Бактеріальний препарат “біорем” для деструкції пестициду гексахлорциклогексану у ґрунті

Реферат: Винахід належить до бактеріального препарату для деструкції гексахлорциклогексану у ґрунті, забрудненому вказаним пестицидом, де вказаний препарат створений на основі асоціації мікроорганізмів Pseudomonas putida IMB В-7289, Stenotrophomonas maltophilia IMB В-7288 та Bacillus megaterium IMB В-7287 при їх співвідношенні 1:1:1, де концентрація мікробної біомаси кожної культури становить 0,6 г/мл. UA 102125 C2 (12) UA 102125 C2 UA 102125 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до області агроекології, сільськогосподарської мікробіології та може використовуватися для усунення забруднення ґрунтів ксенобіонтами шляхом їх біологічної деградації. Зокрема, винахід спрямований на одержання препарату на основі мікроорганізмівдеструкторів, які застосовують для біорозкладання пестициду гексахлорциклогексану (ГХЦГ). Відомо, що засоби хімічного захисту рослин (пестициди) - речовини токсичні, проте їх свідомо застосовують для боротьби проти збудників захворювань, шкідників та бур'янів. Більшість їх виявляє мутагенну, канцерогенну, тератогенну та алергенну активності, у зв'язку з чим питання їх трансформації та біодеградації в агроекосистемах є на сьогодні актуальним. Потрапляючи у ґрунт, пестициди змінюються або розкладаються, в основному, в результаті фізико-хімічних та біохімічних процесів, а також внаслідок мікробної деструкції та поглинання вищими рослинами. Гексахлорциклогексан (бензолгексахлорид, гамекан, вермексан та ін.) належить до галогенованих похідних аліциклічних вуглеводнів. ГХЦГ являє собою суміш декількох стереоізомерів, що відрізняються взаємним розміщенням атомів хлору та водню. У чистому вигляді одержано вісім ізомерів цієї речовини, з яких тільки -ізомер (ліндан) має виражені інсектицидні властивості. Його використовували як інсектицид для боротьби із шкідниками зернових культур, садів та лісових насаджень, з паразитами тварин. Ліндан та інші ізомери належать до токсичних сполук шкірнорезорбтивної дії. Сполуки мають виражені кумулятивні властивості, затримуючись в органах та тканинах організму. До 1972 року ГХЦГ широко використовувався у ряді країн. Сьогодні його застосування в Україні та більшості європейських країн заборонене. Проте проблема знешкодження гексахлорциклогексану є актуальною і на сьогоднішній день у зв'язку з його високою стійкістю та негативним впливом на живі організми. Останній проявляється у мутагенній, канцерогенній та алергенній дії як самого ГХЦГ, так і проміжних продуктів його розкладу. Для середньостатистичної людини LD50 ГХЦГ складає для -, -, -ізомерів відповідно 35, 420 та 9 грам. У природних умовах ГХЦГ розкладається повільно. Усі ізомери ГХЦГ повільно гідролізуються водою з відщепленням хлороводню. Оптимальними умовами для біодеструкції ізомерів гексахлорциклогексану є помірний клімат та нейтральне значення рН ґрунтового розчину. Усунення забруднення ґрунтів ГХЦГ може здійснюватися при використанні фізичних та хімічних методів (наприклад, шляхом заміни ґрунту, спалювання, вапнування ґрунту при певних температурах). Зазначені методи вимагають значних матеріальних та енергетичних затрат, а також не завжди є екологічно безпечними. Так, наприклад, під час спалювання має місце частковий викид продуктів термогідролізу, утворення діоксинів та інших токсичних сполук, які є не менш небезпечними, ніж вихідні речовини. Крім того, при здійсненні хімічної дезактивації неминуче постає питання про утилізацію продуктів хімічної реакції. У зв'язку з цим перевага у питанні дезактивації пестицидів, зокрема, гексахлорциклогексану надається біологічним методам, зокрема, таким, що передбачають застосування мікроорганізмів, оскільки останні мінералізують пестициди та інші продукти органічного синтезу у природному циклі кругообігу речовин, не виявляючи негативного впливу на екосистему. Мікроорганізми здійснюють цілий ряд ферментативних реакцій трансформації ксенобіотиків (пестицидів), розкладаючи їх до сполук, які є менш шкідливими або нешкідливими для навколишнього середовища та людини. Є відомим також спосіб розщеплення гексахлорциклогексану та інших поліхлорованих циклічних вуглеводнів при використанні культури мікроорганізмів (DE4212479, публ. 1993). Згідно із запропонованим способом мікроорганізми, які розщеплюють ГХЦГ, піддають культивуванню в аеробних або анаеробних умовах на мінеральному середовищі, що містить вказані циклічні хлорорганічні сполуки як єдине джерело вуглецю, при цьому як вихідний матеріал для одержання таких культур використовують зразки, одержанні із місць, де містяться зазначені речовини, які піддають розщепленню. Вказаний спосіб є багатоетапним та складним для здійснення, оскільки потребує тривалого процесу селективного відбору мікроорганізмів, здатних розкладати поліхлоровані циклічні вуглеводні. Є відомим також спосіб деградації гексахлорциклогексану при використанні штаму Sphingomonas sp., що здатний до біорозкладання -, -, - та -ізомерів ГХЦГ (CN1648238, публ. 2005) протягом короткого періоду часу та з високою ефективністю. Даний винахід вирішує складну проблему аеробного біорозкладання -ГХЦГ та може мінералізувати 5 мг/л -ГХЦГ протягом 12 годин. Проте повна деструкція пестициду однією, навіть активною культурою практично не відбувається, оскільки усі ферменти, які необхідні для деструкції ксенобіотиків, не можуть синтезуватися одним видом мікроорганізмів. Для ефективного розкладу цих сполук було запропоновано мікробні системи із декількох культур, селекціонованих за ознакою стійкості до 1 UA 102125 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пестицидів та здатності до їх деградації, як це і відбувається у природному середовищі, де субстрати трансформуються консорціумами мікроорганізмів. У патенті US5656169 (опубл. 1997) описується процес біологічної деградації токсичних речовин, зокрема, гексахлорциклогексану, у потоці рідини шляхом обробки потоку сумішшю термофільних аеробних бактерій, що містить ефективні кількості Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas mendocina, Alcaligenes denitrificans subspecies (subsp.) xylosoxydans. Винахід також належить до мікробної асоціації для здійснення вказаного способу, що містить зазначені вище бактерії. Проте даний спосіб призначений для проведення процесу детоксикації у промислових умовах шляхом обробки потоку рідини та не може використовуватися для ефективної біодеградації токсичних речовин у ґрунті. Вказаний спосіб є вибраним авторами як прототип способу згідно з винаходом. Задачею запропонованого винаходу є підвищення ефективності біодеградації гексахлорциклогексану у ґрунті, забрудненому вказаним пестицидом. Вирішення поставленої задачі забезпечується шляхом створення бактеріального препарату "Біорем" для деструкції ГХЦГ у ґрунті на основі рідких мікробних культур Pseudomonas putida IMB В-7289, Stenotrophomonas maltophilia IMB В-7288 та Bacillus megaterium IMB В-7287, що складають мікробну асоціацію, при їх співвідношенні 1:1:1, де концентрація мікробної біомаси кожної культури становить 0,6 г/мл. Штами Pseudomonas putida IMB В-7289, Stenotrophomonas maltophilia IMB В-7288 та Bacillus megaterium IMB В-7287, які входять до складу запропонованої асоціації мали здатність до деструкції 4 ізомерів (-, -, - та -ізомерів) гексахлорциклогексану. При цьому асоціація зазначених мікроорганізмів характеризувалася більш високою ефективністю деградації -, - та -ізомерів ГХЦГ у порівнянні з кожною культурою, узятою окремо. Таким чином, запропонований бактеріальний препарат на основі асоціації мікроорганізмів-деструкторів ГХЦГ продемонстрував синергетичний ефект стосовно ізомерів гексахлоргексану, що приводило до підвищення ефективності біорозкладання ГХЦГ у ґрунті. Для одержання вказаної асоціації культивували культури Pseudomonas putida, Stenotrophomonas maltophilia та Bacillus megaterium на рідкому модифікованому середовищі Мєнкіної з робочим об'ємом 100 мл. Як інокуляти використовували їх рідкі накопичувальні культури у кількості 10 % від об'єму середовища. Культивування здійснювали при 240 об/хв. та 28°С 10 діб. Концентрацію біомаси визначали за оптичною густиною (ОГ) мікробної суспензії на фотоелектрокалориметрі із використанням калібрувальних кривих. Усі культури-деструктори, які входять до складу мікробної асоціації, культивували до 1,3 одиниць оптичної густини, що відповідає концентрації біомаси клітин у культуральній рідині 0,6 г/л. Після культивування культуральні рідини об'єднували у співвідношенні 1:1:1. Зокрема, до 100 мл середовища культивування Bacillus megaterium IMB В-7287 з концентрацією клітин додавали 100 мл середовища культивування Stenotrophomonas maltophilia IMB В-7288 та 100 мл середовища культивування Pseudomonas putida IMB В-7289. Одержана змішана суспензія мікробних клітин являла собою мікробний препарат "Біорем" згідно з винаходом, який використовували для біологічної деструкції гексахлорциклогексану у ґрунті. Зберігання культур проводили на МПА. МПА - м'ясо-пептонний агар (для органотрофів, амоніфікаторів): водний м'ясний екстракт 1 л; пептон - 10; NaCl - 0,5; агар - 15-20; рН 7,2. Успішне культивування мікроорганізмів-деструкторів можливе на штучних поживних середовищах з використанням природних компонентів - м'ясного екстракту, сусла, желатини, казеїну, альбуміну, дріжджового екстракту, триптону, а також на поживному агарі Діфко. Динаміку розпаду ізомерів ГХЦГ мікроорганізмами-деструкторами вивчали на модифікованому середовищі Мєнкіної: розчин А - NaNO3 - 2,0; КСl - 0,5 (стерилізували за 1 атм); розчин Б - 10 %-й розчин MgSO4 і розчин В - 50 %-й розчин глюкози; Г - 20 %-й розчин К2НРО4 (стерилізація за 0,5 атм). Перед роботою до 100 мл розчину А додавали 0,5 мл розчину Б і 1 мл розчину В, а також 1 мл розчину Г; рН 6,8-7,0. Штами мікроорганізмів-деструкторів, що входять до складу запропонованого бактеріального препарату "Біорем" для деструкції гексахлорциклогексану, характеризуються наступними культурально-морфологічними та фізіолого-біохімічними характеристиками. Штами Pseudomonas putida IMB В-7289 являє собою рухливі неспороутворюючі грамнегативними палички з закругленими кінцями, розміром 0,5×2,0 мкм. Характеризується наявністю флуоресціюючого пігменту та ферменту оксидази, має активність аргініндегідролази. Йому не притаманна здатність до зброджування D-глюкози та гідролізу желатину, характеризується відсутність -галактозидази та -глюкозидази, уреазної активності, не є здатним до утворення індолу. Джерелами вуглецю для вказаного штаму можуть служити Dглюкоза, L-арабіноза, D-маноза, глюконова кислота, капринова кислота, яблучна та лимонна 2 UA 102125 C2 5 10 15 20 25 30 35 кислота. Не засвоює D-маніт, N-ацетилглюкозамін, D-мальтозу, адипінову кислоту, фенілоцтову кислоту. Штам S. maltophilia IMB В-7288 являє собою рухливі неспороутворюючі грамнегативними палички з закругленими кінцями, розміром 0,5×2,0 мкм. Характеризується наявністю галактозидази та -глюкозидази, а також уреазної активності. Не зброджує D-глюкозу, але гідролізує желатин. Активності аргініндегідролази не виявлено, нездатний до утворення індолу, редукує нітрати до нітритів. Характеризується відсутністю оксидазної активності. Джерелами вуглецю для вказаного штаму можуть служити D-маноза, N-ацетилглюкозамін, D-мальтоза, яблучна та лимонна кислота. Не використовує як джерело вуглецю D-глюкозу, L-арабінозу, Dманіт, глюконову кислоту, капринову кислоту, адипінову кислоту, фенілоцтову кислоту. Штам Bacillus megaterium IMB В-7287 являє собою рухливі неспороутворюючі грамнегативні палички з закругленими кінцями, розміром 0,5×2,0 мкм. Споживає як джерело вуглецю моносахариди (глюкозу, фруктозу, галактозу, манозу, арабінозу, ксилозу), дисахариди (сахарозу, мальтозу, лактозу), трисахариди (рафінозу), спирти (маніт, гліцерин, етиловий спирт), органічні кислоти (молочну, лимонну). Найкраще із перерахованих цукрів засвоюється глюкоза і сахароза. Переважним джерелом азоту для Bacillus megaterium IMB В-7287 є гідролізат казеїну, пептон, сечовина, а також мінеральні форми - амонійний і нітратний азот. Джерелом фосфору можуть бути як мінеральні солі, так і важкорозчинні фосфорорганічні сполуки. Креслення ілюструє динаміку вмісту -, -, -ГХЦГ у ґрунті при ремедіації препаратом на основі асоціації мікроорганізмів-деструкторів згідно з винаходом. Винахід ілюструється наведеними нижче прикладами здійснення винаходу. Приклад 1. Культивували досліджувані культури на рідкому модифікованому середовищі Мєнкіної з робочим об'ємом 100 мл. Як інокуляти використовували їх рідкі накопичувальні культури в кількості 10 % від об'єму середовища. Культивували при 240 об./хв. і 28°С 10 діб. Концентрацію біомаси визначали за оптичною густиною (ОГ) мікробної суспензії на фотоелектрокалориметрі із використанням калібрувальних кривих. Усі культури-деструктори, які входять до складу мікробної асоціації культивували до 1,3 одиниць оптичної густини, що відповідає концентрації біомаси клітин у культуральній рідині 0,6 г/л. Після культивування культуральні рідини об'єднували у співвідношенні 1:1:1. У середовище додавали препарат гексахлорану у кількості 20 мкг/мл (2 РД) із вмістом діючої речовини - 7 % суміші ізомерів гексахлорциклогексану (ГХЦГ) та визначали залишкові кількості ізомерів ГХЦГ в культуральній рідині в результаті деструкції їх асоціацією мікроорганізмів-деструкторів. Паралельно у досліді визначали залишкові кількості ізомерів гексахлорциклогексану при використанні культуральної рідини кожного із штамів, що входять до складу асоціації. Дані представлені у Таблиці 1. Таблиця 1 Залишкові кількості ізомерів ГХЦГ в культуральній рідині в результаті деструкції їх мікроорганізмами-деструкторами Варіант досліду Pseudomonas putida IMB В7289 Stenotrophomonas maltophilia IMB В-7288 В. megaterium IMB В-7289 Асоціація трьох культур Контроль з ГХЦГ, без мікроорганізмів 40 45 Вміст ізомеру ГХЦГ, мг/л -гхцг -ГХЦГ, (ліндан) -ГХЦГ -ГХЦГ 0,609 0,183 0,252 0,103 0,726 не визначали не визначали 0,121 0,492 0,786 0,0659 0,180 0,144 0,261 0,063 0,203 1,976 0,341 0,774 0,475 Отримані дані свідчать, що усі виділені культури виявили здатність до деструкції ізомерів ГХЦГ. Найвищу активність розкладу усіх чотирьох ізомерів спостерігали у В. megaterium IMB В7287: -ізомер культура розкладала на 75,1 %, -ізомер - на 63,4 %, -ізомер - на 80,6 %, ізомер на 86,7 %. Штам Pseudomonas putida IMB В-7289 найкраще розкладав -ГХЦГ - на 69,2 %, -ізомер ГХЦГ - на 46,3 % -ізомер ГХЦГ (ліндан) - на 67,4 %, -ГХЦГ - на 78,3 %. Асоціація культур ефективно розкладала -ізомер ГХЦГ на 47,2 %, -ГХЦГ - на 66,2 %. Stenotrophomonas maltophilia IMB В-7288 розкладає ізомери ГХЦГ на 31,9-63,3 %. Було також виявлено 3 UA 102125 C2 5 10 15 20 синергетичний ефект щодо розкладання ізомерів ГХЦГ при використанні асоціації заявлених штамів, які утворюють запропонований згідно з винаходом бактеріальний препарат "Біорем". Приклад 2. Одержання запропонованого бактеріального препарату здійснювали так, як описано у Прикладі 1. Після цього одержаний бактеріальний препарат вносили у місця локального 2 забруднення пестицидом ГХЦГ з розрахунку 1-3 л на 1 м , в залежності від ступеня забрудненості території. Через 10 днів після внесення бактеріальних суспензій відбирали зразки ґрунту для аналізу залишкових кількостей пестициду ГХЦГ методом, рекомендованим ЕРА (Environmental Protection Agency) [Test Methods for Evaluating Solid Waste, Physical/Chemical Methods, 3rd Edition, U.S. EPA, Washington, DC, 1990. EPA Method 8120 A. - Rev. 1. - Nov. - 1990. - 456 p.]. Дані представлені на кресленні. Одержані результати щодо концентрацій ізомерів ГХЦГ у ґрунті в динаміці експерименту показали стабільне зниження вмісту усіх ізомерів як у контролі, так і у ґрунті із застосуванням запропонованого бактеріального препарату "Біорем". У забрудненому ґрунті без застосування ремедіації на 40-у добу експерименту вміст -ГХЦГ був у 2 рази меншим за вихідний, а при застосуванні бактеріального препарату згідно з винаходом вміст -ізомеру зменшувався у 5,5 разів. Концентрація -ГХЦГ у контрольному варіанті на 40-у добу експерименту зменшувалася в 1,8 рази, а при використанні запропонованого бактеріального препарату "Біорем" - у 2,7 рази. Найбільш стійким був -ГХЦГ: у контролі без ремедіації його кількість зменшувалася лише в 1,3 рази, а при застосуванні запропонованого бактеріального препарату - у 2,1 рази. Активність процесу ремедіації в експерименті характеризували показником швидкості деструкції. Дані стосовно швидкості деструкції ізомерів ГХЦГ приведені у Таблиці 2. Таблиця 2. Швидкість деструкції ГХЦГ запропонованим бактеріальним препаратом "Біорем" на різних етапах ремедіації Варіант Контроль без додання мікроорганізмів Ремедіація при використанні запропонованого бактеріального препарату "Біорем" -ГХЦГ -ГХЦГ -ГХЦГ -ГХЦГ -ГХЦГ Вихідний вміст, мкг/кг 447 360 850 447 360 -ГХЦГ 850 Пестицид Швидкість деструкції, мкг/добу 20 діб 40 діб -3 -3 6,6·10 3,2·10 -3 -3 4,7·10 3,5·10 -3 -3 6,0·10 3,0·10 -3 -3 16·10 2,2·10 -3 -3 20·10 9,3·10 5,0·10 -3 -3 1,8·10 25 30 35 40 Як видно з приведеної таблиці, швидкість деструкції -ізомеру ГХЦГ наприкінці першого етапу ремедіації при використанні препарату згідно з винаходом перевищувала швидкість у контролі у 3,6 рази, а до кінця досліду знижувалась і була втричі меншою, ніж у контролі. Швидкість деструкції -ГХЦГ при застосуванні асоціації мікроорганізмів у перші 20 діб експерименту мало відрізнялась від показника контролю без ремедіації, але до кінця періоду -3 спостереження вона перевищувала його у 2,7 рази і становила 9,3·10 мг/добу. Розкладання ГХЦГ інтенсивніше відбувалося на другому етапі досліду: швидкість деструкції при використанні запропонованого препарату перевищувала швидкість ремедіації у контролі у 6 разів, що у 3,6 рази перевищувало швидкість деструкції на першому етапі експерименту - на 20 добу досліду. Дані приведені у Таблиці 2. Таким чином, проведені експерименти свідчать про високу ефективність запропонованого бактеріального препарату "Біорем" на основі асоціації мікроорганізмів-деструкторів для усунення забруднення ґрунтів пестицидом гексахлорциклогексаном. Заявлений бактеріальний препарат може ефективно використовуватися для ремедіації забруднених територій шляхом біологічної деградації вказаного пестициду. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 45 1. Бактеріальний препарат для деструкції гексахлорциклогексану у ґрунті на основі культуральної рідини мікроорганізмів-деструкторів, який відрізняється тим, що як 4 UA 102125 C2 5 мікроорганізми-деструктори він містить Pseudomonas putida IMB В-7289, Stenotrophomonas maltophilia IMB В-7288 та Bacillus megaterium IMB В-7287 при їх співвідношенні 1:1:1, де концентрація мікробної біомаси кожної культури становить 0,6 г/мл. 2. Штам Pseudomonas putida IMB В-7289 для одержання бактеріального препарату для деструкції гексахлорциклогексану у ґрунті згідно з пунктом 1. 3. Штам Stenotrophomonas maltophilia IMB В-7288 для одержання бактеріального препарату для деструкції гексахлорциклогексану у ґрунті згідно з пунктом 1. 4. Штам Bacillus megaterium IMB В-7287 для одержання бактеріального препарату для деструкції гексахлорциклогексану у ґрунті згідно з пунктом 1. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5