Спосіб визначення клотіанідину та бета-цифлутрину – діючих речовин препаратів модесто 480 fs, еладо 480fs, пончо бета 453,3 fs – в протруєному насінні ріпаку та цукрових буряків

Реферат: Винахід стосується способу визначення клотіанідину і бета-цифлутрину - діючих речовин препаратів Модесто 480 FS, Еладо 480 FS та Пончо Бета 453,3 FS - в протруєному насінні UA 108513 C2 (12) UA 108513 C2 ріпаку та цукрових буряків, який включає забезпечення наважки насіння, екстракцію її розчинником протягом 50-70 хвилин, визначення діючих речовин та ідентифікацію сполук, які проводять за величиною Rf, а кількісне визначення - за формулою розрахунковим методом, використовуючи залежність площі хроматографічної зони від концентрації діючої речовини, причому визначення діючих речовин виконують методом тонкошарової хроматографії з використанням пластинок "Сорбфіл" з тонким шаром адсорбенту СТХ-1А, нанесеним на алюмінієву основу, хроматографують пластинки у рухомій фазі - суміші гексану з ацетоном у співвідношенні 3:2, а обробляють одну пластинку проявляючим реагентом - розчином бромфенолового синього в ацетоні - з подальшим відбілюванням фону 2 % розчином лимонної кислоти, а другу - 1 % аміакатом срібла з подальшим УФ-опроміненням. UA 108513 C2 5 10 15 Спосіб стосується галузі аналітичної хімії пестицидів, аналізу їх вмісту в об'єктах навколишнього середовища. Спосіб може бути використаний для оцінки якості протруєння насіннєвого матеріалу. Переважна галузь використання - аналітична хімія пестицидів та контроль технології їх застосування. В препаратах для протруювання насіння Модесто 480 FS, та Еладо 480 FS, (ф."Байєр КропСаєнс АГ", Німеччина) [1] містяться дві діючі речовини: клотіанідин (І) та бета-цифлутрин (II) у ваговому відношенні 5:1 (клотіанідин 400 г/л + бета-цифлутрин 80 г/л); використовуються вони для обробки насіння олійної культури ріпаку з метою збереження культури від комплексу наземних та ґрунтових шкідників сходів (квіткоїд, хрестоцвіті блішки, капустяна попелиця): Модесто 480 FS з нормою витрати 12,5 л/т., а Еладо 480 FS - з нормою витрати 25 л/т. В препараті Пончо Бета 453,3 FS (ф."Байєр КропСаєнс АГ", Німеччина) також містяться клотіанідин та бета-цифлутрин, але у відношенні 7,5:1 (клотіанідин 400 г/л + бета-цифлутрин 53,3 г/л); використовується він для обробки насіння цукрових буряків з метою збереження культури від комплексу наземних та ґрунтових шкідників сходів (сірий та чорний довгоносик, бурякова попелиця, мінуючі мухи та інші шкідники) з нормою витрати 0,075-0,15 л на 1 посівну одиницю. І Клотіанідин. Хімічна назва - (E)-1-(2-хлор-1,3-тіазол-5-ілметил)-3-метил-2-нітрогуанідин. Молекулярна формула: C6H8ClN5O2S. Структурна формула: O2N H3 C 20 25 N N C H Cl S N H C H2 N . Молекулярна маса 249,7 II Бета-цифлутрин. Хімічна назва ціано-(4-фтор-3-феноксифеніл)-метил-3-(2,2-дихлор-вініл)2,2-диметилциклопропанкарбоксилат. Молекулярна формула C22H18CI2FNO3. Структурна формула: Cl Cl C CH O C H3C 30 35 40 45 O CH3 O H C C F N . Молекулярна маса 434,29. Відомі способи визначення клотіанідину в повітрі, воді, ґрунті, зерні хлібних злаків, картоплі, томатах, томатному сокові, насінні ріпаку, цукровому буряку методом високоефективної рідинної (ВЕРХ) хроматографії базуються на вилученні ацетонітрилом, очищенні екстрактів перерозподілом в системі рідина-рідина та адсорбційною хроматографією. Метод ВЕРХ погребує використання складних приладів: рідинного хроматографа з У Φ детектором [2]. Існуючі способи визначення бета-цифлутрину в повітрі; воді, ґрунті, винограді, виноградному соку; цукровому буряку, ріпаковій олії, зерні, яблуках, картоплі базуються на екстракції хлороформом або водним ацетоном; очистці ацетонітрилом. Визначення методом ТШХ проводять із застосуванням пластинок "Silufol"; "Сорбфіл", рухомих фаз: суміші гексану з ацетоном у різних співвідношеннях і суміші н-гексану з етилацетатом при двомірній хроматографії; проявляючого реагенту: аміакату срібла [3]. Однак ці способи, вирішуючи завдання визначення кожної діючої речовини окремо, не вирішують завдання визначення клотіанідину та бета-цифлутрину в одній наважці насіння ріпаку, цукрових буряків та мають ряд недоліків, а саме: 1. Визначається тільки одна діюча речовина. 2. Витрачається значна кількість часу на аналіз (8-10 етапів). 3. Для проведення аналізу необхідний складний прилад (газорідинний хроматограф, рідинний хроматограф з УФ-детектором). 1 UA 108513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 4. Стандартні розчини готують для кожної діючої речовини окремо, використовують аналітичні стандарти. Спосіб, який використовується як прототип: Бублик Л.І., Федоренко Н.В., Гаврилюк Л.Л., Панченко Т.П. "Спосіб визначення діючих речовин протруйника Чинук, 20 % т.к.с. імідаклоприду та бета-цифлутрину в протруєному насінні ріпаку". Деклараційний патент на винахід №79115 Бюл. №7 від 25.05.2007 р. Спосіб базується на застосуванні методу тонкошарової хроматографії. Наважку протруєного насіння ріпаку (0,2 г) екстрагують невеликим об'ємом розчинника (1 мл) протягом 1 години у бюксі з притертою кришкою. Дають екстракту відстоятися, зливають у мірну пробірку на 5 мл, промивають пробу невеликою кількістю ацетону і знову зливають у пробірку, доводячи об'єм до 1 мл. Готують стандартний розчин, який містить по 0,5 мкг/мкл імідаклоприду та бета-цифлутрину. На пластинці відмічають простим олівцем лінію старту на відстані 20 мм від нижнього краю пластинки та лінію фронту на відстані 100 мм від лінії старту. На тонкошарову пластинку наносять мікрооб'єми екстракту і стандартного розчину діючих речовин. Хроматографують пластинку рухомій фазі (гексан + ацетон у об'ємних співвідношеннях 2:1). Для ідентифікації діючих речовин пластинку вміщують під лампу УФопромінення на 10 хвилин, потім обробляють 1 % розчином нітрату срібла в ацетоні з аміаком і ще раз вміщують під лампу УФ на 3 хвилини. Імідаклоприд і бета-цифлутрин проявляються у вигляді темних плям на світлому фоні з Rf=0,19 і 0,85 відповідно. Хоча у цьому способі-прототипі визначають діючі речовини імідаклоприд і бета-цифлутрин одночасно в одній мікронаважці, але тільки для насіння ріпаку і готують стандартний розчин з двох діючих речовин відповідно ваговому відношенню діючих речовин в препараті Чинук (1:1) В основу винаходу поставлено задачу створити експресний спосіб визначення двох діючих речовин - клотіанідину та бета-цифлутрину (з високою точністю) за рахунок скорочення часу виконання робіт, зниження витрати реактивів та вартості аналізу за рахунок заміни аналітичних стандартів діючих речовин розчинами з відповідних препаратів, виключення з аналізу трудомістких підготовчих робіт та складної апаратури (газорідинного хроматографа, рідинного хроматографа з УФ-детектором). Поставлена задача вирішується тим, що у запропонованому способі визначають одночасно клотіанідин та бета-цифлутрин в наважках насіння ріпаку та цукрових буряків. Відомий метод ТШХ у винаході реалізується при використанні: - пластинок "Сорбфіл" з тонким шаром адсорбенту силікагелем СТХ-1А та силіказолем як зв'язуючої речовини, нанесеними на алюмінієву основу, на відміну від тих, що використовуються в прототипі (пластинки "Армсорб ТСХ-КСКГ-УФ" містять адсорбент силікагель КСК і зв'язуючу речовину-крохмаль); - стандартного розчину, що готується з відповідного препарату, а не з окремих аналітичних стандартів діючих речовин, як в прототипі; - рухомої фази - суміш гексану з ацетоном у об'ємних співвідношеннях 3:2, на відміну від прототипу (гексан-ацетон 2:1 об/об); - ідентифікацію сполук проводять з використанням двох проявляючих реагентів на відміну від одного в прототипі: розчином бромфенолового синього в ацетоні з наступним відбілюванням 2 % розчином лимонної кислоти (чутливість визначення клотіанідину 0,05 мг/мл, а бетацифлутрину -0,5 мг/мл) та 1 % аміакатом срібла з подальшим УФ-опроміненням (чутливість визначення клотіанідину 0,5 мг/мл, а бета-цифлутрину -0,01 мг/мл). - Визначається комбінація бета-цифлутрину з іншою діючою речовиною, ніж в прототипі, а саме клотіанідину замість імідаклоприду; - кількісне визначення - за формулою розрахунковим методом, використовуючи залежність площі хроматографічної зони від концентрації діючої речовини в 12 повторах замість 5, що підвищує точність вимірювань. Тут і далі терміном: - "величина Rf позначена величина, що характеризує швидкість руху речовини в шарі адсорбенту відносно швидкості руху рухомої фази, яка дорівнює відношенню відстаней, пройдених центром зони локалізації речовини і рухомою фазою за один і той же відрізок часу; - "рухома фаза" - суміш органічних розчинників у певному об'ємному співвідношенні; - "проявляючий реагент" реактив, що при взаємодії з діючою речовиною дає забарвлений продукт і дозволяє визначити зону її локалізації. Послідовне виконання нових суттєвих ознак у запропонованому способі, що включає: приготування стандартного розчину з препарату, а не з окремих аналітичних стандартів діючих речовин; ідентифікацію сполук з використанням двох проявляючих реагентів на відміну від одного в прототипі для підвищення точності вимірювань, дозволило створити спосіб визначення 2 UA 108513 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 діючих речовин клотіанідину і бета-цифлутрину для протруювання насіння ріпаку та цукрових буряків препаратами Модесто 480 FS, Еладо 480 FS та Пончо Бета 453,3 FS. Спосіб дозволяє: - визначати обидві діючі речовини в процесі одного аналізу; - скоротити більше, ніж вдвічі час виконання робіт; - проводити аналіз з стандартним розчином, що є сумішшю діючих речовин у такому співвідношенні, як в препаратах Модесто 480 FS, Еладо 480 FS, та Пончо Бета 453,3 FS; - має незначну відносну похибку, менше 7 %; - простий у виконанні, не потребує складної апаратури (газорідинного хроматографа, рідинного хроматографа з УФ-детектором), великої витрати реактивів. Заявлений спосіб на прикладі препарату Модесто 480 FS здійснюється таким чином: наважку протруєного насіння ріпаку (0,2г) екстрагують невеликим об'ємом розчинника (1 мл) протягом 50-70 хвилин, залежно від розміру насіння. На тонкошарову пластинку наносять мікрооб'єми екстракту і стандартного розчину препарату Модесто 480 FS (0,1 % розчин в ацетоні за вмістом клотіанідину 1,0 мг/мл та бета-цифлутрину 0,2 мг/мл). Хроматографують пластинку у рухомій фазі (гексан + ацетон у об'ємних співвідношеннях 3:2), яка забезпечує чітке розділення хроматографічних зон обох діючих речовин. Після того як границя елюенту підніметься на 10 см, пластинку виймають з камери для хроматографування, сушать на повітрі до повного видалення розчинника. Пластинки поміщають під хроматоскоп (УФ-254), відмічають зони локалізації пестицидів олівцем, потім обприскують із пульверизатора відповідним реагентом. Ідентифікація пестицидів, що містять атоми сірки, азоту, кисню, а саме клотіанідину, базується на осадженні срібла у вигляді малорозчинної солі, в якій катіон - комплекс срібла з нейтральною органічною молекулою, а аніон - бромфеноловий синій. Відбілювання фону пластинки проводять 2 %-ним розчином лимонної кислоти. Клотіанідин проявляється у вигляді плям синього кольору з чутливістю визначення 0,05 мг/мл. Чутливість визначення галогенвмісного бета-цифлутрину - 0,5 мг/мл. Для проявлення бета-цифлутрину пластинку опромінюють 10 хвилин і далі застосовують реагент-1 % аміакат срібла з подальшим УФ опроміненням хроматограми протягом 3 хвилин. При цьому утворюються темні плями відновленого срібла в зонах локалізації сполуки. Чутливість визначення бета-цифлутрину - 0,01 мг/мл, клотіанідину - 0,5 мг/мл. Ідентифікацію проводять за величиною Rf. В рухомій фазі гексан-ацетон (3:2, об/об, ε=9,65) величина Rf дорівнює: клотіанідину 0,320,05, бетацифлутрину 0,870,05. Приклад Наважку 0,2 г протруєного насіння ріпаку поміщають у бюкс з щільно притертою кришкою, заливають 1 мл ацетону і струшують протягом 50-70 хвилин. Екстракт після відстоювання переносять у мірну пробірку на 5 мл, промивають пробу ацетоном, доводячи об'єм до 1 мл. Аліквоту (0,5-5,0 мкл) наносять на хроматографічні пластинки. Готують 0,1 % стандартний розчин за вмістом клотіанідину 1,0 мг/мл та бета-цифлутрину 0,2 мг/мл: наважку 0,25 г препарату Модесто 480 FS переносять в мірну колбу місткістю 100 мл, розчиняють в ацетоні і доводять об'єм розчину до позначки. На пластинки на відстані 20 мм від нижнього краю на лінії старту наносять екстракт проби та поруч з ними стандартні розчини: на першу - по 0,5; 1,0; 2,0 мкл (стандартні розчини містять відповідно 0,5; 1,0; 2,0 мкг клотіанідину та 0,1; 0,2; 0,4 мкг бета-цифлутрину), на другу - по 2,0; 3,0; 5,0 мкл (стандартні розчини містять відповідно 2,0; 3,0; 5,0 мкг клотіанідину та 0,4; 0,6; 1,0 мкг бета-цифлутрину). Пластинки хроматографують і проявляють. Зони клотіанідину і бета-цифлутрину копіюють на міліметровий папір і визначають їх площі, значення яких наведені в табл. Таблиця Залежність площ зон локалізації діючих речовин від їх кількості (стандартний розчин). Кількість діючих речовин, мкг 2 Площа зон клотіанідину, S мм 2 Площа зон бета-цифлутрину, S мм 0,2 9,4 6,2 0,5 12,2 9,3 Примітка. Відносна похибка 7 % при n=12, Р=0,95. 50 Розрахунок кількості діючих речовин проводять за відомою формулою: 3 0,7 14,6 11,3 1,0 18,7 14,3 UA 108513 C2 Cx  C2  5 C2  C1 S2  Sx  S2  S1 , де C x і S x - кількість і площа плями речовини, що визначається на пластинці, мкг, мм 2; C2, C1 і S2, S1 - кількість і площі відповідних плям стандартних розчинів з більшим і меншим вмістом діючої речовини. Наприклад, у 1 мкл проби визначені площі клотіанідину і бета-цифлутрину становлять 18,1 та 5,9 мм відповідно. Розраховані кількості діючих речовин становлять для: 10  0,7 , 18,7  18,1  0,96 мкг Cx  10  , 18,7  14,6 клотіанідину ; 0,5  0,2 9,3  5,9  0,17 мкг 9,3  6,2 бета-цифлутрину . Кількість діючих речовин в кг/т обробленого насіння розраховують за формулою: Сx Cу  Vx  Px , де Cу - концентрація діючої речовини, що визначається (кг/т); Vx , Сx - об'єм екстракту, нанесений на пластинку та кількість діючої речовини, визначена в ньому (мкл, мкг); Px - наважка 0,2 г. Розраховані за цією формулою концентрації діючих речовин становлять для: 0,96 Cу   4,78 кг / m 1 0,2 клотіанідину ; Cx  0,5  10 15 0,17  0,85 кг / m 1 0,2 бета-цифлутрину . Розраховані кількості діючих речовин відповідають нормі витрати препарату Модесто 480 FS 12,5 л/т (5 кг/т клотіанідину і 1 кг/т бета-цифлутрину). Отримані дані свідчать про високу точність визначення клотіанідину та бета-цифлутрину діючих речовин препаратів Модесто 480 FS, Еладо 480 FS та Пончо Бета 453,3 FS - в протруєному насінні ріпаку та цукрових буряків відповідно до заявленого способу. Наведені дані підтверджують досягнення технічного результату при здійсненні заявленого методу. Джерела інформації: 1. Перелік пестицидів і агрохімікатів, дозволених до використання в Україні, К.: ЮНІВЕСТ МЕДІА, 2012 - С. 277. 2. Гринько А.П., Зварич Г.В. Методичні вказівки з визначення клотіанідину в насінні ріпаку методом високоефективної рідинної хроматографії №756-2007 от 20.02.07 // 36. Методичні вказівки з визначення мікрокількостей пестицидів в харчових продуктах, кормах та навколишньому середовищі. - К. - № 71. - 2011. - С. 182-196. 3. Чмиль В.Д., Горцева Л.В., Кузнецова В.Η., Шутова Т.В. Методические указания по определению бета-цифлутрина в воде, почве, зерне ячменя, яблоках, картофеле, рапсе и рапсовом масле хроматографическими методами №107-98 від 01.06.1998 // Сб. Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в пищевых продуктах, кормах и внешней среде. - К. - № 32. - 2001. - С. 106-113. Cу  20 25 30 35 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 40 45 Спосіб визначення клотіанідину і бета-цифлутрину - діючих речовин препаратів Модесто 480 FS, Еладо 480 FS та Пончо Бета 453,3 FS - в протруєному насінні ріпаку та цукрових буряків, який включає забезпечення наважки насіння, екстракцію розчинником протягом 50-70 хвилин, визначення діючих речовин та ідентифікацію сполук, які проводять за величиною Rf, а кількісне визначення - за формулою розрахунковим методом, використовуючи залежність площі хроматографічної зони від концентрації діючої речовини, причому визначення діючих речовин виконують методом тонкошарової хроматографії з використанням пластинок "Сорбфіл" з 4 UA 108513 C2 5 тонким шаром адсорбенту СТХ-1А, нанесеним на алюмінієву основу, хроматографують пластинки у рухомій фазі - суміші гексану з ацетоном у співвідношенні 3:2, а обробляють одну пластинку проявляючим реагентом - розчином бромфенолового синього в ацетоні - з подальшим відбілюванням фону 2 % розчином лимонної кислоти, а другу - 1 % аміакатом срібла з подальшим УФ-опроміненням. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5