Спосіб оцінки негативного впливу оксидативного стресу на організм свиней

Реферат: Спосіб оцінки негативного впливу оксидативного стресу на організм свиней базується на аналізі системи антиоксидантного захисту за активністю ферментів каталази та супероксиддисмутази крові. Додатково визначають активність глутатіонредуктази і за комплексною картиною активності ферментів антиоксидантної системи роблять висновок про ступінь негативного впливу оксидативного стресу. UA 112833 U (54) СПОСІБ ОЦІНКИ НЕГАТИВНОГО ВПЛИВУ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕСУ НА ОРГАНІЗМ СВИНЕЙ UA 112833 U UA 112833 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі ветеринарної медицини, зокрема ветеринарної токсикології, а саме до способів оцінки негативного впливу оксидативного стресу на організм свиней. Заявлений спосіб може бути використаний у господарствах із різними формами власності, що вирощують і утримують свиней в умовах оксидативного стресу. Відомий спосіб оцінки негативного впливу оксидативного стресу на окремі органи і системи організму тварин, що базується на оцінці змін у функціонуванні процесів травлення і сечовиділення [Гуфрій Д.Ф. Зміни функції шлунково-кишкового тракту у бугайців під впливом нітратів і нітритів // Матер, доп. Міжнарод. конф. присв. 110 роковинам заснування Львівського зоовет. Ін-ту, Львів, 1991. - С. 13-14]. Недоліком даного способу є те, що за допомогою його можна діагностувати оксидаційний стрес тільки при тяжкому ступені гострого перебігу токсикозу. Відомі також гематологічні способи виявлення негативного впливу оксидативного стресу на тваринний організм [Дмитров С., Джуров Α., Антонов С. Диагностика отравлений животных. - М.: Агропромиздат, 1986. – 282 с.; Барабой В.А. Перекисное окисление липидов и стресс / В.А. Барабой, И.И. Брехман, В.Г. Головитин // - СПб.: Наука, 1992. - 268 с.; Гуфрій А.Д. Вплив фенарону та аміназину на активність ферментів антиоксидантної системи слизової оболонки тонких кишок бичків за розвитку транспортного стресу / А.Д. Гуфрій // Науково-технічний бюлетень Ін-ту біології тварин УААН. - 2004. - Вип. 5, № 1-2. – С. 80-83; Макеев Α.Α. Морфофункциональная оценка и возможность коррекции окислительного стресса у свиней в условиях промышленной технологии: автореф. дис. на достиж. научн. степени канд. биол. наук / А.А. Макеев. - Новосибирск, 2007. - 22 с.]. Способи включають оцінку реактивності організму за оксидативного стресу шляхом визначення деяких гематологічних та імунологічних показників у крові тварин (кількість гемоглобіну, метгемоглобіну, еритроцитів, лейкоцитів, аналіз лейкограм, загальний білок, сечовина, цукор, інсулін, каталаза). Ці способи включають комплексний підхід до оцінки патології різних ступенів тяжкості, однак зазначені показники гематологічних досліджень не дозволяють оцінити ступінь впливу оксидативного стресу на організм свиней. Найбільш близьким по суті до способу, що заявляється, є спосіб визначення стану антиоксидантної системи в організмі свиней [Патент України на корисну модель № 106775 "Спосіб оцінки ступеня негативного оксидативного стресу на організм свиней"]. Спосіб полягає у визначенні активності ферментів каталази та супероксиддисмутази в крові свиней. За каталазою і супероксиддисмутазою оцінюють стан системи антиоксидантного захисту організму свиней за розвитку оксидативного стресу. Заявлений спосіб і прототип мають спільні суттєві ознаки, а саме базуються на аналізі системи антиоксидантного захисту за активністю ферментів каталази та супероксиддисмутази. Недоліком відомого способу є недостатня його точність, оскільки він не повністю відображає оцінку оксидативного стресу у свиней тому, що за активністю каталази та супероксиддисмутази важко робити висновок про ступінь оксидативного стресу організму свиней. Заявлений нами спосіб усуває недоліки і повністю відображає ступінь оксидативного стресу у свиней, і забезпечує об'єктивну оцінку негативного впливу оксидативного стресу на організм свиней. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити ефективний і об'єктивний спосіб виявлення і оцінки ступеня негативного впливу оксидативного стресу на організм свиней, зручний і доступний у використанні, економічно вигідний для господарств, у яких він застосовується. Технічний результат досягають тим, що для оцінки ступеня негативного впливу оксидативного стресу у свиней за активністю ферментів крові додатково визначають глутатіонредуктазу і за комплексною картиною активності ферментів антиоксидантної системи крові роблять висновок про ступінь негативного впливу оксидативного стресу, при цьому: - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,29-1,40 нмоль/хв. на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 33,80-36,00 УО/хв. на 1 мг білка, активність глутатіонредуктази - в межах 25,30-40,15 нмоль NADH /хв. на мг білка вважають клінічно здоровими; - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,18-1,28 нмоль/хв. на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 24,5-31,5 УО/хв. на 1 мг білка, глутатіонредуктази - в межах 12,5-24,0 нмоль NADH/хв. на мг білка, вважають частково ураженими впливом оксидативного стресу, які потребують корекції системи антиоксидантного захисту організму шляхом застосування природних або синтетичних антиоксидантів, вітамінів; - тварини, у яких активність каталази є меншою 0,88 нмоль/хв. на мг білка, активність супероксиддисмутази - меншою 19,0 УО/хв. на 1 мг білка, глутатіонредуктази - меншою 10,0 1 UA 112833 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нмоль NADH/хв. на мг білка, вважають ураженими впливом оксидативного стресу із явищами незворотного порушення обміну речовин, що підлягають вибраковці. Технічний результат заявленого способу обумовлений роллю ферментів антиоксидантного захисту, яку вони відіграють в обміні речовин, та зміною їх активності під впливом навантаження нітратами та нітритами. Дія нітритів на організм тварин супроводжується утворенням в крові метгемоглобіну, де двовалентне залізо гемоглобіну окиснюється до тривалентного. Процес окиснення гемоглобіну реалізується через взаємодію його оксиформи з нітрит-іоном по ланцюговому шляху. В процесі окиснення оксигемоглобіну активні форми кисню включаються як безпосередні учасники елементарних стадій, продуценти токсичного для організму перекису водню, які також приймають участь в реакціях окиснення оксигемоглобіну. Даному патологічному процесу запобігає багатокомпонентна система антиоксидантного захисту організму. Велику роль відіграє глутатіонредектаза, каталаза та супероксиддисмутаза. Глутатіонредуктаза (ГР) локалізується в мітохондріальному матриксі та цитозолі. Цей фермент входить до складу глутатіонової системи антиоксидантного захисту. Активність глутатіонової системи антиоксидантного захисту в значній мірі залежить від інтенсивності відновлення глутатіону. ГР забезпечує відновлення глутатіону за допомогою NADPH·H і NADPH, що є донорами водню. Каталаза відновлює Н2О2 до води. До активного центру ферменту входить тривалентне залізо, протопорфірін, який взаємодіє з перекисом водню за каталазним або пероксидазним механізмом, в залежності від концентрації субстрату. Супероксиддисмутаза - це ключовий фермент антирадикального захисту. Вона дисмутує супероксидрадикал до менш токсичного перекису водню. Залежно від мікроелементу, що знаходиться в активному центрі ферменту, виділяють Fe-, Zn-, Сu- та Mn-залежні СОД. Метали виконують каталітичну функцію. Вони послідовно відновлюються і окиснюються в активному центрі ферменту. Fe-залежна СОД у більшій кількості знаходиться в еритроцитах, Zn-, Cuзалежна - у цитоплазмі, а Mn-залежна - у мітохондріях. Отже, зазначений нами спосіб забезпечує більш точну оцінку ступеня негативного впливу оксидативного стресу на організм свиней. При проведенні патентно-інформаційного пошуку авторами і заявником виявлено технічне рішення (Патент України на корисну модель № 106775 "Спосіб оцінки ступеня негативного оксидативного стресу на організм свиней"), що містить найбільшу кількість суттєвих ознак, спільних із заявленим способом: спосіб базується на аналізі стану системи антиоксидантного захисту за активністю ферментів крові, зокрема каталази та супероксиддисмутази. Але наявність зазначених спільних із прототипом ознак недостатня для одержання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю б співпадали із заявленим, не виявлено. В патентній і науково-технічній літературі не знайдено технічних рішень, в яких були б описані відомості про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від прототипу і забезпечують досягнення технічного результату тим, що виявлення оцінки ступеня негативного впливу оксидативного стресу на організм свиней здійснюють, аналізуючи ферментну активність системи антиоксидантного захисту крові організму, додатково визначаючи активність глутатіонредуктази і за комплексною картиною активності ферментів антиоксидантної системи роблять висновок про ступінь негативного впливу оксидативного стресу, при цьому: - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,29-1,40 нмоль/хв. на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 33,80-36,00 УО/хв. на 1 мг білка, активність глутатіонредуктази - в межах 25,30-40,15 нмоль NADH/хв. на мг білка вважають клінічно здоровими; - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,18-1,28 нмоль/хв. на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 24,5-31,5 УО/хв. на 1 мг білка, глутатіонредуктази - в межах 12,5-24,0 нмоль NADH/хв. на мг білка, вважають частково ураженими впливом оксидативного стресу, які потребують корекції системи антиоксидантного захисту організму шляхом застосування природних або синтетичних антиоксидантів, вітамінів; - тварини, у яких активність каталази є меншою 0,88 нмоль/хв., на мг білка, активність супероксиддисмутази - меншою 19,0 УО/хв. на 1 мг білка, глутатіонредуктази - меншою 10,0 нмоль NADH/хв. на мг білка, вважають ураженими впливом оксидативного стресу із явищами незворотного порушення обміну речовин, що підлягають вибраковці. Корисна модель належить до галузі ветеринарної медицини, зокрема ветеринарної токсикології, а саме до способів оцінки ступеня негативного впливу оксидативногостресу на 2 UA 112833 U 5 10 15 20 25 30 35 організм свиней. Заявлений спосіб може бути використаний у господарствах із різними формами власності, що вирощують і утримують свиней в умовах нітратно-нітритного навантаження, тобто при підвищенні рівня нітратів і нітритів у кормах, а тому заявлений спосіб відповідає критерію корисної моделі "промислова придатність". Заявлений спосіб здійснюють наступним чином. У свинарських господарствах для виявлення і оцінки ступеня негативного впливу оксидативного стресу на організм свиней, які перебувають в умовах нітратно-нітритного навантаження, відбирають кров. Визначають: каталазу (за методом Баха і Зубкової), супероксиддисмутазу (за методом Чеварі), глутатіонредуктази (за методом В.В. Лемешко і співавт.). Аналіз одержаних результатів здійснюють наступним чином: - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,29-1,40 нмоль/хв. на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 33,80-36,00 УО/хв. на 1 мг білка, активність глутатіонредуктази - в межах 25,30-40,15 нмоль NADH/хв. на мг білка вважають клінічно здоровими; - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,18-1,28 нмоль/хв. на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 24,5-31,5 УО/хв. на 1 мг білка, глутатіонредуктази - в межах 12,5-24,0 нмоль NADH/хв. на мг білка, вважають частково ураженими впливом оксидативного стресу, які потребують корекції системи антиоксидантного захисту організму шляхом застосування природних або синтетичних антиоксидантів, вітамінів; - тварини, у яких активність каталази є меншою 0,88 нмоль/хв. на мг білка, активність супероксиддисмутази - меншою 19,0 УО/хв. на 1 мг білка, глутатіонредуктази - меншою 10,0 нмоль NADH/хв. на мг білка, вважають ураженими впливом оксидативного стресу із явищами незворотного порушення обміну речовин, що підлягають вибраковці. Ефективність заявленого способу та його переваги перед прототипом підтверджені прикладом конкретного виконання. У господарстві ДП "Молочні ріки" ТзОВ "Правда" Буського району, Львівської області було відібрано 30 поросят великої білої породи тримісячного віку. Було створено 6 груп по 5 тварин у кожній. Тварини контрольної групи знаходились на звичайному раціоні, згідно з нормами ВІТА. Тваринам дослідних груп створювали штучно нітратне навантаження, а саме: Дослідна 1 - тваринам згодовували з комбікормом нітрат натрію у дозі 0,2 г NO 3 /кг маси тіла; Дослідна 2 - тваринам згодовували з комбікормом нітрат натрію у дозі 0,3 г NO 3 /кг маси тіла; Дослідна 3 - тваринам згодовували з комбікормом нітрат натрію у дозі 0,4 г NO3 /кг маси тіла; Дослідна 4 - тваринам згодовували з комбікормом нітрат натрію у дозі 0,5 г NO 3 /кг маси тіла; Дослідна 5 - тваринам згодовували з комбікормом нітрат натрію у дозі 0,6 г NO 3 /кг маси тіла. Кров для аналізу брали з краніальної порожнистої вени на 1, 3, 6, 9 годину після згодовування нітрату натрію. Основні показники активності ферментів антиоксидантної системи як дослідних, так і контрольної груп подані у таблицях 1 і 2. 40 Таблиця 1 Активність антиоксидантної системи свиней контрольної групи. Активність ферментів Супероксиддисмутаза Каталаза Глутатіонредуктаза 45 50 34,48±1,2 1,35±0,08 30,5±1,5 Одиниці виміру УО/хв. на 1 мг білка нмоль/хв. на мг білка нмоль NADH /хв. на мг білка При цьому за прототипом у тварин всіх груп визначали активність каталази та супероксиддисмутази. Так, у тварин контрольної групи активність каталази була в межах 1,291,40 нмоль/хв. на мг білка, супероксиддисмутази - 33,80-36,00 УО/хв. на мг білка. При згодовуванні нітрату натрію у різних дозах активність каталази та супероксиддисмутази почала знижуватись, а саме при згодовуванні нітрату натрію у дозах 0,2 і 0,3 г NO 3 /кг маси тіла активність каталази коливалася у межах 1,18-1,28 нмоль/хв. на мг білка, активність супероксиддисмутази коливалася у межах 27,1-34,48 УО/хв. на мг білка, а при дозах 0,4-0,6 г NO3 /кг маси тіла - каталази у межах 0,70-1,05 нмоль/хв. на мг білка, супероксиддисмутази - у межах 18,35-29,48 УО/хв. на мг білка. 3 UA 112833 U 5 10 15 20 25 На підставі даних активності каталази та супероксиддисмутази важко робити висновок про ступінь негативного впливу оксидативного стресу на систему антиоксидантного захисту організму свиней. При додатковому визначенні активності глутатіонредуктази ступінь негативного впливу оксидативного стресу на організм свиней проявляється більш повно. Так, у тварин контрольної групи активність глутатіонредуктази знаходилася в межах 30,50±1,5 нмоль NADH/хв. на мг білка. Згідно з даними таблиці 2, у дослідних тварин, яким згодовували нітрат натрію у різних дозах, активність глутатіонредуктази крові свиней мала певні відхилення. Так, із збільшенням дози нітрату натрію активність глутатіонредуктази знижувалася. У тварин, яким згодовували нітрат натрію у дозі 0,2 г NO 3 /кг маси тіла, активність глутатіонредуктази коливалася у межах 30,7±1,2-20,5±0,9 нмоль NADH/хв. на мг білка. У тварин, яким згодовували нітрат натрію у дозі 0,3 г NO 3 /кг маси тіла, активність глутатіонредуктази коливалася у межах 30,5±1,5-16,9±1,3 нмоль NADH/хв. на мг білка. У тварин, яким згодовували нітрат натрію у дозі 0,4 г NO3 /кг маси тіла, активність глутатіонредуктази коливалася у межах 29,5±1,0-12,5±1,0 нмоль NADH/хв. на мг білка. У тварин, яким згодовували нітрат натрію у дозі 0,5 г NO 3 /кг маси тіла, активність глутатіонредуктази коливалася у межах 27,6±1,1-10,5±0,5 нмоль NADH/хв. на мг білка. У тварин, яким згодовували нітрат натрію у дозі 0,6 г NO 3 /кг маси тіла, активність глутатіонредуктази коливалася у межах 25,5±1,0-9,5±1,1 нмоль NADH/хв. на мг білка. Таким чином при активності ферментів крові: каталази, супероксиддисмутази та глутатіонредуктази, можна вважати, що тварини які одержували з кормом нітрат натрію у дозах 0,2-0,3 г NO3 /кг маси тіла це тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,18-1,28 нмоль/хв. на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 24,5-31,5 УО/хв. на мг білка, активність глутатіонредуктази - в межах 12,5-24,0 нмоль NADH /хв. на мг білка, які потребують корекції системи антиоксидантного захисту організму, застосуванням природних або синтетичних антиоксидантів, вітамінів. Таблиця 2 Активність антиоксидантної системи крові свиней за нітратного Навантаження Доз аг ΝΟ3/κг 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 30 35 Активність ферментів Супероксиддисмутаза Каталаза Глутатіонредуктаза Супероксиддисмутаза Каталаза Глутатіонредуктаза Супероксиддисмутаза Каталаза Глутатіонредуктаза Супероксиддисмутаза Каталаза Глутатіонредуктаза Супероксиддисмутаза Каталаза Глутатіонредуктаза Після введення препарату через (годин) 1 3 6 9 34,48±1,2 32,56±1,1 29,68±1,2 32,35±1,2 1,33±0,08 1,31±0,08 1,28±0,08 1,30±0,08 30,7±1,2 25,5±1,2 20,5±0,9 24,5±1,1 30,30±0,9 29,68±1,2 27,10±1,2 30,05±1,1 1,31±0,07 1,24±0,08 1,18±0,08 1,25±0,08 30,5±1,5 24,5±1,5 16,9±1,3 22,5±1,0 29,45±1,2 25,83±0,9 20,48±1,0 27,15±1,0 1,25±0,07 1,19±0,07 1,10±0,06 1,20±0,08 29,5±1,0 18,5±1,1 12,5±1,0 14,1±07 27,48±1,1 20,18±1,2 18,80±0,7 22,48±1,2 1,19±0,06 1,05±0,08 0,88±0,06 1,02±0,07 27,6±1,1 13,0±0,8 10,5±0,5 12,5±1,2 25,87±1,0 19,48±1,0 18,35±0,8 20,88±1,0 1,02±0,06 0,87±0,08 0,70±0,08 0,85±0,08 25,5±1,0 11,2±1,0 9,5±1,1 10,3±0,5 А тварини, які одержували з кормом нітрат натрію у дозах 0,4-0,6 г NO3 /кг маси тіла, це тварини, у яких активність каталази є меншою 0,88 нмоль/хв. на мг білка, активність супероксиддисмутази - меншою 19,0 УО/хв. на мг білка, активність глутатіонредуктази - меншою 10,0 нмоль NADH/хв. на мг білка, вважають ураженими впливом високого рівню нітратів і нітритів у кормах із явищами незворотного порушення обміну речовин. Отже, заявлений нами спосіб є точним і об'єктивним та дозволяє виявити ступінь негативного впливу нітратного навантаження на організм свиней. 4 UA 112833 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 20 Спосіб оцінки негативного впливу оксидативного стресу на організм свиней, який базується на аналізі системи антиоксидантного захисту за активністю ферментів каталази та супероксиддисмутази крові, який відрізняється тим, що додатково визначають активність глутатіонредуктази і за комплексною картиною активності ферментів антиоксидантної системи роблять висновок про ступінь негативного впливу оксидативного стресу, при цьому: - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,29-1,40 нмоль/хв. на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 33,80-36,00 УО/хв. на 1 мг білка, активність глутатіонредуктази - в межах 25,30-40,15 нмоль NADH/хв. на мг білка вважають клінічно здоровими; - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,18-1,28 нмоль/хв. на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 24,5-31,5 УО/хв. на 1 мг білка, глутатіонредуктази - в межах 12,5-24,0 нмоль NADH/хв. на мг білка, вважають частково ураженими впливом оксидативного стресу, які потребують корекції системи антиоксидантного захисту організму шляхом застосування природних або синтетичних антиоксидантів, вітамінів; - тварини, у яких активність каталази є меншою 0,88 нмоль/хв. на мг білка, активність супероксиддисмутази - меншою 19,0 УО/хв. на 1 мг білка, глутатіонпероксидази - меншою 10,0 нмоль NADH/хв. на мг білка, вважають ураженими впливом оксидативного стресу із явищами незворотного порушення обміну речовин, що підлягають вибраковці. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5