 8. У інших варіантах реалізації, вказане гуманізоване антитіло містить важкий ланцюг, в якому збережені CDR миші з антитіла SR-1 миші, наприклад, амінокислоти в положеннях приблизно 50-54, приблизно 68-85 і приблизно 118-125 послідовностей SEQ ID NO:10, і має одержану з антитіл людини каркасну область. При використанні в даній заявці, мається на увазі, що термін "приблизно" передбачає зміни в положеннях від двох до п'яти амінокислот, за умови, що аффінність до c-Kit зберігається. У одному варіанті реалізації, вищезгадані антитіла проявляють авідність, яка характеризується kd менш, ніж 10-2, або менш, ніж 10-3, або 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, при визначенні за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (ВІАсоге-аналіз). У іншому варіанті реалізації, вищезгадані антитіла проявляють активність нейтра-2 льного антагоніста з ІС50 менш ніж 1×10 , або -3 -4 -5 -6 -7 менш, ніж 1×10 , або 1×10 , 1×10 , 1×10 , 1×10 , -8 -9 1×10 або 1×10 , при визначенні із застосуванням клітин. Даний винахід забезпечує безліч антагоністичних специфічно зв'язаних і нейтральних агентів, включаючи, але не обмежуючись, перерахованими: антитіла людини або гуманізовані специфічні антитіла до c-Kit, які одержані з SR-1 миші і зберігають бажані властивості, такі, як Kd (константа швидкості дисоціації) по відношенню до c-Kit в -2 діапазоні 1×10 або менш, або що знаходиться в -2 діапазоні до 1 х 10" або менш (наприклад, 10 , 10 3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 або менш) і/або ІС50 нейтрального антагоніста c-Kit в діапазоні -2 1×10 або менш, або що знаходиться в діапазоні -9 -2 -3 -4 -5 до 1×10 або менш (наприклад, 10 , 10 , 10 , 10 , -6 -7 -8 -9 10 , 10 , 10 , 10 або менш) і/або здатність зме 95478 18 ншувати вираженість симптомів зв'язаного з c-Kit розладу. Даний винахід також забезпечує нуклеїнові кислоти, що кодують такі поліпептиди специфічно зв'язуючих агентів, вектори і рекомбінантні клітини-господарі, які містять такі нуклеїнові кислоти, способи одержання таких специфічно зв'язуючих агентів, фармацевтичні лікарські форми, які містять такі специфічно зв'язуючі агенти, способи одержання фармацевтичних лікарських форм, і способи лікування пацієнтів фармацевтичними лікарськими формами і сполуками. Нуклеїнові кислоти, що кодують вказані модифіковані варіабельні області легкого ланцюга, конструюють і спільно експресують з нуклеїновими кислотами, що кодують CDR-прищеплений або гуманізований важкий ланцюг, або навпаки, і можливо сполучати з константними областями. Будьякий гуманізований або химерний важкий ланцюг і легкі ланцюги можна об'єднати, за умови, що зберігається відповідна аффіність зв'язування. Необхідні гени були введені в клітини ссавця і одержані рекомбінантні продукти імуноглобулінів були експресовані, очищені і охарактеризовані. Термін "антитіло" використовують в його найбільш широкому сенсі і він включає повністю зібрані антитіла, моноклональні антитіла (включаючи антитіла людини, гуманізовані або химерні антитіла), поліклональні антитіла, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла), і фрагменти антитіл, які можуть зв'язувати антиген (наприклад, Fab', F'(ab)2, Fv, одноланцюгові антитіла, димірні антитіла - "diabodies"), що включають ділянки, що визначають комплементарність (CDR), вказаного вище, за умови, що вони проявляють необхідну біологічну активність. Термін "антитіло" в явній формі виключає антитіло миші (тобто антитіло, продуковане мишачою гібридомою або що має ту ж послідовність, що і антитіло продуковане мишачою гібридомою) з об'єму даного терміну. Термін "специфічно зв'язуючий агент" охоплює антитіла згідно визначенню вище і рекомбінантні пептиди або інші сполуки, які містять послідовності, одержані з CDR, що мають необхідні антигензв'язуючі властивості. Особливо включені в об'єм даного терміну пептиди, які містять послідовності амінокислот, які щонайменше на 80%, 90% або 100% ідентичні одній або більш CDR області антитіла SR-1 миші, переважно включаючі CDR3 важкого ланцюга. При використанні в даній заявці, термін "нейтральний антагоніст" означає специфічно зв'язуючий агент, який здатний інгібірувати агоністичну активність. Ці агенти включають антитіла, як визначено вище, і рекомбінантні пептиди або інші сполуки, які містять послідовності, одержані з CDR, що мають необхідні антиген-зв'язуючі властивості. Особливо включені в об'єм даного терміну пептиди, що містять послідовності амінокислот, які щонайменше на 80%, 90% або 100% ідентичні одній або більш CDR області антитіла SR-1 миші, переважно включаючі CDR3 важкого ланцюга. Також включені в об'єм даного терміну "пептидні антитіла" - "peptibodies", які є молекулами, Fc, 19 що містять домен антитіла як "носій", який приєднаний до щонайменше одного антиген-зв'язуючого пептиду. CDR області антитіл, що походять з антитіла SR-1 можуть бути відповідними для введення в пептидне антитіло, особливо включаючи CDR3 важкого ланцюга. Одержання пептидних антитіл у загальних рисах описане в публікації згідно РСТ WO 00/24782, опублікованої 4 травня, 2000р. Пептиди можуть бути зв'язані тандемно (тобто, послідовно), в присутності або у відсутність лінкерів. Пептиди, що містять цистеїновий залишок, можуть утворювати зшивання з іншим пептидом Cysутримуючим, будь-який або кожен з яких може бути пов'язаний з носієм. Будь-який пептид, що має більш ніж один залишок Cys, також може утворити внутрішньопептидний дисульфідний зв'язок. Будь-який з цих пептидів може бути модифікований, наприклад, карбоксильний кінець може бути блокований аміногрупою, можуть бути блоковані цистеїни, або залишки амінокислот можуть бути заміщені на молекули, відмінні від залишків амінокислот (див., наприклад, Bhatnagar і ін., J. Med. Chem. 39: 3814-9 (1996), і Cuthbertson і ін., J. Med. Chem. 40: 2876-82 (1997), зміст яких повністю включений в дану заявку за допомогою посилання). Послідовності пептидів можуть бути оптимізовані, аналогічно «аффінному дозріванню» антитіл, або іншим чином змінений аланін скануючим або неспецифічним, або направленим мутагенезом, з подальшим скринінгом для визначення пептидів, які краще всього зв'язуються. Lowman, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401-24 (1997). Різні молекули можна вставляти в структуру специфічно зв'язуючого агента, наприклад, в саму пептидну частину або між частинами пептиду і носія специфічно зв'язуючих агентів, при цьому зберігаючи необхідну активність специфічно зв'язуючого агента. Можна легко вставити, наприклад, такі молекули, як Fc домен або його фрагмент, поліетиленгліколь або інші близькі молекули, такі, як декстран, жирна кислота, ліпід, група холестерину, невеликий карбогідрат, пептид, цитотоксичний агент, агент хіміотерапії, молекула, що детектується, як описано в даній заявці (включаючи флюоресцентні агенти, радіоактивні мітки, такі, як радіоактивні ізотопи), олігосахарид, олігонуклеотид, полінуклеотид, що інтерферують (або інші) РНК, ферменти, гормони, або тому подібні. Для фахівця в даній області очевидно, що існують інші молекули, відповідні для вставки таким шляхом, що також охоплене об'ємом даного винаходу. Сюди включена, наприклад, вставка необхідної молекули між двома послідовними амінокислотами, можливо із сполукою відповідного лінкерому. "Виділеним" антитілом є таке антитіло, яке було ідентифіковане і відокремлене від компонентів клітини, яка його експресує. Контамінуючі компоненти клітини є матеріалом, який перешкоджатиме діагностичному або терапевтичному застосуванню вказаного антитіла, і може включати ферменти, гормони і інші білкові або небілкові розчинені речовини. У переважних варіантах реалізації, вказане антитіло буде очищеним (1) до більш ніж 95% по вазі антитіла, і найпереважніше більш ніж 99% по вазі, (2) до ступеня, достатнього, щоб одержати 95478 20 щонайменше 15 залишків N-кінцевої або внутрішньої послідовності амінокислот, або (3) до однорідності при електрофорезі в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (Пааг/дсн) в поновлюючих або непоновлюючих умовах, при забарвленні Кумасси блакитним або, переважно, сріблом. Виділене природне антитіло включає антитіло in situ усередині рекомбінантної клітини, після того, як щонайменше один компонент природного оточення антитіла буде відсутній. Зазвичай очищене антитіло буде одержано із застосуванням щонайменше одного етапу очищення. Термін "моноклональне антитіло", при використанні в даній заявці, відноситься до антитіла, одержаного з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто, окремі антитіла, складові вказану популяцію, є ідентичними, за винятком можливих природних мутацій, які присутні в незначних кількостях. Моноклональні антитіла є високоспецифічними, направленими проти окремого антигенного сайту або епітопу, в протилежність препаратам поліклональних антитіл, які зазвичай включають різні антитіла, направлені проти різних епітопів. Залежно від послідовності амінокислот константного домена їх важких ланцюгів, імуноглобуліни людини можна віднести до різних класів. Існує п'ять основних класів, IGA, IGD, IGE, IGG і IGM, і деякі з них можуть бути додатково підрозділені на підкласи або ізотипи, наприклад IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA2. Константні домени важких ланцюгів, які відповідають різним класам імуноглобулінів, названі альфа, дельта, епсілон, гамма і мю, відповідно. Субодиничні структури і просторові конфігурації різних класів імуноглобулінів добре відомі. Різні ізотипи мають різні ефекторні функції; наприклад, IgG1 і IgG3 ізотипи мають антитілозалежну клітинно обумовлену цитотоксичність (ADCC-активність). Термін "гіперваріабельна" ділянка відноситься до залишків амінокислот антитіла, які відповідальні за скріплення антигену. Гіперваріабельна область містить залишки амінокислот з області, що визначає комплементарність, або CDR [т.е., залишки 24-34 (L1), 50-56 (L2) і 89-97 (L3) у варіабельному домені легкого ланцюга і 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) і 95-102 (Н3) у варіабельном домені важкого ланцюга, як описано у Kabat і ін., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-те видавництво, Public Health Service, National Institutes of Health, Бетесда, Меріленд (1991)]. Навіть одинична область CDR може розпізнати і зв'язати антиген, хоча і з нижчою аффіністю, ніж цілий сайт скріплення антигену, що містить наявні CDR. Очевидно, що в області CDR антитіла можуть бути присутні додаткові або відсутні послідовності за межами конкретних обмежень, що визначаються умовою, що вказане антитіло зберігає свою здатність сполучатися з цільовою молекулою. Альтернативне визначення залишків з гіперваріабельної "петлі" описане у Chothia і ін, J. Mol.Biol. 196: 901-917 (1987), як залишки 26-32 (L1), 50-52 (L2) і 91-96 (L3) у варіабельному домені легкого ланцюга і 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) і 96-101 (Н3) у варіабельному домені важкого ланцюга. 21 Залишками "каркаса" або FR є залишки варіабельної області, відмінні від залишків гіперваріабельної області. "Фрагменти антитіл" включають частину інтактного повнорозмірного антитіла, переважно антиген-сполучаючу або варіабельну область інтактного антитіла. Приклади фрагментів антитіл включають Fab, Fab', F(ab')2, і Fv фрагменти; димірні антитіла; лінійні антитіла (Zapata і ін., Protein Eng.,8(10):1057-1062 (1995)); одноланцюгові молекули антитіл; і мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. Розщеплювання антитіла папаіном дає два ідентичних антиген-сполучаючих фрагменти, як "Fab''-фрагменти, кожен з яких містить один антиген-сполучаючий сайт, і залишковий "Fc''фрагмент, який включає сталу область. Fabфрагмент містить весь варіабельний домен, також, як і константний домен, легкому ланцюгу і перший константний домен (СН1) важкого ланцюга. Fc-фрагмент несе залишки сахаридів і відповідає за багато ефекторні функцій антитіла (такі, як скріплення комплементу і клітинних рецепторів), які допомагають відрізняти один клас антитіла від іншого. Обробка пепсином дає F(ab')2 фрагмент, який містить два "одноланцюгових Fv" або "sFv" фрагмента антитіла, включаючих VH і VL домени антитіла, при цьому вказані домени представлені у вигляді одного поліпептидного ланцюга. Fabфрагменти відрізняються від Fab' фрагментів присутністю декількох додаткових залишків в карбоксильному кінці СН1 домена важкого ланцюга, включаючи один або більше, ніж один цистеїн з шарнірної ділянки антитіла. Переважно, Fv поліпептид додатково містить поліпептидний лінкер між VH і VL доменами, який дозволяє Fv утворювати необхідну структуру для скріплення антигену. Для огляду за sFv див. Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, том. 113, Rosenburg і Moore ред. Springer-Verlag, New York, стор. 269-315 (1994). "Fv" є мінімальним фрагментом антитіла, який містить повний сайт дослідження і сполучення антигену. Ця ділянка складається з диміра одного важкого і одного легкого ланцюга варіабельного домену, які знаходяться в щільній нековалентній асоціації. Він знаходиться в такій конфігурації, що три області CDR кожного варіабельного домену взаємодіють з формуванням сайту сполу антигену на поверхні VH VL диміра. Всі разом, шість областей CDR додають антиген-сполучаючу специфічність вказаному антитілу. Однак, одиничний варіабельний домен (або половина Fv, що включає тільки три CDR, специфічні до антигену) має здатність досліджувати і сполучати антиген, хоча з нижчою аффіністю, ніж цілий сайт сполучення. Термін "диміри антитіл" відноситься до малих фрагментів антитіл з двома антигенсполучаючими сайтами, ці фрагменти включають варіабельний домен важкого ланцюга (VH), сполучений з варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) в одному поліпептидному ланцюзі (VH VL). За допомогою лінкера, який дуже короткий, щоб дозволити сполучення між двома доменами на тому 95478 22 ж ланцюзі, забезпечують сполучення вказаних доменів з комплементарними доменами іншого ланцюга і створювати два антиген-сполучаючих сайти. Диміри антитіл описані детальніше, наприклад, в ЕР 404,097; WO 93/11161; і 30 Hollinger і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). Різні методики були розроблені для одержання фрагментів антитіл. Як правило, ці фрагменти одержували шляхом протеолітичного розщеплювання інтактних антитіл, але їх також можна одержати безпосередньо з рекомбінантних клітингосподарів. Див., наприклад, Better і ін., Science 240: 1041-1043 (1988); Skerra і ін. Science 240: 1038-1041 (1988); Carter і ін., Bio/Technology 10:163-167 (1992). Як передбачено в даній заявці, в композиціях і способах лікування запальних, аутоіммунних, онкологічних і фіброзних розладів можна застосовувати один або більш анти-c-Kit терапевтичних агентів, які застосовують окремо або в комбінації з іншим терапевтичним агентом, щоб досягти необхідного ефекту. Приклади антифіброзних агентів, відповідних для застосування відповідно до винаходу, включають цитокіни, причому вказаний цитокін вибраний з трансформуючого чинника зростання  (TGF-P), інтерлейкіна-4 (IL-4), інтерлейкіна-5 (IL-5), інтерлейкіна-9 (IL-9), інтерлейкіна-13 (IL-13), гранулоцитарно-моноцитарного колонієстимулюючого чинника (ГМ-КСФ), чинника некрозу пухлин альфа (ФНО-), інтерлейкіна-1 бета (IL-1), чинника зростання сполучної тканини (ФРСТ), інтерлейкіна-6 (IL-6), онкостатину М (OSM), чинника зростання тромбоцитів (ТРФ), моноцитарного хемотоксичного протеїну 1 (CCL2/MCP-1) і хемокіну, регульованого легенями і активацією (CCL18/PARC). Антитіла, одержані з антитіла SR-1 згідно даного винаходу, переважно одержані за допомогою технології рекомбінантних ДНК із застосуванням однієї з систем експресії антитіл, добре відомих в даній області (див., наприклад, Harlow і Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Такі антитіла також є переважно химерними рекомбінантними білками, що мають одержані з імуноглобулінів варіабельні послідовності і константні області антитіл людини, або переважніше є більш схожими на моноклональні антитіла людини (такі, як антитіла людини або гуманізовані антитіла), які включають залишки антитіла людини, але переважно зберігають щонайменше CDR області антитіла SR-1 миші. Окрім інтактних, повнорозмірних молекул, термін "антитіло" також відноситься до їх фрагментів або мультимірам, або агрегатам інтактних молекул і/або фрагментів, які зв'язуються з c-Kit. Вираз "гуманізоване антитіло" відноситься до антитіла, одержаного з антитіла, що не походить від людини, як правило, з моноклонального антитіла миші. Як альтернатива, гуманізоване антитіло можна одержати з химерного антитіла, в якому збережені або по суті збережені антиген-зв'язуючі властивості батьківського, нелюдського антитіла, але яке проявляє знижену імуногенність в порівнянні з батьківським антитілом, коли воно введене в людину. Вираз "химерне/рекомбінантне антиті 23 ло", при використанні в даній заявці, відноситься до антитіла, що містить послідовність, одержану з двох різних антитіл (див., наприклад, патент США номер 4,816,567), які, як правило, походять з різних видів. В основному, химерні антитіла містять фрагменти антитіл людини і миші, зазвичай константні області людини і варіабельні області миші. Рекомбінантне одержання антитіл Послідовність амінокислот імуноглобуліну, можна визначити шляхом безпосереднього секвенування білка, і відповідні кодуючі послідовності нуклеотидів можна розробити згідно універсальній таблиці генетичних кодів. Як альтернатива кодуючої ДНК вказані моноклональні антитіла можна виділити і секвенувати з гібридомних клітин із застосуванням традиційних процедур (наприклад, шляхом застосування олігонуклеотидних зондів, які здатні специфічно сполучатися з кодуючими генами важких і легких ланцюгів вказаних моноклональних антитіл). Визначення послідовності, як правило, вимагатиме виділення щонайменше частини гену, що цікавить, або кДНК. Зазвичай це вимагає клонування ДНК або переважно мРНК (тобто, кодуюча кДНК), вказані моноклональні антитіла. Клонування виконують, застосовуючи стандартні методики (див., наприклад, Sambrook і ін. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, томи 1-3, Cold Spring Harbor Press, яка включена в дану заявку за допомогою посилання). Наприклад, бібліотеку кДНК можна сконструювати за допомогою зворотної транскрипції поліА+ мРНК, переважно асоційованою з мембраною мРНК, і скринінгу бібліотеки із застосуванням зондів, специфічних до послідовності генів поліпептиду імуноглобуліну людини. У переважному варіанті реалізації застосовують полімеразну ланцюгову реакцію (ПЦР) для ампліфікації кДНК (або частини повнорозмірних кодуючих кДНК), сегменту гена імуноглобуліну (наприклад, варіабельний сегмент легкого ланцюга). Ампліфікування послідовності можна легко клонувати в будьякий відповідний вектор, наприклад, експресійні вектори, мінігенні вектори, або вектори фагового дисплею. Очевидно, що конкретний застосовуваний спосіб клонування не є критичним чинником, за умови, що можливо визначити послідовність деякої частини поліпептиду імуноглобуліну. При використанні в даній заявці "виділена" молекула нуклеїнової кислоти або "виділена" послідовність нуклеїнової кислоти є молекулою нуклеїнової кислоти, яка або (1) ідентифікована і відокремлена від щонайменше однієї забруднюючої молекули нуклеїнової кислоти, з якою вона зазвичай асоційована в природному джерелі вказаної нуклеїнової кислоти або (2) клонована, ампліфікована, помічена, або іншим чином відокремлена від фонових нуклеїнових кислот, таким чином, що можна визначити послідовність нуклеїнової кислоти, що цікавить. Виділена молекула нуклеїнової кислоти є молекулою, яка знаходиться в іншій формі або в іншому оточенні, ніж ті, в яких вона знаходиться в природі. Однак, виділена молекула нуклеїнової кислоти включає молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься в клітинах, які зазвичай експресують вказане антитіло, де, наприклад, вказана 95478 24 молекула нуклеїнової кислоти знаходиться в положенні на хромосомі, відмінному від її положення в природних клітинах. Одним з джерел РНК, використовуваних при клонуванні і секвенуванні, є гібридома, одержана за допомогою одержання В-клітин з трансгенної миші і злиття В-клітини з безсмертною клітиною. Перевагою застосування гібридом є те, що їх можна легко піддати скринінгну і відібрати гібридоми, які продукують моноклональне антитіло людини. Як альтернатива, РНК можна виділити з В-клітин (або цілої селезінки) імунізованої тварини. При застосуванні джерел, відмінних від гібридоми, бажано провести скринінг на послідовності, кодуючі імуноглобуліни або поліпептиди імуноглобулінів, що володіють властивостями специфічного сполучення. Одним із способів подібного скринінгу є застосування технології фагового дисплею. Фаговий дисплей описаний, наприклад, в Dower і ін., WO 91/17271, McCafferty і ін., WO 92/01047, і Caton і Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:64506454 (1990), зміст кожного з яких включено в дану заявку за допомогою посилання. У одному варіанті реалізації, застосовуючи технологію фагового дисплею, виділяють кДНК з імунізованої транс генної миші (наприклад, тотальну кДНК селезінки), застосовують полімеразну ланцюгову реакцію для ампліфікації послідовностей кДНК, які кодують частину поліпептиду імуноглобуліну, наприклад, CDR області, і ампліфіковані послідовності вставляють у фаговий вектор. кДНК, що кодує пептиди, наприклад, пептиди варіабельних областей з необхідними властивостями сполучення, визначають за допомогою стандартних методик, таких як пеннінг. Потім визначають послідовність ампліфікованої або клонованої нуклеїнової кислоти. Як правило, визначають послідовність, що кодує всю варіабельну область поліпептиду імуноглобуліну іноді може бути доцільнішим секвенувати тільки частину варіабельної області, наприклад, CDR-кодуюча частину. Зазвичай секвенована частина матиме довжину щонайменше 30 основ, частіше будуть секвеновані основи, що кодують щонайменше приблизно одну третину або щонайменше приблизно половину довжини варіабельної області. Секвенування можна проводити на клонах, виділених з бібліотеки кДНК, або, якщо застосовується ПЦР, після субклонування ампліфікованої послідовності або шляхом прямого ампліфікованого секвенування за допомогою ПЦР сегменту. Секвенування проводять, застосовуючи стандартні методики (див., наприклад, Sambrook і ін. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, томи 1-3, Cold Spring Harbor Press, і Sanger, F, і ін. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, які включені в дану заявку за допомогою посилання). Шляхом порівняння послідовності клонованої нуклеїнової кислоти з опублікованими послідовностями генів і кДНК імуноглобулінів людини, фахівець в даній області залежно від просеквенованої ділянки легко зможе визначити: (і) використаний сегмент ембріонального типу в гібридомному поліпептиді імуноглобуліну (включаючи ізотоп важкого ланцюга) і (іі) послідовність варіабельних областей важкого і легкого ланцюгів, включаючи послідовності, 25 одержані в результаті додавання N-участка і процесу соматичної мутації. Одним з джерел інформації про послідовності генів імуноглобулінів є National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Бетесда, Меріленд. Після того як вказана ДНК виділена, її можна функціонально пов'язати з послідовностями, контролюючими експресію, або помістити в експресивні вектори, якими потім трансфікують клітинигосподарі, такі, як клітини Е. соlі, клітини африканської зеленої мавпи (клітини COS), клітини яєчників китайського хом'яка (СНО), або клітини мієломи, які інакше не продукують білок імуноглобуліну, щоб безпосередньо синтезувати моноклональні антитіла в рекомбінантних клітинах-господарях. Рекомбінантне одержання антитіл добре відоме в даній області. До послідовностей, контролюючих експресію, відносяться послідовності ДНК, необхідні для експресії функціонально зв'язуючої кодуючої послідовності в певному організмі-господарі. Контролюючі послідовності, які підходять для прокаріот, наприклад, включають послідовність промотора, можливо оператора, і ділянка сполучення рибосоми. Еукаріотичні клітини, як відомо, використовують промотори, сигнали поліаденулювання і енхансери. Нуклеїнова кислота є функціонально зв'язаною у тому випадку, коли вона приведена у функціональний взаємозв'язок з іншою послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, ДНК, кодуюча пропослідовність або секреторна лідуюча послідовність, є функціонально пов'язаною з ДНК, що кодує поліпептид, якщо він експресується у вигляді пробілка, який бере участь в секреції поліпептиду; промотор або енхансер є функціонально пов'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він робить вплив на транскрипцію цієї послідовності; або ділянка сполучення рибосоми є функціонально пов'язаною з кодуючою послідовністю, якщо він розташований таким чином, що полегшує трансляцію. Як правило, «функціонально зв'язаний» означає, що зв'язані таким чином послідовності ДНК є безперервними, у разі секреторної лідуючої послідовності - безперервною і в рамці прочитування. Однак, енхансери не обов'язково розташовуються безперервно. Сполучення завершується літуванням в зручних сайтах рестрикції. Якщо таких сайтів не існує, застосовують синтетичні олігонуклеотидні адаптори або лінкери, відповідно до загальноприйнятої практики. Терміни «клітина», «лінія клітин» і «культура клітин» часто застосовують взаємозамінний, і всі подібні позначення в даній заявці включають потомство. Терміни «трансформанти» і «трансформовані клітини» включають первинну клітину і культури, одержані з них, незалежно від числа пересівань. Також очевидно, що все потомство може бути не ідеально ідентично за змістом в ньому ДНК, унаслідок навмисних або мимовільних мутацій. Потомство мутанта, яке має таку ж функціональну або біологічну активність, що і піддана скринінгу оригінальна трансформована клітина, також включено в об'єм терміну. 95478 26 Даний винахід також передбачає виділені нуклеїнові кислоти, зв'язуючі агенти, що кодують специфічно, або антитіла згідно даного винаходу, можливо функціонально пов'язані з контрольними послідовностями, розпізнаними клітиноюгосподарем, вектори і клітини-господарі, які містять вказані нуклеїнові кислоти, і рекомбінантні методики одержання специфічно зв'язуючих агентів або антитіл, які можуть включати культивування клітини-господаря таким чином, що відбувається експресія вказаної нуклеїнової кислоти, і, можливо, одержання вказаного специфічно зв'язуючого агента або антитіла з культури клітингосподарів або культурального середовища. Безліч векторів відомі в даній області. Компоненти вектора можуть включати один або більш з перерахованих далі: сигнальну послідовність (яка може, наприклад, направляти секрецію вказаного специфічно зв'язуючого агента або антитіла), крапку початку реплікації, один або більш генів селективних маркерів (які можуть, наприклад, наділяти стійкістю до антибіотика або іншого лікарського препарату, комплементують ауксотрофні дефіцити, або поставляють важливі живильні компоненти, відсутні в середовищі), енхансерний елемент, промотор і послідовність терминації транскрипції, кожен з яких добре відомий в даній області. Відповідні клітини-господарі включають прокариотичні, дріжджові або вищі еукаріотичні клітини, описані вище. Відповідні для цих цілей прокаріоти включають еубактерії, такі, як грамнегативні або грампозитивні організми, наприклад, Enterobacteriaceae такі, як Escherichia, наприклад, Е. coli, Enterohacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, наприклад, Salmonella typhimurium, Serratia, наприклад, Serratia marcescans, і Shigella, також, як і Bacilli такі як В. subtilis і В. licheniformis, Pseudomonas і Streptomyces. Окрім прокаріот, відповідними господарями для клонування або експресії векторів, що кодують що специфічно зв'язують агенти є еукаріотичні мікроби, такі, як міцеліальні гриби або дріжджі. Saccharomyces cerevisiae, або звичайні пекарні дріжджі, є найширше використовуваними нижчими еукаріотами серед мікроорганізмів-господарів. Однак, ряд інших видів і штамів загальнодоступні і застосовні в рамках даної заявки, таких, як Pichia, наприклад, P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces, Yarrowia; Candida; Trichoderma reesia; Neurospora crassa; Schwanniomyces, такі, як Schwanniomyces occidentalis; і міцеліальні гриби, такі, як, наприклад, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium і господарі Aspergillus, такі, як A. nidulans і A. niger. Відповідні клітини-господарі для експресії глікозілірованого специфічно зв'язуючого агента або антитіла одержують з багатоклітинних організмів. Приклади клітин безхребетних включають клітини рослин і комах. Було ідентифіковано безліч штамів бакуловірусів і варіантів і відповідних допустимих клітин-господарів комах з таких організмів, як: Spodoptera frugiperda (гусениця), Aedes aegypti (москіт), Aedes albopictus (москіт), Drosophila melanogaster (плодова мушка) і шовкопряд Bombyx mori. Безліч вірусних штамів для трансфе 27 кції таких клітин загальнодоступні, наприклад, L-1 варіант вірусу совки каліфорнійської люцерневої (Autographa californica NPV) і Bm-5 штам вірусу Bombyx mori NPV. Однак, більшою інтерес викликали клітини хребетних, і культивування клітин хребетних в культурі (культурі тканини) стало звичайною процедурою. Прикладами відповідних ліній клітингосподарів ссавців є клітини яєчників китайського хом'яка, включаючи СНОК1 клітини (АТСС CCL61), DXB-11, DG-44, і клітини яєчників китайського хом'яка /-DHFR (СНО, Urlaub і ін., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); клітини нирки мавпи лінії CV1, трансформовані вірусом SV40 (COS-7, АТСС CRL 1651); лінія ембріональних клітин нирки людини (293 або клітини 293, субклоновані для вирощування в суспензійній культурі [Graham і ін., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)]; клітини нирок сірійського хом'яка (ВНК, АТСС CCL 10); клітини Сертолі миші (ТМ4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); клітини нирки мавпи (CV1 АТСС CCL 70); клітини нирки африканської зеленої мавпи (VERO-76, АТСС CRL-1587); клітини карциноми шийки матки людини (HELA, АТСС CCL 2); клітини нирок собаки (MDCK, АТСС CCL 34); клітини печінки щура Buffalo (BRL ЗА, АТСС CRL 1442); клітини легені людини (W138, АТСС CCL 75); клітини гепатоми людини (Hep G2, НВ 8065); клітини пухлини молочної залози миші (ММТ 060562, АТСС CCL51); клітини TRI (Mather і ін., Annals N.Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); клітини MRC 5 або клітини FS4. Клітини-господарі трансформують або трансфеціюють вищеописаними нуклеїновими кислотами або векторами для одержання специфічно зв'язуючого агента або антитіла і культивують в традиційному питательному середовищі, модифікованому належним чином для індукції промоторів, селекції трансформантів або ампліфікація генів, що кодують необхідні послідовності. Крім того, нові вектори і трансфіковані лінії клітин з множиною копій одиниць транскрипцій, відокремлені за допомогою селективного маркера, є особливо придатними і переважними для експресії специфічно зв'язуючих агентів або антитіл. Клітини-господарі, вживані для одержання специфічно зв'язуючого агента або антитіла згідно даного винаходу можна культивувати у ряді середовищ. Доступні для придбання середовища, такого, як середовище Ham's F10 (Sigma), мінімальне необхідне середовище ((MEM), (Sigma), RPMI1640 (Sigma), і модифіковане за способом Дульбекко середовище Голка ((DMEM), Sigma), підходять для культивування вказаних клітин-господарів. Додатково, будь-яке з середовищ, описаних у Ham і ін., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes і ін., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), в патентах США з номерами 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; або 5,122,469; WO90103430; WO 87/00195; або в патенті США per. номер 30,985, можна застосовувати як культуральне середовище для вказаних клітин-господарів. Будь-яке з цих середовищ можна доповнити, якщо необхідно, гормонами і/або іншими чинниками зростання (такими, як інсулін, трансферин або епідермальний чинник зростан 95478 28 ня), солями (такими, як хлорид натрію, кальцію, магнію, і фосфати), буферами (такими, як HEPES) Суттєві модифікації у біологічних властивостях специфічно зв'язаних агентів або антитіл здійснюють шляхом відбору замін, які значно відрізняються за їх ефектом по підтриманню (а) структури поліпептидного зв'язку в ділянці заміни, наприклад, у вигляді шаруватої або спіральної конформації, (b) заряду або гідрофобної молекули в цільовому сайті, або (с) маси бокового ланцюга. Амінокислотні залишки поділяють на групи, базуючись на загальних властивостях бокових ланцюгів. (1) гідрофобні: норлейцин, met, ala, val, leu, ile; (2) нейтральні гідрофільні: cys, ser, thr; (3) кислі: asp, glu; (4) основні: asn, gin, his, lys, arg; (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: gly, pro; та (6) ароматичні: tip, tyr, phe. Консервативні заміни викликають заміну амінокислоти на інший член того самого класу. Неконсервативні заміни викликають заміну члена одного з даних класів на член іншого класу. Будь-який залишок цистеїну, який не приймає участь у збереженні правильної конформації агентів, який специфічно зв'язаний або пом'якшений, або іншого антитіла, також можна замістити, як правило на серін, для покращення стабільності молекули при окисненні і запобіганні аберрантному перехресному зшиванню. І навпаки, цистеїновий зв'язок (и) можна ввести у специфічно зв'язаний агент або антитіло для підвищення стабільності (особливо, коли антитіло є фрагментом антитіла такий як Fv-фрагмент). Аффінні дозрівання Аффінне дозрівання включає одержання і скринінг варіантів специфічно зв'язуючого агента або антитіла, які несуть мутації (делеції, вставки або заміни) всередині CDR батьківського агента або антитіла, який специфічно зв'язаний, і відбір варіантів, які мають покращені біологічні властивості такі, як аффінність зв'язування, порівняно з батьківським агентом або антитілом, які специфічно зв'язані. Зручним шляхом одержання таких варіантів із заміщенням є аффінне дозрівання з використанням фагового дисплею. Коротко, окремі декілька сайтів гіперзмінної області (наприклад, 67 сайтів) мутують для одержання всіх можливих замін амінокислот в кожному сайті. Моновалентні варіанти специфічно зв'язаного агента або антитіла, які одержані таким чином, можна змоделювати з ниткоподібної фагової часточки у вигляді (суцільних, або злитих) сплавів до гену III M13, який упакований всередині кожної часточки. Варіанти, які були відтворені у фагу, потім піддаються скринінгу на їх біологічну активність (наприклад, аффінність зв'язування), що показано у цьому документі або описанні. Для того, щоб ідентифікувати гіперзмінні залишки області, які вносять значний вклад у зв'язування антигену, можна провести аланін скануючий мутагенез. Крім того, як альтернатива цього, або у доповнення, може бути корисним аналіз кристалічної структури комплексу антиген-антитіло для ідентифікації точок контакту між певним специфіч 29 но зв'язаними агентом або антитілом і антигеном. Такі залишки контакту і суміжні залишки є кандидатами на заміщення, згідно з методикою, яка детально розроблена в даному документі. Як тільки одержані такі залишки, група варіантів піддається скринінгу, як описано в даній заявці, і можна відібрати спеціфічно зв'язані агенти або антитіла з найкращими властивостями для подальшої розробки в одному або більше відповідних тестах. Методи, які використовують генну перетасовку та спрямовану еволюцію можна також використовувати для одержання і скринінгу необхідної активність варіантів специфічно зв'язаного агента або антитіла. Наприклад, Jermutus та ін., Proc Natl Acad Sci U S A. 2 січня, 2001 ;98(l):75-80 доповідають, що допрацьовані стратегії селекції in vitro, які базуються на рибосомному дисплеї, поєднували із різноманітним введенням in vitro ДНК шляхом перетасовки, для того, щоб змінити або швидкість виведення або термодинамічну стабільність одноланцюгових Fv фрагментів антитіл (scFv); Fermer та ін., Tumour Biol. 2004 Jan-Apr;25(l-2):7-13 повідомили, що застосування фагового дисплею в комбінації з перетасовкою ДНК збільшило аффінність майже на три порядки. Зміна характеру глікозилювання Також можна одержати варіанти специфічно зв'язучого агенту або антитіла, які мають видозмінений малюнок (паттерн) глікозилювання порівняно з батьківським специфічно зв'язуючим агентом або антитілом, наприклад, видаленням однієї і більше молекул цукрів із специфічно зв'язуючого агента або антитіла, і/ або додаванням одного і більше сайтів глікозилювання, які відсутні у специфічно зв'язуючому агенті або антитілі. Глікозилювання поліпептидів, включаючи антитіла, є зазвичай або N-зв'язаним, або Озв'язаним. N-зв'язане відноситься до приєднання вуглецевої групи до бічного ланцюга залишка аспарагіну. Трипептидні послідовності аспарагіну-Хсерін і аспарані-Х-треонін, де X може бути будьякою амінокислотою, за виключенням проліна, є послідовностями пізнання для ферментного приєднання вуглецевої групи до аспарагінового бічного ланцюга. Таким чином, наявність будь якої з даних трипептидних послідовностей у поліпептиді створює потенційний сайт для глікозилювання. Отже, N-зв'язані сайти глікозилювання можно ввести у специфічно зв'язаний агент або антитіло шляхом змінення послідовностей амінокислот. О-зв'язане глікозилювання відноситься до приєднання одного з цукрів N-ацетілгалактозаміну, галактози або ксилози до гідроксиамінокислоти, частіш за все до серину або треаніну, хоча також можна використовувати 5-гідроксипролін або 5-гідроксилізин. Озв'язані сайти глікозилювання можна ввести у специфічно зв'язуючі агенти або антитіла шляхом вставки або заміщення одного або більше залишків серину або треоніну у послідовності оригінального специфічно зв'язуючого агента або антитіла. Інші модифікації Можна видалити або ввести залишок(ки) цистеіну у Fc ділянку, тим самим усуваючи або стимулюючи утворення дисульфітного зв'язку в ланцюгу в цій ділянці. Гомодимерний специфічно зв'язую 95478 30 чий агент або антитіло, одержаний таким чином, може мати покращану здатність до інтерналізації і/або підвищену опосередковану кілерну функцію комплементу для клітин і антитілозалежною клітинно обумовленою цитотоксичністю (ADCC). Див. Сагоп та ін., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) і Shopes, В. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Можна також одержати гомодимерні специфічно зв'язані агенти або антитіла з використанням гетеробіфункціональних крос-лінкерів, як описано у Wolff та ін., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Як альтернативи, можна сконструювати специфічно зв'язуючий агент або антитіло, яке має подвійні Fcобласті, і тим самим можна підвищити здатність до комплементарного лізісу і ADCC. Див. Stevenson та ін., Anti-CancerDrug Design 3: 219-230 (1989). Було показано, що послідовності всередині CDR можуть викликати зв'язування антитіла з головним комплексом гістосумісності (МНС) II класу і індукувати небажану хелперну Т-клітинну відповідь. Консервативні заміни дозволять специфічно зв'язуючому агенту або антитілу зберегти активність зв'язування, але знизити його здатність індукувати небажану Т-клітинну відповідь. Також передбачається, що можуть бути видалені одна або більше з 20 N-кінцевих амінокислот важкого або легкого ланцюга. Модифікації для збільшення періоду напіввиведення із сироватки крові також можуть бути бажаними, наприклад, їх можна зробити шляхом введення або додавання епітопа зв'язування salvage-рецептора (наприклад, шляхом мутацій відповідної ділянки або шляхом введення епітопа у пептидну мітку, яку потім зливають із специфічно зв'язуючим агентом або антитілом у будь якому кінці або в середині. Наприклад, шляхом ДНК - або пептидного синтезу) (див. наприклад, WO96/32478), або додавання молекул таких як PEG або інші водорозчинні полімери, включаючи полісахаридні полімери. Епітоп зв'язування salvage-рецептора, здебільшого, утворює ділянку, яка відрізняється тим, що будь-який один або більше залишків амінокислот з однієї або з двох петель Fc домена перенесені в аналогічні положення специфічно зв'язуючого агента або антитіла, або фрагмента. Ще краще перенесені три або більше залишка з однієї або двох петель Fc домена. Переважно, вказаний епітоп брали з СН2 домена Fc ділянки (наприклад, з IgG) і переносили в СН1, СН3 або Vh ділянку, або понад одну таку ділянку здатну специфічно зв'язувати агент або антитіло, як альтернативу, вказаний епітоп беруть з СН2 домена Fc ділянки і переносять у CL ділянку або VL ділянку, або в обидві ділянки, специфічно зв'язуючого агента або фрагмента антитіла. Див. також міжнародні заявки на патент WO 97/34631 і WO 96/32478, які описують Fc варіанти та їх взаємодію з salvage-рецептором. Регуляція гомеостаза IgG in vivo залежить від його зв'язування з неонатальним Fc рецептором (FcRn). Повідомляли, що зміна взаємодії між Fc доменом IgG і FcRn покращує період напіввиведення моноклональних антитіл із сироватки крові. Мутації у Fc, які призводять до більш високої аф 31 фінності зв'язування з неонатальним Fc рецептором (FcRn) і уповільнюють деградацію, і покращають ФК профіль, будуть переважними. Сайт зв'язування FcRn і IgG розташований на границі СH2СH3 домена. Мутаціії залишків в цій області (M428L і T250Q/M428L, T250Q/M428L, P257I/Q311I, M252Y/S254T/T256E, H433K/N434F/Y436H або M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F/Y436H) призводять до підвищення аффінності IgG1 до FcRn людини при рН 6.0 і рН 7.3. Додатково, деякі з цих мутацій призводили до покращання фармакокінетичних властивостей (уповільнений кліренс, більш довгий період напіввиведення) при введенні внутрішньовенно мавпам. Також були ідентифіковані інші сайти константної області, які відповідають за комплементзалежну цитотоксичність (CDC), такі як сайт зв'язування C1q, і/або антитілозалежну клітинно обумовлену цитотоксичність (ADCC) [див., наприклад, Моіес. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992); Shields та ін., J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604 (2001), повністю включені у дану заявку шляхом посилання]. Мутація залишків всередині сайтів зв'язування Fc рецептора може привести до зміни (тобто збільшення або зменшення) ефекторної функції, як, наприклад, змінена ADCC або CDC активність, або змінений період напіввиведення. Як описано вище, потенційні мутації включають вставку, делецію або заміну одного або більше залишків, включаючи заміну на аланін, консервативну заміну, неконсервативну заміну або заміщенння на відповідний амінокислотний залишок в тому же положенні з іншого підкласу (наприклад, заміщення IgG1 залишка на відповідний IgG2 залишок в цьому же положенні). Інші ковалентні модифікації Ковалентні модифікації вказаного агенту або антитіла, які специфічно зв'язуються, також включені в об'єм цього винаходу. їх можна створювати шляхом хімічного синтезу або шляхом ферментативного або хімічного розщеплення специфічно зв'язуючого агенту або антитіла, якщо вони придатні. Інші типи ковалентних модифікацій можна ввести у специфічно зв'язуючий агент або антитіло шляхом проведення реакції цільових залишків амінокислот з органічним модифікуючим агентом, який здатен реагувати із відібраними бічними ланцюгами або N- або С-кінцевими залишками. Залишки цистеїну, зазвичай, реагують з галоацетатами (і відповідними амінами), такими як хлороцтова кислоти або хлорацетамід, для того, щоб одержати похідні карбоксиметила або карбоксиамідометила. Цистеїнові залишки також утворюються за допомогою реакції з бромтрифторацетоном, альфа-бром-бета(5-імідозоіл)пропіоновою кислотою, хлорацетілфосфатом, Nалкілмалеімідами, 3-нітро-2-піріділ-дисульфідом, метил-2-піріділдисульфідом, пхлорртутьбензоатом, 2-хлорртуть-4-нітрофенолом або хлор-7-нітробензо-2-окса-1,3-діазоллом. Гістидилові залишки модифікують шляхом взаємодії з діетилпірокарбонатом при рН 5.5-7.0, оскільки вказаний агент є відносно специфічним для гістидилового бічного ланцюга. Також можна 95478 32 застосовувати пара-бромфенацилбромід; взаємодію, краще здійснювати у 0.1М розчині какоділата натрію при рН 6.0. Лізінілові та амінокінцеві залишки приводят у взаємодію з янтарним ангідридом або ангідридами інші карбонові кислоти. Модифікація зазначеними агентам може призводити до змін заряда лізинових залишків. Інші реагенти, які підходять для перетворення (деривації) альфа-аміновмісних залишків включають імідоефіри, такі як метилпіколінімідат; пірідоксальфосфат; пірідоксаль; хлорборогідрид; тринітробензолсульфонова кислота; Ометилізосечовина; 2,4-пентан-діон і гліоксилат у реакції, яка каталізується трансаміназою. Аргінілові залишки модифікують шляхом взаємодії з одним або декількома звичайними реагентами, серед яких фенілгліоксаль, 2,3-бутандіон, 1,2-циклогександіон і нінгідрин. Для перетворення (дериватизації) залишків аргініну необхідно, щоб взаємодія здійснювалася у лужному середовищі через високий рКа гуанідінової функціональної групи. Крім того, такі реагенти можуть взаємодіяти з групами лізину, а також з епсилон-аміногрупою аргініну. Можна також здійснювати необхідні модифікації тирозилових залишків, особливо цікавими є випадки введення спектральних міток у тірозилові залишки за допомогою реакції з ароматичними сполуками діазонія або тетранітрометаном. Для утворення видів О-ацетіл тірозила і відповідно 3нітропохідних, найчастіше використовують Nацетилімідізол і тетранітрометан. Тірозилові за125 131 лишки йодують, застосовуючи Іабо І, для одержання мічених білків для використання в радіоімунологічному аналізі. Карбоксильні бічні групи (аспартіл або глутаміл) селективно модифікують шляхом взаємодії з карбодіімідами (R-N=C=N=R'), де R і R' є різними алкільними групами, такими як 1-циклогексил-3-(2-морфоініл-4-етіл)карбодіімід або 1етіл-3-(4-азоніа-4,4діметилфеніл)карбодіїмід. Крім того, аспартілові і глутамілові залишки перетворюються у аспарагінілові і глутамінілові залишки через взаємодію з іонами аммонію. Глутамінілові і аспарагінілові залишки до відповідних глутамілових і аспартилових залишків, відповідно. Ці залишки деамідують у нейтральних або основних умовах. Деамідована форма цих залишків входить в обсяг цього винаходу. Інші модифікації включають гідроксилювання проліна і лізина, фосфорування гідроксильних груп серилових або треонілових залишків, метилюванням альфа-аміногруп лізина, бічних ланцюгів аргиніна і гістидіна (Т. Е. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, стр.79-86 (1983)), ацетилюванням Nкінцевого аміна і амідуванням будь-якої С-кінцевої карбоксильної групи. Інший тип ковалентних модифікацій включає хімічне або ферментативне приєднання глікозидів до специфично зв'язуючого агента або антитіла. Цим процедурам надається перевага, оскільки вони не потребують продукції вказаного специфічно зв'язуючого агента або антитіла в клітині 33 господарі, яка здатна здійснювати N- або Озв'язане глікозилювання. В залежності від застосованого способу приєднання цукор(у), можна приєднати до (а) аргініну і гістидіну, (b) вільних карбоксильних груп, (с) вільних сульфгідрильних груп, таких як групи цистеіна, (d) вільних гідроксильних груп, таких як групи серина, треоніна або гідроксипроліна, (є) ароматичних залишків, таких як залишки фенілаланіна, тірозина або триптофана, або (f) амідної групи глутаміна. Ці способи описані в WO87/05330, опублікованій 11 вер. 1987, і в Aplin і Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., стор. 259306 (1981). Видалення будь-якої молекули вуглецю, яка присутня на зазначеному специфічно зв'язуючому агенті або антитілі, можна здійснити хімічно або ферментативно. Хімічне деглікозилювання вимагає контакта специфічно зв'язуючого агента або антитіла з трифторметансульфоновою кислотою, або еквівалентною сполукою. Ця обробка призводить до розщеплення більшості або всіх цукрів, крім зшиваючого цукру (N-ацетилглюкозаміна або N-ацетилгалактозаміна), при цьому залишаючи специфічно зв'язуючий агент або антитіло інтактним. Хімічне деглікозилювання описано у Hakimuddin, та ін. Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987) і у Edge та ін. Anal. Biochem., 118: 131 (1981). Ферментативне розщеплення молекул вуглецю на специфічно зв'язуючому агенті або антитілі можна здійснити, застосовуючи різноманітні ендо- і екзоглікозідази, як описано у Thotakura та ін. Meth. Enzymol. 138: 350 (1987). Інший тип ковалентних модифікацій зазначеного специфічно зв'язуючого агента або антитіла включає зшивання специфічно зв'язуючого агента або антитіла з одним із великої кількості небілкових полімерів, наприклад, поліетілєнгліколем, поліпропілєнгліколем, поліоксиетиліруваними поліолами, поліоксиетиліруваним сорбітолом, поліоксиетиліруваною глюкозою, поліоксиетиліруваним гліцерином, поліоксиалкілєнами або полісахаридними полімерами, такими як декстран. Подібні способи відомі в даній галузі, див., наприклад патенти США з номерами 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192, 4,179,337, 4,766,106, 4,179,337, 4,495,285, 4,609,546 або ЕР 315 456. Терапевтичне застосування «Лікування» являє собою втручання, яке виконується з наміром попередити розвиток або змінити патологію розладу. «Лікування», відповідно, відноситься як до терапевтичного лікування, так і до профілактичних або запобіжних заходів. До тих, хто потребує лікування включають таких, хто вже страждає вказаним розладом, а також тих, у кого вказаний розлад необхідно запобігти. Заради лікування, поняття «ссавці» відноситься до будь якої тварини, яка класифікується як ссавець, включаючи людину, домашніх і сільськогосподарських тварин і тварин для зоопарків, спорту, або домашніх улюбленців таких як собаки, коні, коти, корови та ін. Серед ссавців перевага віддається людині. При використанні в даній заявці, вираз «терапевтично ефективна кількість» мається на увазі 95478 34 відзначення такої кількості терапевтичного або профілактичного гуманізованого антитіла до c-Kit, яке забезпечує зниження t числа і/або активності тучних клітин або клітин-попередників, зменшення фіброзних елементів або утворень, які їм передували, або таке, яке забезпечує зниження тяжкості або прогресування симптомів, які пов'язані з с-Kitзв'язаним захворюванням (тобто, таке, яке забезпечує «терапевтичну ефективність»). Тучні клітини і гематопоетичні плюрипотентні стовбурові клітини-попередники представляють собою типи первинних клітин, які експресують cKit, і, отже, передбачено, що на клітини, які одержані з ГСК, такі як тучні клітини, і ті, які втягнуті у захворювання, можна впливати композиціями і способами згідно з цим винаходом. Вираз «активність, яка зменшує фіброз» мається на увазі позначити здатність інгібувати, цілком або частково і спрямовувати запалення, яке викликане активацією імуної системи і фіброзом. При використанні в даній заявці, терміну «фіброзне захворювання або розлад» відноситься до патологічного стану, включаючи фіброз однієї або декількох тканин. При використанні в даній заявці, терміну «фіброз», останній, відноситься до аберрантного утворення або розвитку надлишку фіброзної сполучної тканини в органі або тканині у вигляді реактивного процесу, у протилежність утворенню фіброзної тканини, як нормальної складової, або загоєнню органа, або тканини. Фіброз характеризується накопиченням фібробластів і депонуванням надлишку коллагена по відношенню до нормального депонування в будь якій конкретній тканині. При використанні в даній заявці терміну «фіброз» вживають синонімічно з «аберрантне загоєння, яке включає перетворення мезенхімальних клітин у фібробласти, надлишкову проліферацію, активність фібробластів і депонування колагена і інших білків позаклітинного матриксу». Фібробласти являють собою клітини сполучної тканини, які розосереджені по сполучній тканини всього організму. Фібробласти секретують еластичний позаклітинний матрикс, який містить колаген 1 типу і /або Ш типу. У відповідь на пошкодження тканини, сусідні фібробласти або мезенхімальні клітини-попередники у кровотоці мігрують у рану, можуть перетворитися, в якості альтернативи, активованними під впливом інших клітин, таких як тучні клітини та їх медіатори, проліферувати і продукувати більшу кількість колагенового позаклітинного матриксу. Колаген являє собою фібрилярний білок, багатий гліцином і проліном, який є основним компонентом позаклітинного матриксу і сполучної тканини, хряща і кістки. Молекули колагена є тринитковими спіральними структурами, які називають а-ланцюгами, які обвивають один одного, утворюючи спіраль, яка подібна до мотузки. Колаген існує у декількох формах або типах; з них 1 тип є найбільш поширеним і виявляється у шкірі, сухожиллі і кістках; Ш тип виявляється у шкірі, кровоносних судинах і внутрішніх органах. Фіброзні захворювання, які пов'язанні з тучними клітинами, включають патологічний фіброз або рубцювання (включаючи ендокардіальний фіброеластоз), ідеопатичний інтерстіциальний фіброз, 35 інтерстіциальний фіброз легень, субадвентиціальний фіброз стінок артерій, фіброз Сіммерса, перицентральний фіброз, гепатит, дерматофіброму, біліарний цироз, алкоголічний цироз, гострий фіброз легень, ідіопатичний фіброз легень, синдром гострої дихальної недостатності, фіброз нирок/гломерулонефріт, фіброз нирок /діабетична нефропатія, склеродермію/системну, склеродермію/локальну, келоїди, гіпертрофовані шрами, тяжке зрощення суглобів/артрит, мієлофіброз, рубцювання рогівки, муковісцедоз, м'язева дистрофія (Дюшенна), фіброз серця, фіброз м'язів/ відшарування сітчатки, стріктура стравоходу і хвороба пейронія. Додатково фіброзні розладнання можуть бути індуковані або ініційовані операцією, включаючи видалення шрамів/пластичну хірургію, глаукому. Фіброз задньої капсули кришталика, рубцювання роговиці, зрощування зв'язок, захворювання «трансплантат проти хазяїна», операцію на сухожиллі, защемлення нерва, контрактуру Дюпюнтрена, гінекологічні спайки /фіброз, тазові спайки, передуральний фіброз, рестеноз. Також припускається, що фіброзний патологічний стан, де депонування фібронектина є причинним фактором, можна лікувати згідно цього винаходу. Ідеопатичний фіброз легені, індукований блеоміцином фіброз легені, кістозний фіброз і гломерулярна нефропатія, включаючи захворювання, які характеризуються відкладенням фіброконектину у нирках, що в кінцевому рахунку, призводить до ниркової недостатності є прикладами патологічних станів, які також можна лікувати згідно з цим винаходом. Запалення, які включають активацію імунної системи, і при яких тучні клітини секретують запалювальні цитокіни, такі як ФНО, і можуть активувати й безпосередньо взаємодіяти з лімфоцитами, також можна лікувати згідно цього винаходу. Склеродермію вважають аутоімунним захворюванням сполучної тканини, яке призводить до фіброзного розладу, що характеризується потовщенням і ущільненням шкіри, яке викликане надмірною продукцією нового колагену фібробластами у шкірі і інших органах. Склеродермія може виникнути як локальне або системне захворювання, яке зачіпає ряд органів. Склеродермію також називають системним склерозом. Розвиток склеродермічної патології пов'язано із збільшенням числа тучних клітин в уражених тканинах/органах, які зазнали хворобу. Системний склероз характеризується утворенням гіалінізованої і потовщеної колагенової фіброзної тканини, з потовщенням шкіри і адгезією до підстилаючих тканин, особливо на руках і обличчі. Вказане захворювання також можна охарактеризувати дисфагією внаслідок втрати перистальтики і підслизовим фіброзом стравоходу, задишка, внаслідок фіброзу легенів, фіброзом міокарду і змінами у ниркових судинах (Stedman's ое Medical Dictionary, 26 видання, Williams & Wilkins, 1995). Фіброз легенів уражує від 30 до 70% пациєнтів із склеродермією, часто призводить до легеневого фіброзу (Atamas та ін. Cytokine and Growth Factor Rev 14: 537-550 (2003)). 95478 36 Деякі пацієнти мають одночасно склеродермію і інші захворювання сумісної тканини, такі як ревматоідний артрит, системна червона волчанка і поліміозит. Коли ознаки склеродермії присутні поряд з ознаками поліміозиту і системної червоної вовчанки, патологічний стан називають змішаним захворюванням сумісної тканини (MCTD). Відомо, що симптоми, які присутні в деяких формах дерматиту, викликані деградацією тучних клітин шкіри, які призводять, зокрема, до вивільнення гістаміну. Отже, іншим розладом, який пов'язаний з тучними клітинами, слушний, для лікування згідно з цим винаходом, є пігментна кропивниця. Цей розлад представляє характерні шкіряні ураження, у вигляді поодиноких або множинних пігментованих плям або вузлів, які сверблять при терті і містять велику кількість тучних клітин. Існують різні форми зв'язаних дерматитів (запалення шкіри) таких як ерітема, набряк, папульозний висип і свербіж, які можуть бути присутніми при дерматитах людини і тварини, кожний з яких можна лікувати згідно цього винаходу. Мастоцидоз спричиняє в багатьох випадках неопластичне захворювання і включає новий або аномальний ріст тучних клітин і може бути наслідком підвищенної аутокринної передачі сигналів SCF або активувати c-Kit мутації. Мастоцидоз може бути обмеженим або системним, включаючи численність органів таких як, наприклад кісковий мозок. Тучні клітини вивільнюють деякі медіатори, або хімічні сполуки, в організмі, у відповідь на деякі події, одним з них є гістамін. Люди, які страждають на системний мастоцидоз, мають підвищенну кількість тучних клітин або їх тучні клітини мають неправильну форму, останні не можуть нормально функціонувати. Надодачу, тучні клітини не можуть відмирати, коли необхідно, що призводить до додаткового збільшення загального пулу тучних клітин. Коли тучні клітини дегранулюються і вивільняють свій вміст, це може призвести до багатьох гострих і потенційно серйозних патологічних станів або захворювань. Розлади, які пов'язані із тучними клітинами також включають проліферативні розлади, які призводять до локалізованих захворювань, таких як поодинокі мастоцидози шкіри аж до більш тяжкого захворювання, такого як тучноклітинний лейкоз. Приклади включають мастоцитому шкіри, активний мастоцитоз. Хронічний мастоцитоз, мастоцитоз із зв’язаним гематологічним розладом, пігментну кропивницю, телеангіектазію macularis eruptiva perstans (tmep), системне захворювання за участю тучних клітин, тучноклітинний лейкоз, мієлоїдну лейкемію, системний мастоцидоз (з присутністю або без шкірних проявів, таких як пігментна кропивниця), синдром/розлад активації тучних клітин, і більш поширені педіатричні розлади за участю тучних клітин, такі як поодинока мастоцитома і диффузний мастоцитоз шкіри. Синдром або розлад активації тучних клітин характеризується нормальним або майже нормальним числом тучних клітин. Тим не менш, тучні клітини легко провокуються із вивільненням іх вмісту, що призводить до багатьох аналогічних симптомів. Із цим розладом пов'язана загроза анафіла 37 ксії і шоку, але, на відміну від проліферативних розладів за участю тучних клітин, у цього синдрому може бути відсутня здатність прогресувати до більш агресивного або злоякісного стану. Приклади подібних розладів, які пов'язані з дегрануляцією тучних клітин, можуть включати біль у животі, кропивницю і висипання, анафілаксію, запалення стравоходу, зміну кров'яного тиску і шок, інтестіальні судоми і здуття, біль кісток (від легкої до тяжкої/виснажуючої), коросту, із висипом і без, біль у грудях, печінці, селезінці і в оточенні інших органів, когнитивні затруднення /запаморочення свідомості, розлад всмоктування, остеохондроз, мігрені, діарею, м’язовий біль, запаморочення/вертиго/млість, нудоту, втрату свідомості, остеопороз/остеопенію, стомлюваність, периферичну нейропатію і парестезію, гіперемію, прискорене серцебиття, гастроезофагеальний рефлюкс і блювотиння. Роль тучних клітин і алергічних захворювань була клінічно доказана за допомогою препаратів, які блокували специфічні медіатори тучних клітин, такі як гістамін і кортикостероїди, які окрім інших активностей викликають апоптоз тучних клітин. Додатково зв'язані із тучними клітинами захворювання включають гістамін-опосередковані алергічні реакції, які можна лікувати шляхом інгібування дегрануляції індукованих хемокінами тучних клітин і базофілів, і вивільнення гістаміну. Приклади зв'язаних з тучними клітинами розладів або захворювань, які можна ефективно лікувати способами і композиціями згідно цього винаходу, також включають, але не обмежені наведеними; контактний дерматит, атипічний дерматит, алергічний дерматит, екзематозний дерматит і дерматити, які викликані укусами або ужаленнями комах. Інші зв'язані з тучними клітинами свідчення, які підходять для лікування способами і композиціями згідно цього винаходу, включають запалювальні стани легень при інтерстиціальних захворюваннях легенів, наприклад, саркоідоз, респіраторний дістрес-синдром новонароджених (РДС), бронхопульмональну дисплазію (BPD) і стани, які характеризуються підвищенням сироваточної активності PLA2, такі як РДС дорослих (РДСВ). Також повідомлялось, що тучні клітини відіграють роль при артриті. Кількість тучних клітин підвищена у запальних синовіальних тканинах пацієнтів із ревматоїдним артритом і остеопорозом, і Глівек™, як було показано, викликає апоптоз тучних клітин у синовіальних експлантах і контрольно-діагностичних дослідженнях людей показали ефективність для пациєнтів із ревматоїдним артритом. Тучні клітини відіграють роль при септичному шоці, панкреатиті, колагенозі судин, гострій нирковій недостатності, перитоніті і аутоімуному увеїті. Дослідження також дозволили припустити, що тучні клітини приймають участь у патофізіології множинного склерозу. Вважають, що тучні клітини у мізку вивільняють вазоактивні аміни, які можуть викликати демієлінізацію. Вивільнення гістаміна з тучних клітин може змінити цілісність кровоносних судин і викликати часткове порушення гематоенцефалічного бар'єру, знову ж таки приймають 95478 38 участь в етіології множинного склерозу. Отже, передбачено, що способи і композиції згідно із цього винаходу підходять для лікування або покращання захворюваності, яка пов'язана із множинним склерозом. C-kit також експресується на деяких неімунних клітинах, таких як меланоцити і інтестинальні клітини, також на сперматоцитах. Теперішній винахід може мати застосування при лікуванні меланоми і GIST і може мати застосування як чоловічий контрацептив. Застосування і одержання Фармацевтичних лікарських форм Анті -c-Kit специфічно зв'язуючі агенти або антитіла, які використовують при здійсненні способа згідно цього винаходу, можуть знаходитися у складі фармацевтичних композицій, що включають носій, який підходить для бажаного засобу доставки. В носії який підходить, включають будь-який матеріал, який, при об'єднанні з анти-c-Kit специфічно зв’язані і нейтральні антагоністичним агентом або антитілом, зберігає їх високу аффіність зв'язування і ефективність по відношенню до c-Kit і не вступають у взаємодію з імунною системою суб'єкта. Приклади носіїв включають, але не обмежені, будь яким із ряду стандартних фармакологічних носіїв, таких як стерильні фосфатносольові буферні розчини, бактеріостатична вода, і тому подібні. Можна застосовувати різні водні носії, наприклад, воду, забуферену воду, 0,4% сольовий розчин, 0,3% гліцин і тому подібні, і можна включати інші білки для підвищення стабільності, такі як альбумін, ліпопротеїн, глобулін, і т.п., які зазнали легкі хімічні модифікації або тому подібне. Приблизні концентрації антитіл у лікарській формі можуть змінюватися у діапазоні від приблизно 0.1мг/мл до приблизно 180мг/мл або від приблизно 0.1мг/мл до приблизно 50мг/мл, або від приблизно 0.5мг/мл до приблизно 25мг/мл, або як альтернативи, від приблизно 2мг/мл до приблизно 10мг/мл. Водну лікарську форму вказаного антитіла можна одержати у рН-забуференому розчині, наприклад, при рН у діапазоні від приблизно 4,5 до приблизно 6,5. або від приблизно 4.8 до приблизно 5.5, або як альтернативи, приблизно 5.0. Приклади буферів, які підходять по рН в рамках цього діапазону, включають ацетат (наприклад, ацетат натрію), сукцинат (такий як сукцинат натрію), глюконат, гістидин, цитрат і буфери інших органічних кислот. Концентрація буферу може бути від приблизно1мМ до приблизно 200мМ, або від приблизно 10мМ до приблизно 60мМ, в залежності, наприклад, від конкретного буферу і необхідної ізотонічності лікарської форми. У лікарську форму можна включити агент, який впливає на точність, який може також стабілізувати антитіло. Зразкові тонічні агенти включають поліоли, такі як маннітол, цукроза або грегалоза. Надають перевагу вказаній водній ізотонічній лікарській формі, хоча гіпертонічні або гіпотонічні розчини також можуть бути підходящими. Приблизні концентрації поліолів у лікарській формі можуть змінюватися від приблизно 1% до приблизно 15% w/v (об'єм до ваги). 39 Поверхнево-активну речовину можна також додавати до лікарської форми антитіла для зменшення аггрегації антитіла, яке знаходиться в лікарській формі і/або мінімізування утворення твердих часток у лікарській формі і/або зменшення всмоктування. Приблизні поверхнево-активні речовини включають неіонні поверхнево-активні речовини, такі як полісорбати (наприклад, полісорбат 20 або полісорбат 80) або полоксамери (наприклад, полоксамер 188). Приблизні концентрації поверхнево-активної речовини можуть змінюватися у діапазоні від приблизно 0,001: до приблизно 0.5%, або від приблизно 0.005% до приблизно 0.2%, або, як альтернатива, від приблизно 0.004: до приблизно 0.01% w/v. В одному варіанті реалізації, вказана лікарська форма містить позначені вище агенти (тобто, антитіло, буфер, поліол і поверхнево-активну речовину) і є по суті вільною від одного або більше консервантів, таких як бензиловий спирт, фенол, метакрезол, хлоробутанол і бензетонія хлорид. У другому варіанті реалізації, консервант може бути включений у лікарську форму, наприклад, у концентрації у діапазоні від приблизно 0,1% до приблизно 2%, або, як альтернатива, від приблизно 0.5% до приблизно 1%. Один або більше інших фармакологічно придатних носіїв, допоміжних речовин або стабілізаторів, таких як описані у Remington's Pharmaceutical Sciences 16-ое изд., Osol, А. ред. (1980), можуть бути включені у лікарську форму при умові, що вони не чинять небажаного впливу на необхідні властивості вказаної лікарської форми. Припустимі носії, допоміжні речовини або стабілізатори є нетоксичними для реципієнтів у дозуваннях і концентраціях, які використовують, і включають; додаткові забуферуючі агенти: допоміжні розчинники; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту і метионін; хелатуючі агенти, такі як EDTA, комплексні сполуки металів (наприклад, комплекси Zn-білок); біодеградуючі полімери, такі як поліефіри; і/або сільутворюючі противоіони, такі як натрій. Терапевтичні лікарські форми вказаного антитіла готують для зберігання і змішування вказаного антитіла, що має бажану ступінь чистоти, з необов'язковими фармацевтично придатними носіями, допоміжними речовинами або стабілізаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16е вид., Osol, A. Ed. (1980)), у вигляді ліофілізованих лікарських форм або водних розчинів. Припустимі носії, допоміжні речовини або стабілізатори є нетоксичними для рецепієнтів у дозах і концентраціях, які використовуються і включають буфери, такі як фосфат, цитрат і інші органічні кислоти; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту і метионін; консерванти (такі, які октадецилдіметилбензиламонія хлорид; гексаметонія хлорид, бензалконій хлорид, бензетоній хлорид, фенол, бутиловий або бензиловий спирт; алкілпарабени, такі як метилабо пропілпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол і мета-крезол); низькомолекулярні (менше ніж приблизно 10 залишків) поліпептиди; білки такі як, сироваточний альбумін, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон; амінокислоти, такі як 95478 40 гліцин, глутамін, аспарагін, гістидин, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди і інші вуглеводні, включаючи глюкозу, манозу, мальтозу або декстрини, хелатуючі агенти, такі як EDTA, цукри такі, як цукроза, манніт, трегалоза або сорбіт; сольоутворюючі протиіони, такі як натрій, комплекси з металами (наприклад, комплекси Zn-білок); і/або неіоногенні поверхнево-активні речовини такі, як TWEEN™, PLURONICS™ або поліетиленгліколь (ПЕГ). У одному варіанті реалізації, лікарська підходяща форма заявленого винаходу містить ізотонічний буфер, такий як фосфатний, ацетатний або TRIS буфер у комбінації з агентом впливаючим на тонічність, таким як поліол, сорбітол, цукроза або хлорид натрію, які тонізують і стабілізують. Одним прикладом такого агента, який впливає на тонічність є 5% сорбітол або цукроза. Крім того, вказана лікарська форма може включати поверневоактивну речовину, наприклад, для запобігання агрегації і для стабілізації, у кількості від 0.01 до 0.02% вага/об'єм. РН вказаної лікарської форми може змінюватися у діапазоні 4.5-6.5 або від 4.5 до 5.5. Інші приклади описаних фармацевтичних лікарських форм для антитіл можна знайти у US 2003/0113316 і патенті США номер. 6,171,586, кожний повністю включений у дану заявку за посередництвом посилань. Заявлена композиція може також включати більш, ніж одну активну речовину, якщо необхідно для конкретного показника для лікування, здебільшого це такі, з комплементарними активностями, які не чинять небажаного впливу один на одного. Наприклад, бажано додатково забезпечити імуносупресорним агентом. Такі молекули відповідним чином присутні у комбінації, у кількостях, які ефективні для наміченого використання. Активні інгредієнти можуть бути розміщені у підготовлених мікрокапсулах, наприклад, методом коацервації або міжфазної полімеризації, для прикладу, у гідроксиметилцелюлозні або желатинові мікрокапсули і мікрокапсули із поліметилметацилат, відповідно, у колоїдних системах для доправлення лікарських препаратів (для прикладу, ліпосоми, мікрогранули альбуміну, мікроемульсії, наночастки або нанокапсули) або у макроемульсії. Подібні методики розкриті у Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-те вид., Osol, А. ред. (1980). Також охоплено суспензії та кристалічні форми антитіл. Способи одержання суспензій і кристалічних форм відомі спеціалістам цієї області. Вказані лікарські форми, які застосовують для введення in vivo, повинні бути стерильними. Композиції згідно цього винаходу можна стерилізувати за допомогою традиційних, широко відомих методів стерилізації. Наприклад, стерилізацію досить легко здійснити шляхом фільтрації через стерильні мембрани для фільтрації. Одержані розчини можуть бути використані або профільтровані у стерильних умовах і ліофілізовані, потім, ліофілізовані препарати об'єднують із стерильним розчином перед введенням. Процес заморожування-висушування часто застосовують для стабілізацій поліпептидів для 41 тривалого зберігання, особливо у випадку, коли поліпептид відносно нестабільний у рідкій композиції. Цикл ліофілізації зазвичай складається із трьох етапів, заморожування, первинне висушування і вторинне висушування; Williams і Polli, Journal of Parenteral Science and Technology, том 38, номер 2, стор. 48-59 (1984). На етапі заморожування, розчин, який було вказано, охолоджують до тих пір, поки він не замерзне достатньо добре, вся вода, у вказаному розчині, на цій стадії утворює кригу. Крига сублімується на етапі первинного висушування, який здійснюється, із застосуванням вакууму, шляхом зменшення тиску у камері нижче тиску насиченої пари криги. Нарешті, адсорбовану або зв'язану воду видаляють на етапі вторинного висушування у камері при зменшеному тиску і підвищеній температурі. В результаті даного процесу утворюється матеріал, відомий як ліофілізований осад. Після цього, перед використанням, осад можна ресуспендувати. Стандартною процедурою ресуспендування ліофілізованного матеріалу є додавання деякого об'єму чистої води (зазвичай, еквівалентного об'єму, який видалили у процесі ліофілізації), хоча розбавлені розчини антибактеріальних агентів інколи застосовують при одержанні фармацевтичних прописів для парентерального введення; Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, том 18, номери 11 і 12, сторінки 1311-1354(1992). Допоміжні речовини у деяких випадках, як було зазначено, діють як стабілізатори для ліофілізованих продуктів; Carpenter та ін., Developments in Biological Standardization, том 74, сторінки 225239 (1991). Наприклад, відомі допоміжні речовини містять поліоли (включаючи маннітол, сорбітол і гліцерин); цукри (включаючи глюкозу і цукрозу); і амінокислоти (включаючи аланін, гліцин і глутамінову кислоту). Надодаток, поліоли і цукри також часто використовують для захисту поліпептидів від ураження, яке викликано заморожуванням і висушуванням і для підвищення стабільності під час зберігання у висушеному стані. Зазвичай, цукри, зокрема, дисахариди, є ефективними як у процесі заморожування-висушування, так і під час зберігання. Інші класи молекул, включаючи моно-і дисахариди і полімери, такі як полівінілпірролідон, також, як повідомлялось, слугували стабілізаторами ліофілізованих продуктів. Для ін'єкціювання, вказана фармацевтична лікарська форма і/або медикамент можуть бути порошком, який підходить для ресуспендування у розчині, який підходить, як описно вище. Приклади порошків включають, але не обмежені порошками, висушеними сублімацією, висушеними ротацією або одержані розпорошувальною сушкою, аморфними порошками, гранулами, преципітатами або твердими часточками. Для ін'єкціювання, вказані лікарські форми можуть містити стабілізатори, агенти, які змінюють рН, поверхнево-активні речовини, агенти, які змінюють біодоступність, та їх комбінації. Можна приготувати препарати із уповільненим вивільненням. Відповідні приклади препаратів із уповільненим вивільненням включають напівпро 95478 42 никні матриці із твердих гідрофобних полімерів, які містять вказане антитіло, дані матриці знаходяться у вигляді продуктів, які мають певну форму, наприклад, плівок або мікрокапсул. Приклади матриць із уповільненим вивільненням включають поліефіри, гідрогелі (наприклад, полі(2гідроксиетилметакрилат) або полівініловий спирт), полілактіди (патент СІЛА номер 3,773,919), сополімери L-глутамінової кислоти і етил -L-глутамат, негідрадовані етиленвінілацетат, дегідрадовані сополімери молочної кислоти, гліколевої кислоти, такі як Lupron Depot™ (ін'єкційні мікрогранули, які складаються із сополімера молочної кислотигліколевої кислоти і л'юпроліда ацетата) і полі-D-()-3-оксимасляну кислоту. В той час як полімери, такі як етиленвінілацетат і сополімер молочної і гліколевої кислот дозволяє досягти вивільнення молекул протягом 100 днів, деякі гідрогелі вивільняють білки протягом більш коротких проміжків часу. Якщо інкапсульовані антитіла залишаються в організмі протягом тривалого часу, вони можуть денатурувати або агрегувати в результаті взаємодії вологи при 37°С, що може спричинити втрату біологічної активності і можливо змінити імуногенність. Доцільні стратегії можуть бути розроблені для стабілізації, в залежності від механізму, який було залучено. Наприклад, якщо виявили, що механізм агрегації складається в утворенні міжмолекулярних S--S зв'язків через тіодісульфідний обмін, стабілізації можна добитися шляхом модифікації сульфгідрильних залишків, ліофілізації із кислих розчинів, контролювання вмісту вологи, застосування підходящих добавок і розробки специфічних композицій на основі полімерних матриць. Лікарські форми згідно з цим винаходом можуть бути розроблені як діючі короткочасно, що швидко вивільняються; довготривало діючими або такими, які уповільнено вивільняються, як описано у даній заявці. Отже, вказані фармацевтичні лікарські форми також можуть бути одержані в лікарській формі із контролюємим вивільненням або уповільненим вивільненням. Конкретні дозування можна підібрати, в залежності від стану захворювання, віку, ваги тіла, загального стану здоров'я, полу та дієти суб'єкта, інтервалів між дозами, шляхів введення, швидкості виведення і комбінацій з іншими лікарськими препаратами. Будь-які з вищезгаданих форм дозування, які містять ефективні кількості, вкладаються в рамки звичайного експериментування і, таким чином, вкладаються в об'єм цього винаходу. Вказаний, специфічно зв'язаний агент або антитіло вводять за допомогою будь яких засобів, що підходять, включаючи парантеральне, підшкірне, інтраперитонеальне, внутрішньолегеневе і інтраназальне, і, якщо буде необхідно для локального лікування, введення всередину ураженої тканини. Парентеральні інфузії включають внутрішньовенне, внутрішньоартеріальне, інтраперитонеальне, внутрішньом'язеве, інтрадермальне або підшкірне введення. Надодачу, вказаний специфічно зв'язуючий агент або антитіло відповідним чином вводять шляхом імпульсної інфузії, особливо зі стухаючими дозами вказаного 43 специфічно зв'язанного агента або антитіла. Дозу вводять шляхом ін'єкцій, найкраще внутрішньовенних або підшкірних ін'єкцій, в залежності, частково, від того чи є введення короткочасним або довготривалим. Пропонуються, також, інші способи введення, включаючи топічне, особливо, трансдермальне, трансмукозальне, ректальне, пероральне або локальне введення, наприклад, за допомогою катетера, який розташований поруч із бажаним місцем. Найкраще, специфічно зв'язуючий агент або антитіло, згідно з цим винаходом, вводили внутрішньовенно у фізіологічному розчині в дозі, яка розташована у діапазоні між 0.01мг/кг і 100мг/кг, із частотою від щоденних введень до щотижневого, щомісячного (наприклад, кожний день, через день, кожний третій день, або 2, 3, 4, 5 або 6 разів на тиждень), переважно в дозі, яка знаходиться у діапазоні від 0.1 до 45мг/кг, від 0.1 до 15мг/кг або від 0.1 до 10мг/кг із частотою 2 або 3 рази на тиждень, або аж до 45мг/кг один раз на місяць. Застосування з іншими агентами Антитіла згідно цього винахода також можна застосовувати разом з іншими протизапальними терапевтичними агентами. Сукупне застосування включає введення двох різних терапевтичних агентів у різний час і різними шляхами, при умові, що існує перекриття у часі, протягом якого вказані агенти роблять свою трапевтичну дію. Приклади анти-c-Kit агентів, відомих у даній області, включають іматиніба мезилат (Гливек™). Слід відмітити, що іматиніба мезилат також антагонізує передачу сигналів від Abl тирозинкінази і, таким чином, не є специфічним інгібітором c-Kit. ПРИКЛАДИ Гуманізація SR-1 Антитіло SR-1 гуманізували прямим CDR щепленням, і несподівано виявилось, що не вимагається зворотніх мутацій для збереження аффіності, хоча необхідно було продемонструвати бажану функціональну активність. Людські структури (The human frameworks), які підтримали більшість канонічних залишків, і не застосовували додаткові залишки проліну, були відібрані як акцепторні послідовності. На основі цього критерію, акцепторну послідовність важкого ланцюгу VH1 1-46 для структури І і II і VH1 1-е для структури III, з JH4 у якості найбільш близької J ділянки (також відомого як структура IV). Акцепторна послідовність легкого ланцюга була VK4 ВЗ послідовністю ембріонального типу з JK2 в якості найбільш близької Jділянки. Перемикання ізотипа здійснювали для одержання IgG2, IgG1, IgG4P і аглікозильованих IgG1 форм гуманізованого антитіла людини. Консенсусний сайт N-зв'язаного глікозилювання видаляли з послідовності константної області IgG1 людини шляхом мутації одного залишка аспарагіна на глутамінову кислоту у положенні 297 (нумерація за Kabat). Гуманізоване антитіло SR-1 у аглікозильованій IgG1 (hSR-1 algG1) формі зв'язується необхідним чином з більш високою аффінністю до мембранного c-Kit, порівняно з розчинним c-Kit, і є високо потужним нейтральним антагоністом SCF і не опосе 95478 44 редковує напряму антагонізм c-Kit у всіх тестах, які базуються на клітинній системі, що перевіряли із застосуванням проксимального і дистального зчитування сігналінга с-Kit. Аглікозильований IgG1 ізотип відбирали, для того, щоб уникнути ефекторну функцію і лізис клітин у наслідок неспецифічних ефектів. Це антитіло проявило несподіваний і бажаний період напіввиведення, нелінійну ФК і насичену опосередковану мішень елімінації у мавп.Воно також об'єднувало популяцію тучних клітин in vivo, як і очікували. Зв'язування з c-Kit димером Активація c-Kit при його зв'язуванні фактором стовбурових клітин (SCF) призводить до димеризації/олігомеризації, аутофосфорилюванню інтерналізації рецептора, найбільш вірогідно, через клатрин-зв'язаний шлях. Моноклональне антитіло SR-1 зв'язує c-Kit димер з у 1000 разів більшею аффіністю порівняно з позаклітинним доменом розчинного c-Kit мономера, що визначається за допомогою Віасоге. Кінетичне моделювання дозволило припустити, що SR-1 буде краще зв'язувати нативний мембранно асоційований рецептор, навіть у присутності нг/мл розчинного шедового мономера рецептора. Вуглеводні, які присутні на глікопротеіні, можуть впливати на біологічні і функціональні властивості. Гуманізація SR-1 до аглікозильованої IgG1 форми показала, що параметри зв'язування були консервативними. Гуманізоване SR-1 algGl зв'язувалось з рекомбінантним c-Kit рецептор-Fc з KinExA Kd рівноважного зв'язування, що дорівнює 1.0пМ і, при застосуванні Віасоге аналізу, hSR-1 algG1 блокувало зв'язування фактора стовбурових клітин (SCF) з Кі=70пМ. hSR-1 algG1 зв'язується із високою аффіністю із димером рецептора, але не з мономером. Ця важлива властивість, перенесення якої неможна передбачити напевно при гуманізації, і, як і розчинний c-Kit мономер, воно менш вірогідно буле виступати в ролі акцептора антитіла in vivo. Інгібування c-Kit-залежної життєздатності клітин і передачі сигналу через рецептор Лінії клітин мегакаріобластів UT-7 людини необхідний для життєздатності SCF, і видалення SCF або його інгібуванння призводить до швидкої втрати життєздатності і зниження проліферації. Цей спосіб аналізу придатний для визначення ІС50 потужності SCF антагоністів. hSR-1 algG1 проявляло у середньому ІС50, що дорівнювало 35 пікомоль. hSR-1 algG1 ефективно інгібувало SCFопосередковане c-Kit фофорилювання і інтерналізацію в МО7е клітинах, вказуючи на те, що зазначене антитіло може блокувати події SCFопосередкованого c-Kit сигналінгу. На протилежність виявленної природної здатності SR-1 опосередковувати інтерналізацію і фосфорилювання cKit, не очікувано, не було виявлено жодних доказів антагонізма hSR-1 algG1 при проксимальному зчитуванні фосфорилювання c-Kit рецептора в МО7е. Варто зауважити, для hSR-1 IgG2, IgG2 антитіло було дещо менш ефективним і не інгібувало повністю SCF-опосередковану інтерналізацію -Kit рецептора. 45 hSR-1 algG1 за концентрації 1.0мкг/мл проявило нейтралізацію синергічної дії SCF на утворення колоній, які походять від ГМ-КСФ культури первинно очищених CD34+, CD117+ (c-Kit) клітин кіскового мозку людини. У відповідності із нашим несподіванним відкриттям, hSR-1 algG1 не опосередковує інтерналізацію або фосфорилювання cKit, і не спостерігалось притаманній hSR-1 algG1 антагоністичної активності виживаємості аж до концентрації 10мкг/мл вказаного антитіла в цьому тесті. Фактично, вказане антитіло було здатно інгібувати виживаємість до більш низьких, ніж основний рівень. Відсутність агрегації тучних клітин, активність CDC і FcR Культивовані тучні клітини людини, одержані із СБ34+клітин кісткового мозку, використовували для оцінки вираженої ефективності і упорядковування сполук. hSR-1 algG1 інгібувало SCF-залежну виживаємість тучних клітин, не передавало сигналу виживаємості тучним клітинам, не опосередковувало фосфорилювання -Kit рецептора (Фігура 3) і не проявляло здатність опосередковувати гомотипічну агрегацію тучних клітин. Навпаки, hSR-1 IgG2 було здатне блокувати SCF-залежну виживаємість тучних клітин, але само по собі проявило часкову антагоністичну активність, передаваючи сигнал виживаємості опосередковувало фосфорування c-Kit рецептора і призводило до відтворюванної дії на кластеризацію тучних клітин. Не спостерігали неочікуваних аномалій при використанні hSR-1 alGg1, коли це антитіло вводили in vivo не людиноподібним мавпам у дозі аж до 30мг/кг один pax на тиждень, протягом 4 тижнів або аж до 150мг/кг підшкірно один раз на тиждень протягом 2 тижнів. hSR-1 algG1 не проявило неспецифічного зв'язування FcR з U-937 клітинами, що були детектовані, які експресували Fey рецептор І = CD64, Fey рецептор II = CD32 і Fey рецептор III = CD 6. Навпаки, зв'язування SR-1 IgG1 і IgG4P ізотопів виявлялося припустимо з високо аффінним FcR1. 95478 46 Таким чином, не була завбачена ADCC активність для hSR-1 algG1, і експериментальні дані на даний момент не проявили комплемент-залежної цитотоксичної смерті клітин. Аглікозильовані химерні IgG1 антитіла миші/людини, як сповіщалось, зберігали деяку ефекторну функцію (Hybridoma. 1991 Apr; 10(2):211-7) і тому ці бажані активності hSR-1 algG1 були несподіваними. Дані показують, що застосування стандартних методик, і таким чином, вибір звичайних IgG2 або IgG1, або IgG4 ізотипів не дав би молекулу з підходящими властивостями, яка була б високо аффінним зв'язувачем, функціонально нейтральним антагоністом c-kit і яке не активувало б тучні клітини. Фармакокінетика Попередні дослідження ФК проводили, чтоб порівняти ФК hSR-1 IgG2 і hSR-1 algG1 у самців яванського макака після одноразового введення внутрішньовенно або підшкірно у кількості 3мг/кг. Тимчасові залежності вказують на нелінійну ФК для обох. Концентрації знижувалися швидше при більш низьких концентраціях. Два антитіла проявили подібний вплив, що вимірювали за С0/Сmах і AUC0-tкон після одноразового внутрішньовенного або підшкірного введення яванським макакам. На підставі AUC0-tкон, виведення з сироватки було приблизно у 7 разів більшими, ніж UT-7 IC50 на 14 день (Таблица 2). До третього тижня, рівні у сироватці були приблизно у 2 рази більшими, ніж UT-7 IC50, і при цьому впливі спостерігали лише часткове інгібування (Фіг.1). На 3 тижні, максимальна ефективність все ще спостерігалась як для 1мг/кг, так і для 3мг/кг груп, де рівні Ctrough у сироватці зберігалися на рівні > у 200 разів, ніж ІС50. Ці дослідження дозволяють припустити, що постійний Ctrough вплив концентрації > у 7 разів, ніж ІС50, схоже є потреба для максимального інгібування тучних клітин, які розмножилися після поранення. Дозування 0.3, 1.0 і 3.0мг/кг hSR-1 algG1 оцінювали базуючись на максимальній ефективності, що показана для SR-1 в цій моделі. При найнижчій дозі, яка тестується (0.3мг/кг), максимальне інгібування індукованнї пораненням експансії тучних клітин спостерігали в межах 2 тижнів. Рівні Ctrough h У сироватці до цього моменту були > у 200 разів, ніж UT-7 IC50 (Таблица 2). Таблиця 2 Просумовані ФД/ФК ефекти SR-1 і hSR-1 alGg1 у ФД моделі поранення 51 Наносили інзиційну рану, після чого проводилася пункційна біопсія аж до 21 дня у людини (зліва) або примата, який не належав до людини (справа) (Фіг.2). Тучні клітини і/ або фібробласти, які експресують SCF виявляли хромогенним фарбником або імуногістохімією, відповідно. У людини, експресія SCF підвищується і повертається на вихідний рівень і після цього наступає тимчасовий підйом кількості тучних клітин під час нормального загоєння рани. Подібна відповідь тучних клітин на поранення спостерігається у мавпи. Під час фіброза і порушеного загоєння ран, експресія SCF і кількість тучних клітин залишається підвищеним (Фіг.2). Гемопоез і меланогенез Генетика мишей показує, що c-Kit відіграє важливу роль у гемопоезі під час ембріонального розвитку, але у гетерозигот людини інактивуючі і/або з втратою функції мутації c-Kit у людей з ідіопатичною дісхромією шкіри ("пєгою шкірою") не були пов'язані з гематологічними аномаліями. SCF і c-Kit важливі для гемопоезу людини, оскільки SCF використовується у комбінації з G-CSF для мобілізації гематопоетичних стовбурових клітин. Більш того, інгибітор безлічі кіназ Глівек™, який націлений переважно на BCR-ABL, рецептор фактора роста тромбоцитів і c-Kit, має як первинний фармакологічний ефект мієлосупресію, і важкі форми анемії і тромбоцитопенії 3-4 ступеня, повідомляли для GIST пацієнтів (Hensley ML, та ін., Semin. Hematol. 2003, Apr; 40(2Suppl2):21-5). Генетика мишей свідчить про те, що c-Kit відіграє роль в мигрувані меланобластів з нервового гребня під час ембріогенеза, і ця роль підтверджена для людини з «пегою шкірою». Були повідомлення, що Глівек™ викликає "смугасту" депігментацію волосся у невеликої кількості GIST пацієнтів, але це було не постійне спостереженя, і про гіперпігментації також були повідомлення. Не можна виключати можливий внесок інших кіназ, таких як ТРФ. Дослідження на мишах з інгібіторами безлічі кіназ і антитілом до с-Kit показало, що інгібування пігментації волосся є цілком зворотнім, дозволяючи припустити, що інгібування c-Kit впливає на функцію меланоцитів, але не впливає на виживаємість в післяпологовому оточенні (Moss и др., 2003). SR-1 застосовували в дослідженнях на визначення діапазону доз від 3 до 30мг/кг, введених раз на тиждень протягом 4 тижнів, щоб визначити вплив, потрібний для інгибування гемопоезу, сперматогенезу і активного меланогенезу. Дослідження на цілісній крові, включаючи розрахунок кількості клітин, виконували на зразках крові, одержаних на вихідному рівні, на день 4, 7, 14, 21 и 28 після початку досліджень. Аналіз свіжовиділених зразків крові виконували в шпиталі імені королеви Єлізавєти, в лабораторії Клінічної гематології, в Барбадосі. Не було виявлено значного внеску SR-1, порівняно з контрольними суб'єктами і вихідними значеннями, в будь-якому з проаналізованих гематологічних параметрів, хоча не спостерігали значного зменшення кількості еритроцитів у тва 95478 52 рин, яких лікували препаратом, через 4 тижні після початку введення доз. За самої високої протестованої дози, 30мг/кг один раз на тиждень протягом 4 тижнів, були досягнуті рівні впливу з ефективністю > у 70,000 разів порівняно з UT-7 IC50. Відсутність значного впливу на гематологічні параметри було підтверджено гістопатологічним аналізом кісткового мозку, якій не продемонстрував різниці між групою, якій призначали препарат і контрольній групам і тим, які не дали об'єднання популяції СБІП-позитивних гематопоетичних стовбурових клітин, що дозволило припустити існуваня потенційних додаткових шляхів гемопоезу у африканської зеленої мавпи, як представника приматів, які не відносяться до людиноподібних мавп.Також досліджували ефект 3-30мг/кг, які вводили один раз на тиждень протягом 4 тижнів, на меланогенез, оскільки його можна застосувати при меланомі. Для оцінки впливу на активовані меланоцити, які можуть краще відобразити стан захворювання, проводили видалення шерсті для активації меланогенезу. Нормальний колір шерсті візуально не змінилися в жодній з груп.Тим не менш, інгибуваня пігментації шкіри до різних ступенів спостерігали у шерсті мавп, що одержували дозу 30мг/кг, яка знову починала рости. Не спостерігали ефекту в групі, яка одержувала 10мг/кг, що дозволило припустити, що неефективна доза знаходиться у діапазоні між 10-30мг/кг. У групі, яка одержувала 10мг/кг, вплив SR-1 був > у 8000 разів, ніж UT-7 IC50. Максимальна ефективність об'єднання тучними клітинами досягалася при > в 7 разів, ніж UT-7 IC50. Ці дані дозволили припустити, що інгибуваня c-Kit впливає на функцію меланоцитів, і що більш високі дози / час впливу можуть бути необхідні для блокування захворювань, які характеризуються надмірною активністю меланоцитів. Сперматогенез Дослідження на мишах показали, що c-Kit важливий для збереження і проліферації диференційованих c-kit рецептор-позитивних сперматогоніїв, але не для початку нового етапу диференціювання сперматогоніальних клітин. Як самці, так і самки «пегих» суб'єктів, які були гетерозіготами по інактивованій алелі c-Kit рецептора, були фертильними, припускаючи, що такий ступінь інактивації cKit, схоже, не впливає на розвиток, сперматогенез або оогенез примордіальних клітин. Антитіло SR-1 показало залежне від дози інгібування сперматогенезу від 0.3-30мг/кг. Доза 0.3мг/кг один раз на тиждень приводила до меншого, ніж максимальний, ефекту, який спостерігався при більш високих дозах, і для визначення ED50 потрібні більш низькі діапазони доз. Впливи, що досягалися були в 7 разів більше, ніж UT-7 IC50, яка відображає вплив, що необхідний для максимальної ефективності у моделі поранення з експансією тучних клітин. Екстраполяція ФК дозволила припустити, що зазначене антитіло можливо може кінцево виводитися через 1 місяць після останньої дози, але період у 9 місяців був обраний за консервативну точку часу для оцінки відновлення. Нормальний сперматогенез виявляли через 9 місяців в усіх тварин, яким вводили 53 дози, що показало, що hSR-1 algG1-подібну молекулу можна застосовувати як контрацептив для самців. Підсумок Гуманізоване анти-c-Kit аглікозильоване IgG1 (hSR-1 algG1) антитіло є високо потужним і специфічним антитілом, яке є нейтралізуючим у всіх тестах, які базуються на клітинній системі, що аналізуються з використанням проксимальної і дистальної оцінки с-Kit сигналінгу. По своїй природі, воно не опосередковує інтерналізацію або фосфорилювання с-Kit рецептора, як повідомляли для батьківського моноклонального SR-1 антитіла миші. Вибір агліколізованного IgG1 ізотипу із ізотипів гуманізованих IgG1, IgG2 і IgG4 не можна було б передбачити базуючись на стандартних підходах. hSR-1 algG1 було відібрано дослідним шляхом через новаторське експериментування. І було показано, що воно проявляло підходящі фармакологічні властивості для мембранного с-Kit рецептора, не мало агоністичної активності по відношенню до c-Kit і тучних клітин, також спостерігали відсутність ефекторної функції і смерті клітин внаслідок неспецифічної дії. Це антитіло проявило добру біодоступність при підшкірному введенні і період напіввиведення, нелінійну ФК і опосередковану мішень елімінації антитіла, яке насичується і об'єднання популяції тучних клітин у мавп.Ці данні вказують на підходящу ефективну для людини дозу об'єднання популяції тучних клітин. 95478 54 Мінімальна ефективна доза батьківського SR1 моноклонального антитіла миші у ФД моделі поранення мавп була у 7 разів, ніж ІС50 для клітин) була також ефективною у об'єднанні тучних клітинх базального шару шкіри, товстої кишки і легенів. Подібним чином, рівні впливу вище, ніж > у 8000 разів, ніж ІС50 для клітин були необхідні перед тим, як спостерігали кількісний вплив на пігментацію шерсті, яка заново починала рости. Інгібування пігментації шерсті у такій, яка починала рости заново, доповідалось для інгібіторів більшості кіназ і антитіл до c-Kit у гризунів, і hSR-1 algG1 може мати застосування у захворюваннях, які пов'язані з надлишковою активністю меланоцитів. Цей ефект є зворотнім при зупиненні лікування. Ефект ничже максимального на інгібування сперматогенезу було показано при рівнях > у 7 разів, ніж ІС50 для клітин, вплив, який надавав максимальну ефективність у ФД моделі поранення. Все, з вище згаданих патентів США, публікації заявок на патент США, заявок на патент США. Іноземних патентів, іноземних заявок на патент і не патентних публікацій, на які посилалися в описі цього винаходу і/або перераховували у переліку даних заявки, повністю включені у теперішню заявку шляхом посилання. Із вже згаданого вище повинно бути очевидним, що, хоча конкретні варіанти реалізації цього винаходу були описані в даній заявці з метою ілюстрації, різні його модифікації можна одержати без відхилення від суті і об'єму цього винаходу. 55 95478 56 57 95478 58 59 95478 60