Спосіб експериментального відтворення основних патогенетичних ланок цукрового діабету 2 типу

Реферат: Спосіб експериментального відтворення основних патогенетичних ланок цукрового діабету 2 типу у щурів шляхом впливу комбінованої дієти та хімічного агента. Статевозрілих самців-щурів лінії Вістар утримують на високожировому раціоні харчування у сполученні з надмірним споживанням вуглеводів протягом 90 діб, починаючи з 91 доби, протягом 5 діб роблять внутрішньочеревні ін'єкції розчину дексаметазону у дозі 1,0 мг/кг маси тіла один раз на добу. UA 102997 U (12) UA 102997 U UA 102997 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до області біології, експериментальної ендокринології та фармакології і може бути використана, як для вивчення патофізіологічних механізмів розвитку цукрового діабету 2 типу та його ускладнень, так і для оцінки біологічних ефектів нових лікарських засобів для їх корекції. В останні десятиріччя спостерігається явна тенденція до стрімкого зростання в світі захворюваності на цукровий діабет (ЦД), більшість випадків якої складають хворі на ЦД 2 типу (90-95 % діабетичного загалу). За даними Міжнародної діабетичної федерації (IDF) натепер загальна кількість осіб, що страждають на ЦД 2 типу складає більш ніж 350 млн. осіб, а до 2035 року їх кількість наблизиться до 600 млн. осіб [1]. Серед Європейських країн розповсюдженість ЦД в загальній популяції складає 4-6 % [2]. ЦД 2 типу являє собою складне полігенне захворювання, патогенетичне підґрунтя якого складають головним чином інсулінорезистентність та дисфункція бета-клітин підшлункової залози [3]. Загальновизнано, що в патогенезі цукрового діабету приймають участь дві групи факторів: внутрішні (генетичні), які обумовлюють схильність до розвитку цукрового діабету, та зовнішні, що реалізують цю спадкову схильність. Згідно з сучасними уявленнями, усі фактори, що діють протягом чутливих (сенситивних) для організму етапів розвитку, здатні викликати епігенетичні модифікації геному та посилювати адаптацію організму до змін умов довкілля. До таких факторів належать: повноцінність живлення, материнський стрес, зміна фізичних, хімічних і біологічних параметрів середовища [4, 5]. При цьому вони відіграють важливу роль не тільки під час ембріонального розвитку організму, але й здатні індукувати зміни у постнатальному онтогенезі під впливом сигналів середовища [6]. Інтегрований вплив зовнішніх і внутрішньо популяційних факторів відбивається на фізичному статусі організму. Більш того, вважають, що деякі з них, а саме материнські ефекти, мають переваги перед генетично визначеними, оскільки дозволяють здійснювати швидкі фенотипові перебудови під час змін умов існування. При цьому чим раніше відбудеться їх вплив в онтогенезі, тим сильнішим буде вплив на остаточний фенотип [7]. До зовнішніх факторів, що впливають на реалізацію спадкової схильності до ЦД 2 типу відносять так званий західний спосіб життя, а саме споживання їжі з надмірним вмістом жирів та вуглеводів, куріння та недостатність фізичних навантажень [2]. Зважаючи на багатокомпонентність ЦД 2 типу, достатньо складним завданням для дослідників є створення таких експериментальних моделей, які б максимально наближено відтворювали всі ключові ланки патогенезу ЦД 2 типу у людини - інсулінорезистентність, гіперабо гіпоінсулінемію, гіперглікемію, дисліпідемію та ін. Задля вивчення механізмів виникнення та розвитку ЦД 2 типу та його ускладнень або оцінки ефективності фармакологічних засобів для їх корекції, використовують окремі типи моделей даного захворювання (спонтанний або генетично детермінований діабет; індукований дієтою - хронічним пероральним введенням фруктози, сахарози, жиру або глюкозаміну у різних комбінаціях; індукований хімічними сполуками введенням алоксану, дитизону, глюкокортикоїдів та стрептозотоцину; індукований частковою панкреатектомією; трансгенні або нокаутні за конкретними генами тварини [8]) або їх комбінації [9]. Найбільш наближеними до патогенезу та метаболічних зсувів, притаманних ЦД 2 типу, у людини є наступні моделі: - вживання протягом 2 тижнів високожирової дієти (40 % загального калоража за рахунок жирів) з наступною внутрішньовенною ін'єкцією стрептозотоцину (40 мг/кг маси тіла) 7-тижневим щурам-самцям лінії Sprague-Dawley [10]. - утримання статевозрілих самців-щурів лінії Вістар на високожировій дієті (40 % загального калоражу за рахунок насичених жирів) протягом чотирьох тижнів, з наступною внутрішньочеревною ін'єкцією розчину стрептозотоцину в дозі 40 мг/кг маси тіла [11]. Але, зважаючи на відсутність тварин лінії Sprague-Dawley в розплідниках науково-дослідних та господарчих установ України та високу вартість стрептозотоцину, використання вищезазначених моделей є проблематичним. За прототип вибрана експериментальна модель ЦД 2 типу, яка включає утримання статевозрілих самців-щурів лінії Вістар на високожировій дієті (50 % загального калоражу за рахунок насичених жирів) протягом 35 діб, з наступними, протягом 11 діб, внутрішньочеревними ін'єкціями розчину дексаметазону у дозі 1 мг/кг маси тіла [12]. Необхідність модифікації зазначеної моделі обумовлена доцільністю зменшення кількості інвазивних втручань в організм піддослідної тварини. Задача корисної моделі - розробка оптимізованого способу моделювання основних патогенетичних ланок цукрового діабету 2 типу у щурів. Поставлена задача вирішується тим, що статевозрілих (6-місячних) самців-щурів лінії Вістар утримують на комбінованій дієті - сполучення високожирового раціону харчування та надмірного 1 UA 102997 U 5 10 15 20 25 30 35 40 споживання вуглеводів протягом 90 діб. Починаючи з 91 доби, протягом 5 діб роблять внутрішньочеревні ін'єкції розчину дексаметазону у дозі 1,0 мг/кг маси тіла один раз на добу. Технічний результат - розширення арсеналу експериментальних моделей для відтворення провідних патогенетичних ланок цукрового діабету 2 типу. Спосіб апробовано на 6 статевозрілих (6-місячних) самцях-щурах лінії Вістар. Моделювання проводили шляхом внутрішньочеревного введення дексаметазону (фірма "KRKA", Словенія) в дозі 1,0 мг/кг маси тіла протягом 5 днів після 90-добового утримання тварин на комбінованій дієті, яка являє собою сполучення високожирового раціону харчування (дієта з надмірним вмістом насичених жирів: білки - 20,0 %, жири - 60,0 %, вуглеводи - 20,0 % від загального калоражу з доданням жовчних кислот у кількості 1 % від маси корму) та надмірного споживання вуглеводів (вільний доступ до розчину фруктози в концентрації 200 г/л) [13, 14], з природною зміною режиму освітлення, температура та вологість повітря - за стандартами віварію. Контрольна група тварин відповідної статі та віку споживала стандартне харчування (білки 15,0 %, жири - 5,0 %, вуглеводи - 80,0 % від загального калоражу), мала вільний доступ до води та утримувалася в аналогічних умовах [15]. Всі визначення показників проводили на початку експерименту, на 95 (для підтвердження відтворення моделі) та на 110 (для оцінки збереження параметрів даної моделі) добу експерименту. Стан глюкозного гомеостазу та чутливості до інсуліну оцінювали за показниками глікемії під час проведення внутрішньочеревного тесту толерантності до глюкози (ВЧТТГ) (3 г/кг маси тіла; 0, 30, 60 та 120 хв) та тесту толерантності до інсуліну (ТТІ) (0,2 Од/кг маси тіла; 0, 15, 30 та 60 хв) [16, 17]. Площину під глікемічними кривими (ПГК) при проведенні вищезгаданих тестів розраховували за допомогою комп'ютерної програми "Mathlab". Коефіцієнт чутливості до інсуліну розраховували за даними ТТІ [17]. Крім цього у щурів було визначено артеріальний тиск за допомогою апарату для неінвазивного вимірювання кров'яного тиску LE5002, Panlab, Harvard Apparatus, Іспанія) та вагу фракцій жирової тканини, а саме епідидимального жиру, мезентерального, ретроперитонеального та загального абдомінального. Протягом експерименту оцінювали динаміку ваги тварин. Ліпідний обмін досліджували за показниками концентрації вільних жирних кислот (ВЖК) в сироватці крові фотоколориметрично [18], за рівнями тригліцеридів (ТГ), загального холестерину та холестерину ліпопротеїнів високої щільності (ХС ЛПВЩ), визначеними ферментативними методами за допомогою комерційних наборів (DAC-SpectroMed, Молдова). Концентрацію холестерину ліпопротеїнів низької щільності (ХС ЛПНЩ) у сироватці крові розрахували за допомогою формули Фрідевальда [19]. Отриманий цифровий матеріал проаналізовано методами варіаційної статистики із застосуванням параметричних та непараметричних критеріїв. Для перевірки нормальності розподілу у вибірках менше 30 дат використовували тест Шапіро-Уїлка [20]. Для оцінки різниці арифметичних середніх був використаний парний та непарний t - критерій Стьюдента. Перевірку нульових гіпотез проведено з використанням t критерію [21] на рівні значущості Р < 0,05. В результаті проведеного дослідження встановлено, що на 95 та 110 добу від початку моделювання ЦД 2 типу у тварин експериментальної групи ("Діабет") спостерігалось істотне підвищення базальної глікемії та показників площі під відповідними глікемічними кривими під час ВЧТТГ відносно контрольної групи, що підтверджує наявність глюкозної інтолерантності (табл. 1). Таблиця 1 Показники глюкозного гомеостазу у щурів з цукровим діабетом 2 типу, Група тварин Інтактний контроль Діабет x  S x  Показники глюкозного гомеостазу на … добу дослідження 0 95 110 n Базальна Базальна ПГК, Базальна ПГК, глікемія, ммоль/л глікемія ммоль/л ммоль/л/хв глікемія ммоль/л ммоль/л/хв 7 4,30±0,09 4,06±0,13 619,1±19,1 4,21±0,12 623,4±20,2 6 4,25±0,11 8,67±0,32* 1624,3138,8* 8,85±0,23* 1630,0±55,7* * - Статистична значимість відмінностей порівняно з групою "Інтактний контроль", Р < 0,001. 45 При проведенні ТТІ із визначенням відсотка зниження глікемії відносно її базального рівня та розрахунком ПГК було виявлено, що діабетичні тварини, характеризуються наявністю 2 UA 102997 U виразної інсулінової резистентності, оскільки була практично відсутньою реакція на екзогенно введений інсулін, а показник ПГК протягом інсулінового тесту у три рази перевищував верифікований для інтактних тварин (табл. 2). Таблиця 2 Показники під час проведення ТТІ у щурів з цукровим діабетом 2 типу, Група тварин n Базальна глікемія, ммоль/л Інтактний контроль Діабет 7 6 4,16±0,13 8,97±0,22* x  S x  Відсоток зниження глікемії після ПГК, введення інсуліну через … хв ммоль/л/хв 15 30 60 36,65±5,11 43,53±3,31 38,33±2,20 162,9±9,9 10,96±4,14* 11,33±3,21* 9,64±3,20* 487,6±10,9* * - Статистична значимість відмінностей порівняно з групою "Інтактний контроль", Р < 0,001. 5 Оскільки відтворена модель ЦЦ 2 типу ґрунтується на використанні високовуглеводної та високожирової дієти, то поряд з розвитком інсулінорезистентності вона призводить до значного підвищення маси тіла тварин та ожиріння (табл. 3). Таблиця 3 Динаміка маси тіла щурів з цукровим діабетом 2 типу, Група тварин n Інтактний контроль Діабет # 7 6 0 166,9±2,1 167,8±1,5 x  S x  Маса на … добу дослідження, г 95 110 # # 246,1±4,4 251,1±3,7 # # 363,7±4,8* 393,3±5,9* * - Статистична значимість відмінностей порівняно з групою "Інтактний контроль", Р < 0,05; - Статистична значимість відмінностей відносно початкового рівня, Р < 0,05. 10 15 З метою визначення впливу моделювання діабету на комплексні параметри, які характеризують ожиріння, було оцінено вагу проатерогенних складових жирової тканини, а саме абдомінального жиру взагалі та за окремими фракціям. Так, в групі "Діабет" збільшення маси тіла супроводжувалося суттєвим (в два-три рази) підвищенням усіх досліджених фракцій жирової тканини, а саме епідидимального, мезентерального, ретроперитонеального та загального абдомінального жиру (табл. 4). Таблиця 4 Вага фракцій жирової тканини у щурів з цукровим діабетом типу, x  S x  Вага жирової тканини, г Група тварин n епідидимальна Інтактний контроль Діабет 7 6 4,16±0,32 12,85±1,31* мезентеральна ретроперитонеальна 2,51±0,30 8,89±0,74* 4,50±0,39 13,31±1,27* загальна абдомінальна 11,16±0,75 35,05±2,12* * - Статистична значимість відмінностей порівняно з групою "Інтактний контроль", Р < 0,001. 20 25 При дослідженні показників ліпідного обміну у щурів з експериментальним цукровим діабетом 2 типу встановлено, що 5-добове введення дексаметазону щурам після утримання на високовуглеводному та високожировому раціоні харчування призводило до порушення ліпідного гомеостазу. Так, у групі "Діабет" спостерігалось вірогідне підвищення рівнів ТГ, загального холестерину, ХС ЛПНЩ та ВЖК, а також виразне зниження рівня ХС ЛПВЩ в сироватці крові відносно групи "Інтактний контроль" (табл. 5). Наявність вищезазначених порушень ліпідного гомеостазу у тварин даної експериментальної групи є однією з ознак діабетичної дисліпідемії, а 3 UA 102997 U у поєднанні з виявленими порушеннями глюкозного гомеостазу та чутливості до інсуліну свідчить про розвиток ЦД 2 типу. Таблиця 5 Показники ліпідного обміну у щурів з цукровим діабетом 2 типу, x  S x  Група тварин Показник ВЖК, ммоль/л ТГ, ммоль/л Загальний холестерин, ммоль/л ХС ЛПВЩ, ммоль/л ХС ЛПНЩ, ммоль/л Інтактний контроль 0,42±0,02 0,33±0,04 1,41±0,13 0,58±0,05 0,76±0,09 Діабет 1,92±0,21* 1,16±0,26* 2,86±0,60* 0,37±0,04* 2,23±0,62* * - Статистична значимість відмінностей порівняно з групою "Інтактний контроль", Р < 0,05. 5 Оскільки ЦД 2 типу є захворюванням, яке супроводжується передчасним атерогенезом та, з плином часу, гіпертонічною хворобою [22], нами було оцінено показники артеріального тиску у експериментальних тварин. Визначено, що розроблена модель ЦД 2 типу призводила до вірогідного підвищення як систолічного, так і діастолічного артеріального тиску у піддослідних щурів (табл. 6). 10 Таблиця 6 Характеристика артеріального тиску у щурів з цукровим діабетом 2 типу, Група тварин Інтактний контроль Діабет n 7 6 Систолічний тиск, кПа 18,42±0,41 26,88±1,13* x  S x  Діастолічний тиск, кПа 14,17±0,45 21,25±0,40* * - Статистична значимість відмінностей порівняно з групою "Інтактний контроль", Р < 0,05. 15 20 25 30 35 Таким чином, у тварин експериментальної груписпостерігались ключові складові, притаманні ЦД 2 типу, а саме базальна гіперглікемія, глюкозна інтолерантність, інсулінорезистентність та дисліпідемія, що свідчить про адекватність запропонованого способу експериментального відтворення основних патогенетичних ланок вищезазначеного захворювання. Проведені дослідження доводять наявність у розробленої моделі провідних патогенетичних ланок цукрового діабету 2 типу, що в поєднанні з порушеннями ліпідного обміну, наявності ожиріння та гіпертензії у експериментальних тварин обґрунтовує перспективність її застосування в дослідженнях ефективності нових лікарських засобів, спрямованих на корекцію метаболічного синдрому, цукрового діабету 2 типу та їх ускладнень у людини. Джерела інформації: 1. International Diabetes Federation. Diabetes Atlas, 5th edition, Brussels, Belgium: International Diabetes Federation, 2011. 2. Тронько, M.Д. Пріоритетні проблеми клінічної ендокринології в Україні на сучасному етапі [Текст] / М.Д. Тронько // Здоров'я України. - 2012. - № 2-3 (18-19). - С. 10-11. 3. Cheng, D. Prevalens, predisposition and prevention of type 2 diabetes [Text] / D. Cheng // Nutr. Metab. - 2005. - Vol. 18. - P. 2-29. 4. Weaver, I. Epigenetic effects of glucocorticoids [Text] / I. Weaver // Semin. Fetal. Neonatal. Med. - 2009. - Vol. 14(3). - P. 143-150. 5. Zwiller, J. Epigenetics and drug addiction: a focus on MeCP2 and on histone acetylation [Text] / J. Zwiller // Med. Sci. - 2015. - Vol. 31 (4). - P. 439-446. 6. Васильев, А. Эпигенетические перестройки популяций как вероятный механизм наступления биоценотического кризиса [Текст] / А. Васильев, И. Васильева // Вестник Нижегородского ун-та. Серия « Биология ». - 2005. - № 1. - С. 27-38. 4 UA 102997 U 5 10 15 20 25 30 35 40 7. Khaire, A.A. Maternal omega-3 fatty acids and micronutrients modulate fetal lipid metabolism: A review [Text] / A.A. Khaire, A.A. Kale, S.R. Joshi // Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. - 2015. - Vol. 15. - P. 1-29. 8. Srinivasan, K. Animal models in type 2 diabetes research: An overview [Text] / K. Srinivasan, P. Ramarao // Indian J Med Res. - 2007. - Vol. 125, № 3. - P. 451-472. 9. Buettner, R. High-fat diets: modeling the metabolic disorders of human obesity in rodents [Text] // R. Buettner, J. Scholmerich, L. Bollheimer // Obesity. - 2007. - Vol. 15. - P. 798-808. 10. A new rat model of type 2 diabetes: the fat-fed, streptozotocin-treated rat [Text] / M.J. Reed, K. Meszaros, L.J. Entes [et al.] // Metabolism. - 2000. - Vol. 49, № 11. - P. 1390-1394. 11. Гладких, А.И. Экспериментальные подходы к изучению сахарного диабета 2 типа (обзор литературы и собственные результаты) [Текст] / А.И. Гладких // Пробл. ендокрин. патології. 2008. - № 4. - С. 99-106. 12. Пат. 53262 UA, МПК (2009) G07B 23/00. Спосіб комбінованого моделювання цукрового діабету 2 типу у щурів [Текст] / О.І. Гладких, Ж.А. Лещенко, В.В. Полторак [та ін.] (UA); заявник і патентовласник Державна установа "Інститут проблем ендокринної патології ім. В. Я. Данилевського АМН України" (UA). - № U201005316; заявл. 30.04.10; опубл. 27.09.10, Бюл. № 18. - 4 с. 13. Inder, W.J. Evience for transcript-specific epigenetic regulation of glucocorticoid-stimulated skeletal muscle 11β-hydroxysteroid dehydrogenase-1 activity in type 2 diabetes [Text] / W.J. Inder, V.R. Obeyesekere, С. Jang, R. Saffery // Clin. Epigenetics. - 2012. - Vol. 4. - P. 24. 14. Jurgoński, A.A high-fat diet differentially affects the gut metabolism and blood lipids of rats depending on the type of dietary fat and carbohydrate [Text] / A. Jurgoński, J. Juśkiewicz, Z. Zduńczyk // Nutrients. - 2014. - Vol. 6, № 2. - P. 616-626. 15. Лабораторные животные [Текст] / И.П. Западнюк, В.И. Западнюк, Е.А. Захария [и др.]. К.: Вища школа, 1983. - 383 с. 16. Полторак, В.В. Методичні рекомендації з експериментального вивчення нових гіпоглікемічних засобів [Текст] / В.В. Полторак, Н.І. Горбенко // Доклінічні дослідження лікарських засобів / за ред. О.В. Стефанова. - К.: Авіцена, 2001. - С. 396-408. 17. The short insulin tolerance test for determination of insulin sensitivity: a comparison with euglycaemic clamp [Text] / A. Akinmokun, P. Selby, K. Ra-maiya [et al] // Diabet. Med. - 1992. - Vol. 9, № 5. - P. 432-437. 18. Dumcombe, W.C. The colorimetric micro-determination of long-chain fatty acids [Text] / W.С. Dumcombe // Biochem. J. - 1963. - Vol. 188, № 1. - P. 7-10. 19. Friedewald, W.T. [Text] / W.T. Friedewald, R.I. Levy, D.S. Frederickson // Clin. Chem. - 1972. Vol. 18. - P. 499. 20. Royston, J. An extension of Shapiro and Wilk's W test for normality to large samples [Text] / J.P. Royston // Applied Statistic. - 1992. - Vol. 31. - P. 115-124. 21. Атраментова, Л. Статистичні методи в біології [Текст]: підручник / Л. Атраментова, О. Утєвська. - X.: ХНУ ім. В.Н. Каразіна, 2007. - 288 с. 22. Reaven, G. Insulin resistance, hypertension, and coronary heart disease [Text] / G. Reaven // J. Clin. Hypertens. - 2003. - Vol. 5. - P. 269-274. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 50 Спосіб експериментального відтворення основних патогенетичних ланок цукрового діабету 2 типу у щурів шляхом впливу комбінованої дієти та хімічного агента, який відрізняється тим, що статевозрілих самців-щурів лінії Вістар утримують на високожировому раціоні харчування у сполученні з надмірним споживанням вуглеводів протягом 90 діб, починаючи з 91 доби, протягом 5 діб роблять внутрішньочеревні ін'єкції розчину дексаметазону у дозі 1,0 мг/кг маси тіла один раз на добу. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5