Спосіб визначення ефективності використання біоспорину і субаліну для індивідуального лікування захворювань, викликаних умовно патогенною і патогенною мікробіотою

Реферат: Спосіб визначення ефективності застосування біоспорину і субаліну для індивідуального лікування захворювань, викликаних умовно патогенною і патогенною мікробіотою, відповідно до якого з біологічного матеріалу пацієнта виділяють мікроорганізми і визначають їх вид, біоспорин і субалін розводять стерильною водою, витримують не менше 2 годин при температурі 36,9…37,1 °C в термостатованій шафі, потім визначені до виду мікроорганізми висівають на середовище Мюллер-Хінтона і Сабуро і культивують їх протягом доби, після чого наносять водні суспензії біоспорину і субаліну на засіяні культури мікроорганізмів, і через добу візуально спостерігають за їх ростом, при цьому при прояві просвітлінь в місці нанесення водних суспензій біоспорину і субаліну роблять висновок про ефективність застосування біоспорину і субаліну для лікування даного пацієнта, а за відсутності просвітлінь в місці нанесення водних суспензій біоспорину і субаліну роблять висновок про неефективність застосування біоспорину і субаліну для лікування даного пацієнта. UA 109232 U (12) UA 109232 U UA 109232 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, зокрема, до визначення ефективності застосування біоспорину і субаліну для індивідуального лікування захворювань, викликаних умовно патогенною і патогенною мікробіотою. Здатність спороутворюючих бактерій надавати антагоністичну, пробіотичну і пребіотичну дії призвела до розробок на їх основі препаратів, віднесених до покоління так званих "антагоністів, що самоелімінуються" (СЕА) (Бакулина Л.Ф. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии / Л.Ф. Бакулина, Н.Г. Перминова, И. В. Тимофеев и др. // Биотехнология. - 2001. - № 2. - С. 4-56). На сьогоднішній день у світі створено понад півсотні таких препаратів. Хоча більшість бактерій, що мають пробіотичні властивості, є представниками сімейств Lactobacillus і Bifidobacterium, все частіше в такій якості стали використовуватися і спороутворюючі бактерії, особливо з роду Bacillus (Похиленко В.Д. Пробиотики на основе спорообразующих бактерий и их безопасность / В.Д. Похиленко, В.В. Перелыгин // Химическая и биологическая безопасность. - 2007. - № 2-3 С. 21-41). Незважаючи на те, що остаточно не вирішено питання про правомірність примусового "насадження нормальної мікрофлори", в продаж надходить велика кількість лікарських засобів, біологічно активних добавок та продуктів функціонального харчування, які містять не тільки молочнокислі, але й спороутворюючі бактерії пробіотичної дії (Характеристика условнопатогенных микроорганизмов при острых и хронических заболеваниях кишечника / Η.Φ. Брусникииа, Η.В. Залесских, С.А. Быкова, М.А. Власнеко // Республиканский сборник научных трудов / под ред. И.Н. Блохиной, К.Л. Соколовой. - Горький: Мед. ин-т, 1988. - С. 41-43). Субалін являє собою суху мікробну масу живої антагоністично активної культури Bacillus subtilis УКМ В - 5020, ліофілізовану з додаванням сахарозо-желатинового середовища. Якісний і 9 кількісний склад. Діючі речовини - в одній дозі препарату міститься не менше 1·10 живих мікробних клітин Bacillus subtilis УКМ В - 5020; допоміжні речовини - сахароза, желатин, натрію хлорид. Біоспорин: діючі речовини: одна доза біоспорину (Біофарма) містить живих мікробних 9 9 клітин Bacillus subtilis УКМ В - 5007: 1·10 …8·10 , Bacillus licheniformis УКМ В - 5514: 8 9 1·10 …2·10 ; допоміжні речовини: сахароза, желатин, натрію хлорид. Бацили цих лікарських препаратів виділяють антибіотикоподібні речовини, так звані бактеріоцини і мікоціни. При цьому власна мікрофлора має видову стійкість до субаліну і біоспорину, тобто вони діють спільно. Bacillus subtilis виділяють в просвіт кишечнику субтилізін і ферменти, які допомагають руйнувати і виводити ендотоксини умовно-патогенної мікрофлори (УПМ). Крім цього ферменти Bacillus subtilis беруть участь в пристіночному травленні. Дипіколінова кислота є, з одного боку, додатковим фактором ерадикації УПМ, з іншого боку, сприяє зростанню власної нормофлори (Бакулина Л.Ф. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии / Л.Ф. Бакулина, Н.Г. Перминова, И.В. Тимофеев и др. // Биотехнология. - 2001. - № 2. - С. 4-56). Препарат біоспорин призначений для лікування дітей (з 3-х місяців) і дорослих: - хворих на гострі кишкові інфекції (ГКІ) легких і середніх форм, а також важких форм (у пацієнтів з протипоказаннями до антибіотикотерапії), викликаних патогенними та умовно патогенними (у т. ч. стійкими до антибіотиків) мікроорганізмами (Salmonella spp., Shigella spp., ентеропатогенними Е. coli, Proteus spp., Staphylococcus spp., Candida spp.); - осіб, які перенесли ГКІ (у разі виділення патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів, а також при дисфункції кишечнику); - з метою корекції мікрофлори кишечника (при дисбактеріозах, що виникли внаслідок антибіотикотерапії або інших причин); - з метою профілактики гнійно-септичних ускладнень в післяопераційному періоді; - у гінекологічній практиці: при вульвовагінальному кандидозі у жінок репродуктивного віку, в т.ч. вагітних; при бактеріальному вагінозі (з метою реабілітації після закінчення курсу антибактеріальної терапії); - у стоматологічній практиці: при хронічному рецидивному стоматиті у дітей. Препарат субалін - антивірусний, антибактеріальний, імуномоделюючий мікробний препарат. Лікувальну дію препарату визначають живі бактерії, що мають високу антагоністичну активність по відношенню до патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів, і сприяють нормалізації якісного і кількісного складу кишкової мікрофлори, а також характеризуються антивірусною активністю внаслідок синтезу α-2-інтерферону. Субалін призначають у комплексному лікуванні дорослих: - хворих вірусними гострими гепатитами А і В; - хворих вірусним хронічним гепатитом В; - носіїв HBsAg; - хворих бактеріальними та вірусно-бактеріальними менінгоенцефалітами; 1 UA 109232 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 - хворих на гострі кишкові інфекції (легких форм і захворювань середнього ступеня, а також важких форм у пацієнтів з протипоказаннями до антибіотикотерапії), викликаних патогенними та умовно-патогенними мікроорганізмами (Salmonella spp., Shigella spp., ентеропатогенними Ε. coli, Proteus spp., Staphylococcus spp., Candida spp.), у тому числі стійких до антибіотиків; - пацієнтів, які перенесли ГКІ, у разі виділення патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів, а також при дисфункції кишечнику. Субалін призначають у комплексному лікуванні дітей: - хворих на хронічні вірусні гепатити В і С з дисбіозом кишечнику, синдромом ендотоксикозу. Препарат субалін, також як біоспорин, належить до препаратів для лікування інфекцій, викликаних умовно-патогенними і патогенними мікроорганізмами. У зв'язку з тим, що індивідуальне сприйняття у пацієнтів цих препаратів різне, задача визначення ефективності застосування біоспорину і субаліну для індивідуального лікування захворювань, викликаних умовно-патогенною і патогенною мікробіотою, є актуальною. Це підтверджується наступним. На базі Науково-технічного центру "Водообробка" (м. Одеса) з 2000 по 2003 pp. були проведені дослідження води річки Дністер на всіх етапах очистки, а також була досліджена вода, яка пройшла додаткове очищення і озонування на водоочисних спорудах. У річці і на всіх етапах очистки були виявлені бактерії p. Bacillus. Види бактерій p. Bacillus (Bacillus cereus 17а, В. cereus 25, В. cereus 26, В. coagulans 21а, В. laterosporus 17а, В. subtilis) є непатогенними денітрифікуючими бактеріями, крім того вони антагоністи до більшості умовно-патогенних бактерій. Штами цих бактерій знижували кількість умовно-патогенних бактерій роду Enterobacteriacae, p. Pseudomonas, p. Staphylococcus і гр. p. Candida, якими обростають механічні та вугільні фільтри в будь-яких установках очищення води і по закінченню часу починають потрапляти у воду, повторно забруднюючи її. У зв'язку з цим виникла необхідність визначення ефективності препаратів біоспорин (Bacillus subtilis УКМ В - 5007 і Bacillus licheniformis УКМ В - 5514) і субалін (Bacillus subtilis УКМ В - 5020) для індивідуального лікування захворювань, викликаних умовно патогенною і патогенною мікробіотою. З науково-медичної та патентної літератури невідомі способи визначення ефективності застосування біоспорину і субаліну для індивідуального лікування захворювань, викликаних умовно патогенною і патогенною мікробіотою. В основу корисної моделі поставлена задача створити спосіб, в якому шляхом певної послідовності виділення та визначення виду мікроорганізмів, культивування їх і взаємодії з водними суспензіями біоспорину і субаліну, забезпечити визначення ефективності застосування біоспорину і субаліну для індивідуального лікування захворювань, викликаних умовно патогенною і патогенною мікробіотою. Поставлена задача вирішується тим, що в способі визначення ефективності застосування біоспорину і субаліну для індивідуального лікування захворювань, викликаних умовно патогенною і патогенною мікробіотою, відповідно до якого з біологічного матеріалу пацієнта виділяють мікроорганізми і визначають їх вид, біоспорин і субалін розводять стерильною водою, витримують не менше 2 годин при температурі 36,9…37,1 °C в термостатованій шафі, потім визначені до виду мікроорганізми висівають на середовище Мюллер-Хінтона і Сабуро і культивують їх протягом доби, після чого наносять водні суспензії біоспорину і субаліну на засіяні культури мікроорганізмів, і через добу візуально спостерігають за їх ростом, при цьому при прояві просвітлінь в місці нанесення водних суспензій біоспорину і субаліну роблять висновок про ефективність застосування біоспорину і субаліну для лікування даного пацієнта, а за відсутності просвітлінь в місці нанесення водних суспензій біоспорину і субаліну роблять висновок про неефективність застосування біоспорину і субаліну для лікування даного пацієнта. Спосіб здійснюється в наступному порядку. У пацієнта, який звернувся за направленням лікаря, беруть пробу біологічного матеріалу (сеча або кал, або мокрота, і т. д.), з якої виділяють мікроорганізми. Потім визначають їх види. Виділені і визначені до виду культури мікроорганізмів засівають на середовище МюллерХінтона і Сабуро на чашки Петрі діаметром 6 мм. Далі препарати біоспорин і субалін розводять стерильною водою (5 мм води на один флакон препарату) і залишають на 2 години при температурі 37 °C в термостатованій шафі. 9 Стерильні паперові диски просочують суспензією 0,01 мл препаратів біоспорин і субалін (10 КОУ/мл культури штаму) і наносять на середовище з засіяними мікроорганізмами. Після цього візуально спостерігають зони затримки і зони росту мікроорганізмів. 2 UA 109232 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 При появі просвітлінь в місцях нанесення водних суспензій біоспорину і субаліну роблять висновок про ефективність застосування біоспорину і субаліну для лікування даного захворювання у пацієнта, викликаного умовно-патогенною і патогенною мікробіотою. При відсутності просвітлінь (зон затримки росту мікроорганізмів) в місці нанесення водних суспензій біоспорину і субаліну роблять висновок про недоцільність застосування біоспорину і субаліну для лікування захворювання у конкретного пацієнта, викликаного умовно-патогенною і патогенною мікробіотою. Приклад 1. Пацієнт П., 1959 p. н., звернувся в клініку з гострими болями при сечовипусканні. У 5 бактеріологічному посіві сечі виявлена Escherichia coli в кількості 10 КОУ/мл - 4 ст.р. У антибіотикограммі визначена чутливість Е.соlі до біоспорину і субаліну, поряд з іншими антибіотичними речовинами і фагами. Е.соlі в даному посіві проявляла чутливість і до біоспорину і до субаліну. Застосувавши дані препарати для лікування, в повторному посіві через 5 днів, після закінчення прийому препаратів, Е.соlі виявлена не була. На дослідження брали середню порцію сечі, взяту в стерильний посуд, після ретельного туалету зовнішніх статевих органів. Розсівали сечу для визначення числа мікробних клітин в 1 мл сечі (ступінь бактеріурії) методом секторних посівів на поживний агар, 5 % кров'яний агар, цукровий бульйон і агар Сабуро. Платиновою петлею, діаметром 2 мм, ємністю 0,005 мл здійснили посів сечі на сектор А чашки Петрі з простим живильним агаром. Пропалили петлю і зробили чотири посіви з сектора А в сектор 1 і аналогічним способом - з сектора 1 в сектор 2, а з сектора 2 в сектор 3. Чашки інкубували при 37 °C 24 години, після цього підраховували число колоній, що виросли в різних секторах. Визначили ступені бактеріурії за кількістю виділених колоній по таблиці. Метод секторних посівів дозволяє не тільки визначити ступінь бактеріурії, але і виділити збудник захворювання в чистій культурі. У пацієнта взяли біологічний матеріал - відокремлюваний з носа, і виділили мікроорганізми, наявні в зазначеному біологічному матеріалі. Виділення мікроорганізмів здійснювали за методикою, описаною в наказі МОЗ СРСР від 22.04.1985 р. № 535, проводили посів на диференційно-діагностичні живильні середовища (середа Ендо, агар Плоскірєва, ΜΠΑ, агар Олькеницького, середовище Сабуро, жовтково-сольовий агар. Потім визначили вид мікроорганізмів. Визначення видової приналежності мікроорганізмів здійснювали відповідно до класифікації Bergy. Після цього приготували водну суспензію біоспорину і нанесли її на засіяні мікроорганізми, виділені з біоматеріалу пацієнта, як описано вище. Через 18 годин з'явилися зони затримки росту мікроорганізмів - просвітлення у вигляді смужки, що свідчило про чутливість виділених мікроорганізмів до препарату біоспорин. Пацієнт П. приймав препарат біоспорин по 1 флакону 3 рази на день протягом 10 днів. По закінченню 10 днів самопочуття пацієнта П. було в нормі. Скарги на гострі болі були відсутні. Приклад 2. Хвора С, 35 років. У пацієнтки С. був узятий біологічний матеріал, урогенітальне відокремлюване, в якому 4 ідентифіковані Staphylococcus aureus 10 КОУ - 3 ст.р. Подальші операції проводили аналогічно тому, як описано в Прикладі 1, згідно з наказом МОЗ України від 10.05.2007 № 234. Після нанесення водної суспензії біоспорину на засіяні мікроорганізми зони затримки росту у вигляді просвітлінь не були виявлені. Це свідчило про відсутність показань до лікування хворої препаратом біоспорин. Приклад 3. Хвора К., 56 років, діагноз гострий тонзиліт. Було взято біологічний матеріал, відокремлюване із зіву, в якому виявлена та ідентифікована до виду змішана культура бактерій 4 5 (Staphylococcus aureus 10 КОЕ - 3 ст. р., бактерії p. Streptococcus spp. (негемолітичний) 10 КОЕ - 4 ст. р.). Подальші операції проводили аналогічно тому, як описано в прикладі 1, згідно з наказом МОЗ України від 10.05.2007 № 234 та наказом МОЗ СРСР від 22.04.1985 р. № 535. Після нанесення водної суспензії субаліну на засіяні мікроорганізми були відзначені зони затримки росту у вигляді просвітлінь, що свідчило про чутливість виділених мікроорганізмів до препарату субалін. Приклад 4. Хворий Т., 39 років, діагноз - простатит. Досліджували відокремлюване секрету передміхурової залози. Посіви проводили, відповідно до наказу МОЗ України від 10.05.2007 № 234 та наказу МОЗ СРСР від 22.04.1985 р. № 535, аналогічно Прикладу № 1. Ідентифікували 3 мікроорганізми виду Pseudomonas aeruginosa 10 КОУ - 2 ст. р. Після нанесення водної суспензії 3 UA 109232 U 5 10 15 20 25 30 35 40 субаліну на засіяні мікроорганізми зони затримки росту у вигляді просвітлінь не були виявлені. Це свідчило про відсутність показань до лікування хворого препаратом субалін. Спосіб, що заявляється, базується на базі численних експериментів. Зокрема, протягом 2-х років регулярно виділялися культури мікроорганізмів з різних виділень (урогенітальне відокремлюване (15468), сеча (8321), виділення з очей (1253), виділення з вух (898), виділення з носа і зіву (7221), еякулят (152), секрет передміхурової залози (429), вміст акне (993), виділення з ран (129), мокротиння (128)). Чутливість мікроорганізмів до субаліну наведена в таблиці 1. Як видно з таблиці 1, субалін проявляє літичну дію на більшість видів мікроорганізмів. Найбільший його вплив відзначено на бактеріях роду Staphylococcus (S. aureus (78,4 %), S. epidermidis (84,6 %), S. haemolyticus (75,3 %), S. saprophyticus (92,2 %)). Також відзначається висока чутливість бактерій p. Enterobacteriacae (E. coli (77,5 %), Ε. aerogenes (63,2 %)) і гр. p. Candida (75,4 %). Незважаючи на те, що чутливість Proteus mirabilis (32,4 %), Proteus vulgaris (51,2 %) і Pseudomonas aeruginosa (55,5 %) нижче, ніж у вищевказаних мікроорганізмів, однак, ці результати дуже високі, оскільки дані мікроорганізми через низку своїх біологічних властивостей проявляють високу стійкість до всіх антибіотичних препаратів та бактеріологічних фагів, які отримали широке застосування в медичній практиці в останні роки. Чутливість мікроорганізмів до біоспорину приведена в таблиці 2. Згідно з даними, наведеними у таблиці 2, біоспорин має високу літичну активність до бактерій роду Staphylococcus (S. aureus (69,3 %), S. epidermidis (88,4 %), S. haemolyticus (72,1 %), S. saprophyticus (87,9 %)). Чутливість бактерій p. Enterobacteriacae (E. coli (81,2 %), E. aerogenes (71,5 %)) трохи вище, ніж чутливість цих же бактерій до субаліну. Чутливість грибів p. Candida (44,3 %) і Pseudomonas aeruginosa (32,2 %) значна нижче, ніж до субаліну (75,4 %) і (55,5 %) відповідно. Виявлено, що субалін і біоспорин проявляють високу літичну активність навіть до штамів з високою резистентністю до антибіотиків. У таблиці 3 наведено порівняльну характеристику чутливості мікроорганізмів до найбільш часто вживаних антибіотиків і антимікотиків, а також до субаліну і біоспорину. Як видно з даних, наведених у таблиці 3, гатифлоксацин більш активний, ніж субалін і біоспорин відносно E. coli (88,1 %), Streptococcus spp. (73,3 %), E. aerogenes (78,9 %). Однак, в інших випадках субалін і біоспорин показують більш високу літичну здатність. Слід зазначити, що субалін і біоспорин не токсичні, а навпаки, благотворно впливають на організм людини. Крім цього, СЕА, на відміну від антибіотиків, мають потужну протигрибкову дію, що дозволяє пригнічувати патогенну і умовно патогенну мікрофлору без прикриття протигрибковими препаратами, зменшуючи токсичне навантаження на організм. Порівняння чутливості популярного протокольного антибіотика цефтриаксону з субаліном і біоспорином (див. дані, наведені в таблиці 3) показало, що біоспорин і субалін виграють по здатності придушення УПК. Крім цього, дуже популярний в останні кілька років протигрибковий препарат ітраконазол поступається за чутливістю до грибів роду Candida в 3 і 5 разів відповідно біоспорину і субаліну. Отримані результати мають практичне значення для лікарів і підтверджують доцільність застосування способу, що заявляється. Таблиця 1 Чутливість мікроорганізмів до субаліну Вид мікроорганізму Escherichia coli Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus aureus Staphylococcus saprophyticus Streptococcus spp. Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Proteus vulgaris Enterobacter aerogenes p. Candida Чутливість, % 77,5 84,6 75,3 78,4 92,2 66,6 55,5 32,4 51,2 63,2 75,4 4 Затримка росту, % 14,0 15,4 18,7 16,2 7,4 16,6 42,6 46,3 4,5 27,3 14,8 Резистентність, % 8,5 0 6 5,4 0,4 16,8 1,9 21,3 44,3 9,5 9,8 UA 109232 U Таблиця 2 Чутливість мікроорганізмів до біоспорину Вид мікроорганізму Escherichia coli Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus aureus Staphylococcus saprophyticus Streptococcus Spp. Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Proteus vulgaris Enterobacter aerogenes p. Candida Чутливість, % 81,2 88,4 72,1 69,3 87,9 55,4 32,2 44,3 47,4 71,5 44,3 Затримка росту, % 12,5 10,4 22,3 18,5 6,8 26,6 44,5 47,8 35,6 21,8 27,9 Резистентність, % 6,3 1,2 5,6 12,2 6,3 18,0 23,3 7,9 17,0 6,7 27,8 Таблиця 3 Порівняльна характеристика чутливості мікроорганізмів до найбільш часто вживаних антибіотиків і антимікотиків, а також до субаліну і біоспорину Вид мікроорганізму Цефтриаксон, % Е. соlі S. aureus Streptococcus Spp. P. aeruginosa Ε. aerogenes p. Candida 53,2 69,1 62,3 44,1 42,2 Найменування антибіотичної речовини і СЕА ГатифАмоксиАзитроІтрако- Субалін, Біоспорин, локсацин, цилін, % міцин, % назол, % % % % 88,1 36,7 34,5 77,5 81,2 72,8 21,2 53,3 78,4 69,3 73,3 12,2 11,8 66,6 55,4 48,3 14,2 8,2 55,5 32,2 78,9 22,4 28,7 63,2 71,5 13,2 75,4 44,3 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 Спосіб визначення ефективності застосування біоспорину і субаліну для індивідуального лікування захворювань, викликаних умовно патогенною і патогенною мікробіотою, відповідно до якого з біологічного матеріалу пацієнта виділяють мікроорганізми і визначають їх вид, біоспорин і субалін розводять стерильною водою, витримують не менше 2 годин при температурі 36,9…37,1 °C в термостатованій шафі, потім визначені до виду мікроорганізми висівають на середовище Мюллер-Хінтона і Сабуро і культивують їх протягом доби, після чого наносять водні суспензії біоспорину і субаліну на засіяні культури мікроорганізмів, і через добу візуально спостерігають за їх ростом, при цьому при прояві просвітлінь в місці нанесення водних суспензій біоспорину і субаліну роблять висновок про ефективність застосування біоспорину і субаліну для лікування даного пацієнта, а за відсутності просвітлінь в місці нанесення водних суспензій біоспорину і субаліну роблять висновок про неефективність застосування біоспорину і субаліну для лікування даного пацієнта. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5