Спосіб діагностики ішемії паренхіми нирки

Спосіб діагностики ішемії паренхіми нирки, що включає визначення у біологічному матеріалі лізосомного ферменту, який відрізняється тим, що визначають активність лізосомного канальцевого ферменту b-галактозидази в корковому шарі паренхіми нирки і, якщо рівні активності цього ферменту реєструють нижчими за 0,16мкмоль/год./мг білка, діагностують ішемію паренхіми нирки. (19) (21) u200807888 (22) 10.06.2008 (24) 27.10.2008 (46) 27.10.2008, Бюл.№ 20, 2008 р. (72) ПИРОГОВ ВІКТОР ОЛЕКСІЙОВИЧ, U A, МИГАЛЬ ЛЮДМИЛА ЯКИ МІВН А, U A, НІКУЛІН А ГАЛИНА ГРИГОРІВНА, U A, НІКІТАЄВ СЕРГІЙ ВІКТОРОВИЧ, UA, НЕГРЕЙ ЛАРИСА МИКОЛАЇВН А, UA 3 36540 першу чергу відбувається активація гідролітичних лізосомних ферментів у сечі. Недоліком дослідження є те, що сеча є несприятливим середовищем для визначення активності ферментів, тому що містить ряд потенційних інгібіторів ферментативної реакції, великій набір різних іонів у високій концентрації тощо. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб діагностики ішемії паренхіми нирки шляхом визначення рівня активності канальцевого лізосомного ферменту b-галактозидази у корковому шарі паренхіми нирки і залежно від рівня цього ферменту діагностувати ішемію паренхіми нирки. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб діагностики ішемії паренхіми нирки, який включає визначення у біологічному матеріалі лізосомного ферменту, згідно з корисною моделлю, визначають активність лізосомного канальцевого ферменту b-галактозидази в корковому шарі паренхіми нирки і, якщо рівні активності цього ферменту реєстр ують нижчими за 0,16мкмоль/год/мг білка, діагностують ішемію паренхіми нирки, що може бути використаним для ранньої діагностики та своєчасного лікування ішемічних розладів в паренхімі нирок. Спосіб діагностики ішемії паренхіми нирки виконують наступним чином: з отриманої в експерименті наважки 1г сирої тканини коркового шару паренхіми нирки кролика, готують 25% розчин гомогенату, для чого тканину ретельно подрібнюють і розтирають скляним товкачиком в скляному гомогенізаторі, розміщеному у посудині із льодом, додають холодний (0-2°С) 0,9% фізіологічний розчин в об'ємі 1:3, тобто на 1 наважку тканини нирки додають 3мл 0,9% фізіологічного розчину. Все ретельно перемішують. Важливо, що всі процедури з наважкою тканини коркового шару нирки виконують швидко та обов'язково на льоду. Одержаний в такий спосіб 25% розчин гомогенату тканини нирки далі розводять у 10 разів фізіологічним розчином, потім ретельно перемішують та центрифугують в центрифужній пробірці при 3000 обертах за хвилину впродовж 10 хвилин для осадження залишків тканини. Надосадову рідину, що являє собою 2,5% розчин гомогенату коркового шару паренхіми нирки, зливають у окрему пробірку, розводять у 2 рази 0,1М цитратним буфером та ретельно струшують. Надалі в пробірку беруть 0,2мл цього гомогенату і додають до них 0,3мл 0,1М цитратного буферу рН 4,15 та 0,2мл субстрату, який включає 10мМ розчину 2-нітрофеніл-Р-В-галактопіранозиду у 0,1М цитратному буфері рН 4,15. Проби інкубують 30 хвилин при 37°С, потім реакцію зупиняють додаванням 0,8мл 0,1М розчину вуглекислого натрію. Оптичну щільність пара-нітрофенолу, що утворився в результаті ферментативної реакції, вимірюють на фотоелектроколориметрі при 400нм в кюветах з товщиною шару 3мм проти контрольної проби, в яку розчин субстрату вносять після припинення ферментативної реакції. Кількість паранітрофенолу, що утворився в результаті ферментативної реакції, визначають за калібрувальною кривою. 4 Ферментативну активність b-галактозидази в паренхімі нирки з урахуванням ступеню розведення біоматеріалу розраховують у відносних одиницях - у мкмолях пара-нітрофенолу, що утворився протягом 1 години, із розрахунку на 1мг білка у біологічному матеріалі. Вміст білка визначають біуретовим методом. Апробацію способу, що заявляється, проведено в лабораторії біохімії та в лабораторії нейроурології ДУ "Інститут урології АМН України". Експериментальні тварини - статевозрілі кролики - самці вагою у середньому 3,2±0,05кг. Дослідження проведено на 12 здорових (нормальних) нирках та на 6 нирках з ішемією, яка розвинулася через місяць після накладання лігатури на її верхній полюс. Експерименти здійснюють з використанням внутрішньовенного наркозу. Розвиток ішемії стверджено результатами ангіографії та гістоморфологічно. Отримані результати показали, що рівні активності b-галактозидази в корковому шарі паренхіми нормальних нирок з урахуванням середньої величини та її похибки (М±m) дорівнювали у середньому 0,24±0,028мкмолей пара-нітрофенолу, що утворився протягом 1год. інкубації при 37,0°С із розрахунку на 1мг білка, середнє квадратичне відхилення - s, величина, що характеризує варіабельність результатів, дорівнювала 0,052. Для визначення меж рівнів активності b-галактозидази у корковому шарі нормальних нирок експериментальних тварин дотримувалися рекомендацій В.В. Власова [3], який запропонував для встановлення меж референтних інтервалів використовувати формулу М±1,5 s. З урахуванням величин середнього квадратичного відхилення (1,5 s) нижня межа активності b-галактозидази у корковому шарі нормальних нирок експериментальних тварин дорівнює 0,16мкмоль/год/мг білка. Отже, у ти х випадках, коли рівні активності b-галактозидази реєструються нижчими за 0,16мкмоль/год/мг білка, діагностують ішемію паренхіми нирки. У корковому шарі паренхіми нирок тих тварин, у яких розвинулася ішемія, рівні активності b-галактозидази за середніми даними дорівнювали 0,13±0,024мкмоль/год/мг білка, що є статистичне вірогідно щодо відповідних результатів у корковому шарі паренхіми нормальних нирок (р