Спосіб оцінки ефективності корекції порушень кровообігу в ішемізованій нирці

Реферат: Спосіб належить до галузі медицини, зокрема до урології, нефрології та біохімії, і може бути використаним для оцінки ефективності корекції порушень кровообігу на тлі розвитку ішемії паренхіми нирки в експерименті та прогнозування подальшого перебігу відповідних патологічних станів як в експерименті, так і в клініці. Спосіб включає визначення в корковому шарі паренхіми нирки із експериментально змодельованою ішемією активності лізосомного канальцевого ферменту β-галактозидази, де активність β-галактозидази визначають після введення в ішемізовану нирку розчину основного фактора росту фібробластів, отриманий результат ферментативної реакції розраховують на 1 г сирої тканини коркового шару паренхіми нирки і, якщо рівні активності ферменту реєструють вищими за середній їх рівень в корковому шарі паренхіми ішемізованих нирок на 30 % та більше, ефект корекції порушень кровообігу в нирках вважають досягнутим. UA 104977 C2 (12) UA 104977 C2 UA 104977 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до галузі медицини, зокрема до урології, нефрології та біохімії, і може бути використаним для оцінки ефективності корекції порушень кровообігу на тлі розвитку ішемії паренхіми нирки в експерименті та прогнозування подальшого перебігу відповідних патологічних станів як в експерименті, так і в клініці. Згідно з сучасним уявленням, хвороби нирок незмінно супроводжуються порушенням внутрішньониркової гемодинаміки, що, як наслідок, призводить до виникнення та розвитку гіпоксичних (ішемічних) процесів в паренхімі нирки, тому проблема ішемії паренхіми нирки та, відповідно, її корекції, тобто корекції порушень внутрішньониркової гемодинаміки, на сьогодні займає важливе місце при вирішенні нагальних питань щодо подальшої тактики лікування хворих з патологією нирок. Дослідження в експериментальних умовах впливу нових лікувальних заходів, зокрема заходів корекції порушень внутрішньониркової гемодинаміки, як відомо, передують їх клінічним випробуванням і мати об'єктивні та інформативні критерії оцінки ефективності цих лікувальних заходів важливо. Як відомо, інтенсивність метаболічних процесів у паренхімі нирки повністю залежить від її кровопостачання, навіть незначне порушення якого одразу ж відбивається на функціональному стані її структурної одиниці - нефрону, та на рівнях активності тих ферментних систем, що приймають безпосередню участь у формуванні первинної сечі, тому реакція ферментів канальцевого апарата нефрону на гіпоксію є найбільш ранньою. У першу чергу це стосується змін гідролітичних ферментів в лізосомах., зокрема βгалактозидази, яка у високій концентрації є вміщеною в тканині паренхіми нирок та приймає безпосередню участь у тубулярному відділі нефрону у катаболізмі таких складних біополімерів як полісахариди, гліколіпіди та глікозаміног-лікани, відщепляючи від них галактозні залишки. Відомий спосіб оцінки ефективності впливу імунотропної терапії на функціональний стан канальцевого нефротелію у дітей, хворих на гломерулонефрит з нефротичним синдромом (1), який полягає у визначенні у сечі дітей лізосомного канальцевого ферменту β-галактозидази після завершення курсу лікування та оцінці ефективності впливу імунотропної терапії на функціональний стан канальцевого нефротелію залежно від кількісних величин рівнів активності цього ферменту. Недоліком способу є те, що він адаптований тільки для визначення активності ферменту в сечі, відповідно активність ферменту розраховують на 1 ммоль креатиніну сечі. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб діагностики ішемії в паренхімі нирки, взятий нами за прототип (2), що полягає у визначенні у корковому шарі паренхіми нирок кролів після розвитку у них експериментально змодельованої ішемії активності лізосомного канальцевого ферменту β-галактозидази як маркера ішемічного стану паренхіми нирки, активність якого розраховують у відносних одиницях із урахуванням кількості мг білка у біологічному матеріалі, вміст якого визначають біуретовим методом. Недоліком способу є те, що він тільки констатує наявність ішемічного ушкодження коркового шару паренхіми нирки після накладання лігатури на її верхній полюс, що стверджено результатами ангіографії та гістоморфологічно. Крім того, додаткове використання біуретового методу, за допомогою якого розраховують вміст білка у біологічному матеріалі для обчислення кінцевого результату ферментативної реакції, не завжди є інформативним у зв'язку з тим, що гомогенати ізниркової паренхіми іноді бувають не зовсім прозорими за рахунок опалесценції, що впливає на чутливість методу. В основу винаходу поставлена задача удосконалити спосіб оцінки ефективності корекції порушень кровообігу в ішемізованій нирці шляхом визначення у корковому шарі паренхіми нирки кролів із експериментально змодельованою ішемією після введення в ішемізовану нирку розчину основного фактора росту фібробластів (bFGF), як засобу для корекції порушень кровообігу в нирках, рівня активності канальцевого лізосомного ферменту β-галактозидази і залежно від рівня цього ферменту оцінити ефект поліпшення функціонального стану канальцевого нефротелію та відповідно ефект корекції порушень кровообігу в паренхімі нирки з ішемією, що впливає на подальшу тактику лікування хворих з патологією нирок. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб оцінки ефективності корекції порушень кровообігу в ішемізованій нирці, який включає визначення в корковому шарі паренхіми нирки із експериментально змодельованою ішемією активності лізосомного канальцевого ферменту βгалактозидази, згідно з винаходом, активність лізосомного канальцевого ферменту βгалактозидази визначають після введення в ішемізовану нирку розчину основного фактора росту фібробластів, отриманий результат ферментативної реакції розраховують на 1 г сирої тканини коркового шару паренхіми нирки і, якщо рівні активності ферменту реєструють вищими за середній їх рівень в корковому шарі паренхіми ішемізованих нирок на 30 % та більше, ефект корекції порушень кровообігу в нирках вважають досягнутим. 1 UA 104977 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Спосіб оцінки ефективності корекції порушень кровообігу в ішемізованій нирці виконують наступним чином: - проводять експериментальне моделювання ішемії нирки за запропонованим способом (3) для створення контрольної групи кролів; - застосовують основний фактор росту фібробластів (bFGF) для корекції порушень кровообігу в нирках (4) в дослідній групі; - у корковому шарі паренхіми нирки кролів контрольної та дослідної груп здійснюють визначення активності лізосомного канальцевого ферменту β-галактозидази, для чого використовують 2,5 % гомогенат коркового шару паренхіми нирки, з якого готують 25 % розчин гомогенату таким чином: зважують на технічних вагах 1 г сирої тканини нирки, отриману наважку ретельно подрібнюють ножицями в чашці Петрі на льоду, потім ретельно розтирають скляним товкачиком в спеціальному скляному гомогенізаторі, розміщеному у посудині з льодом, додаючи холодний (0-2 °C) 0,9 % фізіологічний розчин, при цьому кількість фізіологічного розчину за своєю масою дорівнює трьом частинам наважки тканини нирки, тобто 3 мл, ретельно перемішують, важливо, що всі процедури з наважкою тканини коркового шару нирки виконують якомога швидко та з обов'язковим використанням льоду, одержаний в такий спосіб 25 % розчин гомогенату тканини нирки далі розводять у 10 разів фізіологічним розчином, ретельно перемішують та центрифугують в центрифугальній пробірці при 3000 обертах за хвилину впродовж 10 хвилин для осадження залишків тканини, надосадову рідину зливають у окрему пробірку і вона являє собою 2,5 % розчин гомогенату коркового шару паренхіми нирки, який ще розводять у 2 рази 0,1 Μ цитратним буфером та ретельно струшують; надалі для визначення канальцевого лізосомного ферменту β-галактозидази використовують саме цей розведений вдвічі 2,5 % гомогенат паренхіми нирки: в пробірку беруть 0,2 мл гомогенату і додають 0,3 мл 0,1 Μ цитратного буферу рН 4,0 та 0,2 мл субстрату, який включає 5,0 мМ розчину 2-нітрофенілР-0-галактопіранозиду у 0,1 Μ цитратному буфері рН 4,0, проби інкубують 30 хвилин при 37 °С, після зупинення ферментативної реакції додаванням 0,8 мл 0,1 Μ розчину вуглекислого натрію проби фільтрують, оптичну щільність р-нітрофенолу, що утворився в результаті ферментативної реакції, вимірюють на фотоелектроколориметрі при 400 нм в кюветах з товщиною шару 3 мм проти контрольної проби, в яку розчин субстрату вносять після припинення ферментативної реакції, кількість р-нітрофенолу, що утворився в результаті ферментативної реакції, визначають за калібрувальною кривою, ферментативну активність βгалактозидази в паренхімі нирки з урахуванням ступеню розведення біоматеріалу розраховують у абсолютних одиницях - мкмолях р-нітрофенолу, що утворився протягом 1 години, із розрахунку на 1 г сирої тканини коркового шару паренхіми нирки. Апробацію способу, що заявляється, проведено в лабораторії нейроурології та в лабораторії біохімії ДУ "Інституту урології НАМН України" на 25 експериментальних тваринах статевозрілих кролях-самцях вагою у середньому 3,2±0,05 кг. Контрольну групу (група № 1) складають 10 кролів з експериментально змодельованою ішемією лівою нирки, що розвинулася через 3,5-6,0 місяців після накладання лігатури на її верхній полюс, права (контрлатеральна) нирка - інтактна; дослідну групу (група № 2) складають 9 кролів, яким на тлі експериментально змодельованої ішемії лівої нирки, що розвинулася через 3,5-6,0 місяців після накладання лігатури на її верхній полюс, з метою здійснення корекції порушень кровообігу в ліву дослідну нирку було введено розчин основного фактора росту фібробластів (bFGF); розвиток ішемії та, навпаки, ефект корекції порушень кровообігу в паренхімі нирок тварин підтверджено результатами ангіографії та гістоморфологічно, права (контрлатеральна) нирка - інтактна; групу № 3 складають 3 здорових кроля, це 6 нирок. Результати визначення активності лізосомного канальцевого ферменту β-галактозидази у корковому шарі паренхіми лівої (дослідної) та правої (інтактної) нирок кролів із контрольної групи № 1, дослідної - група № 2 та групи № 3 - здорових кролів, наведені в таблиці. 50 2 UA 104977 C2 Таблиця Активність β-галактозидази в корковому шарі паренхіми нирки кролів (М±m) №№ 1 2 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Групи кролів, що досліджувалися Контрольна група (n=10) Дослідна група (n=9) Активність β-галактозидази паренхіми нирки (мкмоль/год.·г сирої тканини) Права нирка (інтактна Ліва нирка (дослідна - а) б) 13,34±0,81(1а) 18,44±1,67(1б) 19,41±0,67(2а) 20,11±1,17(2б) Група здорових нирок кролів (n=6) 18,43±1,17 Статистичний показник р3-1а