Спосіб оцінки ступеня негативного впливу оксидаційного стресу на організм свиней

Реферат: Спосіб оцінки ступеня негативного впливу оксидаційного стресу на організм свиней включає аналіз системи антиоксидантного захисту за активністю ферментів каталази та супероксиддисмутази крові. Додатково визначають рівень гідроперекисів ліпідів та дієнових кон'югатів і за комплексною картиною активності ферментів антиоксидантної системи та продуктів перекисного окиснення ліпідів судять про ступінь негативного впливу оксидаційного стресу. UA 106775 U (12) UA 106775 U UA 106775 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі ветеринарної медицини, зокрема ветеринарної токсикології, а саме до способів оцінки негативного впливу оксидаційного стресу на організм свиней. Заявлений спосіб може бути використаний у господарствах із різними формами власності, що вирощують і утримують свиней в умовах оксидаційного стресу. Відомий спосіб оцінки негативного впливу оксидаційного стресу на окремі органи і системи організму тварин, що базується на оцінці змін у функціонуванні процесів травлення і сечовиділення (Гуфрій Д.Ф. Зміни функції шлунково-кишкового тракту у бугайців під впливом нітратів і нітритів //Матер, доп. Міжнарод. конф. присв. 110 роковинам заснування Львівського зоовет. Ін-ту, Львів, 1991. - С. 13-14). Недоліком даного способу є те, що за допомогою його можна діагностувати оксидаційний стрес тільки при важкому ступені гострого перебігу токсикозу. Відомі також гематологічні способи виявлення негативного впливу оксидаційного стресу на тваринний організм (Дмитров С, Джуров Α., Антонов С. Диагностика отравлений животных. - М.: Агропромиздат, 1986. – 282 с.; Барабой В.А. Перекисное окисление липидов и стресс /В.А. Барабой, И.И. Брехман, В.Г. Головитин // - СПб.: Наука, 1992. - 268 с.; Гуфрій А.Д. Вплив фенарону та аміназину на активність ферментів антиоксидантної системи слизової оболонки тонких кишок бичків за розвитку транспортного стресу /А.Д. Гуфрій //Науково-Технічний бюлетень Ін-ту біології тварин УААН. 2004. - Вип. 5, № 1-2. – С. 80-83; Макеев Α.Α. Морфофункциональная оценка и возможность коррекции окислительного стресса у свиней в условиях промышленной технологии: автореф. дис. на здобуття наук, ступеня канд. биол. наук /А.А. Макеев. - Новосибирск, 2007. - 22 с.). Способи включають оцінку реактивності організму за оксидаційного стресу шляхом визначення деяких гематологічних та імунологічних показників у крові тварин (кількість гемоглобіну, метгемоглобіну, еритроцитів, лейкоцитів, аналіз лейкограм, загальний білок, сечовину, цукор, інсулін, каталазу). Ці способи включають комплексний підхід до оцінки патології різних ступенів важкості, однак зазначені показники гематологічних досліджень не дозволяють оцінити ступінь впливу оксидаційного стресу на організм свиней. Найближчим аналогом є спосіб визначення стану антиоксидантної системи в організмі свиней Патент України на корисну модель № 65511 Спосіб оцінки ступеня негативного впливу нітритів на організм свиней. Спосіб полягає у визначенні в крові свиней при нітратно-нітритному навантаженні активності ферментів каталази та супероксиддисмутази. За каталазою і супероксиддисмутазою оцінюють стан системи антиоксидантного захисту організму свиней за розвитку оксидаційного стресу, викликаного нітратно-нітритним навантаженням. Корисна модель і найближчий аналог мають спільні суттєві ознаки, а саме базується на аналізі системи антиоксидантного захисту за активністю ферментів каталази та супероксиддисмутази. Недоліком даного способу є недостатня його точність, оскільки він не повністю відображає оцінку оксидаційного стресу у свиней, тому що за активністю ензимів антиоксидантної системи важко судити про ступінь оксидаційного стресу організму викликаного нітратним навантаженням. Заявлений спосіб усуває недоліки і повністю відображає ступінь оксидаційного стресу у свиней і забезпечує об'єктивну оцінку негативного впливу оксидаційного стресу на організм свиней. В основу корисної моделі поставлена задача розробити ефективний і об'єктивний спосіб виявлення і оцінки ступеня негативного впливу оксидаційного стресу на організм свиней, зручний і доступний у використанні, економічно вигідний для господарств, у яких він застосовується. Поставлена задача вирішується тим, що для оцінки ступеня негативного впливу оксидаційного стресу у свиней за активністю ферментів кров, згідно з корисною моделлю додатково визначають гідроперекисів ліпідів та дієнових кон'югатів і за комплексною картиною активності ферментів антиоксидантної системи та продуктів перекисного окиснення ліпідів крові судять про ступінь негативного впливу оксидаційного стресу, при цьому: - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,29-1,40 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 33,80-36,00 УО/хв на 1 мг білка, рівень гідроперекисів ліпідів - в межах 0,60-0,71 ОЕ/мл, рівень дієнових кон'югатів - в межах 6,40-6,80 Мкмоль/л вважають клінічно здоровими; - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,18-1,28 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 24,5-31,5 УО/хв на 1 мг білка, рівень гідроперекисів ліпідів - в межах 0,72-1,30 ОЕ/мл, рівень дієнових кон'югатів - в межах 6,81-9,05 Мкмоль/л 1 UA 106775 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 вважають частково ураженими впливом оксидаційного стресу, які потребують корекції системи антиоксидантного захисту організму шляхом застосування природних або синтетичних антиоксидантів, вітамінів; - тварини, у яких активність каталази є меншою 0,88 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - меншою 19,0 УО/хв на 1 мг білка, рівень гідроперекисів ліпідів є більшим 1,40 ОЕ/мл, рівень дієнових кон'югатів є більшим 9,57 Мкмоль/л вважають ураженими впливом оксидаційного стресу за високого рівня нітратів і нітритів у кормах із явищами незворотного порушення обміну речовин, що підлягають вибраковці. Технічний результат заявленого способу обумовлений роллю комплексу перекисного окиснення ліпідів та ферментів антиоксидантного захисту, які вони відіграють в обміні речовин та зміною їх активності та рівня, наприклад під впливом навантаження нітратами та нітритами. Дія нітритів на організм тварин супроводжується утворенням в крові метгемоглобіну, де двовалентне залізо гемоглобіну окиснюється до тривалентного. Процес окиснення гемоглобіну реалізується через взаємодію його оксиформи з нітрит-іоном по ланцюговому шляху. При окисненні гемоглобіну утворюється цілий ряд радикальних метаболітів, які є активними окисниками біологічних субстратів, надають виражену цитотоксичну дію, ініціюють процеси перекисного окиснення ліпідів у результаті чого накопичуються первинні і вторинні продукти (гідроперекиси ліпідів та дієнові кон'югати). В процесі окиснення оксигемоглобіну активні форми кисню включаються як безпосередні учасники елементарних стадій, продуценти токсичного для організму перекису водню, також які приймають участь в реакціях окиснення оксигемоглобіну. Даному патологічному процесу запобігає багатокомпонентна система антиоксидантного захисту організму. Велику роль відіграє каталаза та супероксиддисмутаза. Каталаза відновлює Н2О2 до води. До активного центру ферменту входить тривалентне залізо, протопорфірин, який взаємодіє з перекисом водню за каталазним або пероксидазним механізмом, в залежності від концентрації субстрату. Супероксиддисмутаза - це ключовий фермент антирадикального захисту. Вона дисмутує супероксидрадикал до менш токсичного перекису водню. Залежно від мікроелементу, що знаходиться в активному центрі ферменту, виділяють Fe-, Zn-Cu- та Mn-залежні СОД. Метали виконують каталітичну функцію. Вони послідовно відновлюються і окиснюються в активному центрі ферменту. Fe-залежна СОД у більшій кількості знаходиться в еритроцитах, Zn-Cuзалежна - у цитоплазмі, а Мn-залежна - у мітохондріях. Отже, зазначений нами спосіб забезпечує більш точну оцінку ступеня негативного впливу оксидаційного стресу на організм свиней. При проведенні патентно-інформаційного пошуку авторами і заявником виявлена корисна модель (Патент України на корисну модель № 65511 Спосіб оцінки ступеня негативного впливу нітритів на організм свиней), що містить найбільшу кількість суттєвих ознак, спільних із заявленим способом: спосіб базується на аналізі стану системи антиоксидантного захисту за активністю ферментів крові, зокрема каталази та супероксиддисмутази. Виявлення оцінки ступеня негативного впливу оксидаційного стресу на організм свиней здійснюють, аналізуючи ферментну активність системи антиоксидантного захисту крові організму, додатково визначаючи рівень гідроперекисів ліпідів, дієнових кон'югатів і за комплексною картиною активності ферментів антиоксидантної системи та продуктів перекисного окиснення ліпідів судять про ступінь негативного впливу оксидаційного стресу, при цьому: - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,29-1,40 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 33,80-36,00 УО/хв на 1 мг білка, рівень гідроперекисів ліпідів – в межах 0,60-0,71 ОЕ/мл, рівень дієнових кон'югатів - в межах 6,40-6,80 Мкмоль/л вважають клінічно здоровими; - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,18-1,28 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 24,5-31,5 УО/хв на 1 мг білка, рівень гідроперекисів ліпідів - в межах 0,72-1,30 ОЕ/мл, рівень дієнових кон'югатів - в межах 6,81-9,05 Мкмоль/л вважають частково ураженими впливом оксидаційного стресу, які потребують корекції системи антиоксидантного захисту організму шляхом застосування природних або синтетичних антиоксидантів, вітамінів; - тварини, у яких активність каталази є меншою 0,88 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - меншою 19,0 УО/хв на 1 мг білка, рівень гідроперекисів ліпідів є більшим 1,40 ОЕ/мл, рівень дієнових кон'югатів є більшим 9,57 Мкмоль/л вважають ураженими впливом оксидаційного стресу за високого рівня нітратів і нітритів у кормах із явищами незворотного порушення обміну речовин, що підлягають вибраковці. 2 UA 106775 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Корисна модель належить до галузі ветеринарної медицини, зокрема ветеринарної токсикології, а саме до способів оцінки ступеня негативного впливу оксидаційного стресу на організм свиней. Заявлений спосіб може бути використаний у господарствах із різними формами власності, що вирощують і утримують свиней в умовах нітратно-нітритного навантаження, тобто при підвищенні рівня нітратів і нітритів у кормах, а тому заявлений спосіб відповідає критерію винаходу (корисної моделі) "промислова придатність". Запропонований спосіб здійснюють наступним чином: У тваринницьких господарствах в умовах нітратно-нітритного навантаження, (одержуючи тривалий час корми з підвищеною кількістю нітратів) для виявлення і оцінки ступеня негативного впливу оксидаційного стресу на організм свиней відбирають кров у тварин різних вікових груп. У крові визначають: каталазу (за методом Баха і Зубкової), супероксиддисмутазу (за методом Чеварі), концентрацію гідроперекисів ліпідів - ГПЛ (Мирончик В.В., 1984); рівень дієнових кон'югатів - ДК (Стальна І.Д., 1977). Аналіз одержаних результатів здійснюють наступним чином: - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,29-1,40 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 33,80-36,00 УО/хв на 1 мг білка, рівень гідроперекисів ліпідів - в межах 0,60-0,71 ОЕ/мл, рівень дієнових кон'югатів - в межах 6,40-6,80 Мкмоль/л вважають клінічно здоровими; - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,18-1,28 нмоль/хв x мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 24,5-31,5 УО/хв на 1 мг білка, рівень гідроперекисів ліпідів - в межах 0,72-1,30 ОЕ/мл, рівень дієнових кон'югатів - в межах 6,81-9,05 Мкмоль/л вважають частково ураженими впливом оксидаційного стресу, які потребують корекції системи антиоксидантного захисту організму шляхом застосування природних або синтетичних антиоксидантів, вітамінів; - тварини, у яких активність каталази є меншою 0,88 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - меншою 19,0 УО/хв на 1 мг білка, рівень гідроперекисів ліпідів є більшим 1,40 ОЕ/мл, рівень дієнових кон'югатів є більшим 9,57 Мкмоль/л вважають ураженими впливом оксидаційного стресу за високого рівня нітратів і нітритів у кормах із явищами незворотного порушення обміну речовин, що підлягають вибраковці. Ефективність заявленого способу та його переваги перед прототипом підтверджені прикладом конкретного виконання. У господарстві ДП "Молочні ріки" ТзОВ "Правда" Буського району, Львівської області було відібрано 30 поросят великої білої породи тримісячного віку. Було створено 6 груп по 5 тварин у кожній. Тварини контрольної групи знаходились на звичайному раціоні, згідно з нормами ВІТА. Тваринам дослідних груп створювали штучно нітратне навантаження, а саме: дослідна 1 - тваринам згодовували з комбікормом нітрат натрію у дозі 0,2 г ΝΟ3 /кгмаси тіла; дослідна 2 - тваринам згодовували з комбікормом нітрат натрію у дозі 0,3 г ΝΟ3 /кг маси тіла; дослідна 3 - тваринам згодовували з комбікормом нітрат натрію у дозі 0,4 г ΝΟ3 /кг маси тіла; дослідна 4 - тваринам згодовували з комбікормом нітрат натрію у дозі 0,5 г ΝΟ3 /кг маси тіла; дослідна 5 - тваринам згодовували з комбікормом нітрат натрію у дозі 0,6 г ΝΟ3 /кг маси тіла. Кров для аналізу брали з краніальної порожнистої вени на 1, 3, 6, 9 годину після згодовування нітрату натрію. Основні показники активності ферментів антиоксидантної системи та інтенсивності перекисного окиснення ліпідів як дослідних, так і контрольної груп подані у таблицях 1 і 2. 45 Таблиця 1 Активність антиоксидантної системи та інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів свиней контрольної групи. Активність ферментів Супероксиддисмутаза Каталаза Гідроперекиси ліпідів Дієнові кон'югати 50 34,48±1,2 1,35±0,08 0,68±0,01 6,51±0,23 Одиниці виміру УО/хв на 1 мг білка нмоль/хв на мг білка ОЕ/мл Мкмоль/л При цьому за найближчим аналогом, у тварин всіх груп визначали активність каталази та супероксиддисмутази. Так, у тварин контрольної групи активність каталази була в межах 1,291,40 нмоль/хв на мг білка, супероксиддисмутази 33,80-36,00 УО/хв на 1 мг білка. При згодовуванні нітрату натрію у різних дозах активність каталази та супероксиддисмутази почала 3 UA 106775 U 5 10 15 20 25 30 35 знижуватись, а саме при згодовуванні нітрату натрію у дозах 0,2 і 0,3 г ΝΟ3 /кг маси тіла активність каталази коливалася у межах 1,18-1,28 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази коливалася у межах 27,1-34,48 УО/хв на 1 мг білка, а при дозах 0,4-0,6 г ΝΟ3 /κг маси тіла - каталази у межах 0,70-1,05 нмоль/хв на мг білка, супероксиддисмутази - у межах 18,35-29-48 УО/хв на 1 мг білка. На підставі даних активності каталази та супероксиддисмутази важко робити висновок про ступінь негативного впливу оксидаційного стресу на систему антиоксидантного захисту організму свиней. При додатковому визначенні рівня гідроперекисів ліпідів та дієнових кон'югатів, ступінь негативного впливу оксидаційного стресу на організм свиней проявляється більш повно. Так, у тварин контрольної групи показники рівня гідроперекисів ліпідів знаходилися в межах 0,68-0,75 ОЕ/мл, рівня дієнових кон'югатів - у межах 6,51-6,80 Мкмоль/л. Згідно з даними таблиці у дослідних тварин, яким згодовували нітрат натрію у різних дозах, показники рівня продуктів перекисного окиснення ліпідів крові свиней мали певні відхилення. Так, із збільшенням дози нітрату натрію рівень продуктів перекисного окиснення ліпідів зростає. У тварин, яким згодовували нітрат натрію у дозі 0,2 г ΝΟ3 /кг маси тіла, показники рівня продуктів перекисного окиснення ліпідів знаходилися у таких межах: гідроперекисів ліпідів 0,811,05 ОЕ/мл, дієнових кон'югатів 7,10-8,55 Мкмоль/л У тварин, яким згодовували нітрат натрію у дозі 0,3 г ΝΟ3 /кг маси тіла, показники рівня продуктів перекисного окиснення ліпідів знаходилися у таких межах: гідроперекисів ліпідів 0,911,25 ОЕ/мл, дієнових кон'югатів 7,34-9,05 Мкмоль/л. У тварин, яким згодовували нітрат натрію у дозі 0,4 г ΝΟ3 /кг маси тіла, показники рівня продуктів перекисного окиснення ліпідів знаходилися у таких межах: гідроперекисів ліпідів 0,961,30 ОЕ/мл, дієнових кон'югатів 7,45-9,30 Мкмоль/л У тварин, яким згодовували нітрат натрію у дозі 0,5 г ΝΟ3 /кг маси тіла, показники рівня продуктів перекисного окиснення ліпідів знаходилися у таких межах: гідроперекисів ліпідів 0,991,40 ОЕ/мл, дієнових кон'югатів 7,51-9,57 Мкмоль/л. У тварин, яким згодовували нітрат натрію у дозі 0,6 г ΝΟ3 /кг маси тіла, показники рівня продуктів перекисного окиснення ліпідів знаходилися у таких межах: гідроперекисів ліпідів 1,021,62 ОЕ/мл, дієнових кон'югатів 7,62-9,55 Мкмоль/л. Таким чином при активності ферментів крові: каталази, супероксиддисмутази та продуктів перекисного окиснення ліпідів: гідроперекисів ліпідів, дієнових кон'югатів, можна вважати, що тварини, які одержували з кормом нітрат натрію у дозах 0,2-0,3 г ΝΟ3 /кг маси тіла це тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,18-1,28 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 24,5-31,5 УО/хв на 1 мг білка, рівень гідроперекисів ліпідів - в межах 0,72-1,30 ОЕ/мл, рівень дієнових конюгатів - в межах 6,81-9,05 Мкмоль/л вважають частково ураженими впливом нітратів та нітритів, які потребують корекції системи антиоксидантного захисту організму, застосуванням природних або синтетичних антиоксидантів, вітамінів. 40 4 UA 106775 U Таблиця 2 Активність антиоксидантної системи та інтенсивність процесів перекисного окиснення ліпідів свиней за нітратного навантаження Доза г гΝΟ3 /κг 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Активність ферментів Супероксиддисмутаза Каталаза Гідроперекиси ліпідів Дієнові кон'югати Супероксиддисмутаза Каталаза Гідроперекиси ліпідів Дієнові кон'югати Супероксиддисмутаза Каталаза Гідроперекиси ліпідів Дієнові кон'югати Супероксиддисмутаза Каталаза Гідроперекиси ліпідів Дієнові кон'югати Супероксиддисмутаза Каталаза Гідроперекиси ліпідів Дієнові кон'югати Після введення препарату через (годин) 1 3 6 9 34,48±1,2 32,56±1,1 29,68±1,2 32,35±1,2 1,33±0,08 1,31±0,08 1,28±0,08 1,30±0,08 0,81±0,05 1,02±0,05 1,05±0,04 1,03±0,03 7,10±0,24 8,12±0,22 8,55±0,26 8,39±0,24 30,30±0,9 29,68±1,2 27,10±1,2 30,05±1,1 1,31±0,07 1,24±0,08 1,18±0,08 1,25±0,08 0,91±0,05 1,12±0,02 1,25±0,04 1,23±0,03 7,34±0,20 8,56±0,22 9,05±0,25 8,99±0,22 29,45±1,2 25,83±0,9 20,48±1,0 27,15±1,0 1,25±0,07 1,19±0,07 1,10±0,06 1,20±0,08 0,96±0,05 1,18±0,05 1,30±0,03 1,29±0,04 7,45±0,21 8,67±0,21 9,30±0,25 9,14±0,24 27,48±1,1 20,18±1,2 18,80±0,7 22,48±1,2 1,19±0,06 1,05±0,08 0,88±0,6 1,02±0,07 0,99±0,05 1,20±0,04 1,40±0,04 1,31±0,03 7,51±0,22 8,77±0,20 9,57±0,20 9,11±0,21 25,87±1,0 19,48±1,0 18,35±0,8 20,88±1,0 1,02±0,06 0,87±0,08 0,70±0,08 0,85±0,08 1,02±0,05 1,25±0,05 1,62±0,02 1,39±0,05 7,62±0,20 8,96±0,22 9,55±0,20 9,40±0,20 5 А тварини, які одержували з кормом нітрат натрію у дозах 0,4-0,6 г ΝΟ3 /кг маси тіла, це тварини, у яких активність каталази є меншою 0,88 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - меншою 19,0 УО/хв на 1 мг білка, рівень гідроперекисів ліпідів є більшим 1,40 ОЕ/мл, рівень дієнових кон'югатів є більшим 9,57 Мкмоль/л вважають ураженими впливом високого рівню нітратів і нітритів у кормах ї з явищами незворотного порушення обміну речовин. Отже, запропонований спосіб є точним і об'єктивним і дозволяє виявити ступінь негативного впливу нітратного навантаження на організм свиней. 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 25 30 Спосіб оцінки ступеня негативного впливу оксидаційного стресу на організм свиней, який базується на аналізі системи антиоксидантного захисту за активністю ферментів каталази та супероксиддисмутази крові, який відрізняється тим, що додатково визначають рівень гідроперекисів ліпідів та дієнових кон'югатів і за комплексною картиною активності ферментів антиоксидантної системи та продуктів перекисного окиснення ліпідів судять про ступінь негативного впливу оксидаційного стресу, при цьому: - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,29-1,40 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 33,80-36,00 УО/хв на 1 мг білка, рівень гідроперекисів ліпідів - в межах 0,60-0,71 ОЕ/мл, рівень дієнових кон'югатів - в межах 6,40-6,80 Мкмоль/л вважають клінічно здоровими; - тварини, у яких активність каталази знаходиться в межах 1,18-1,28 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - в межах 24,5-31,5 УО/хв на 1 мг білка, рівень гідроперекисів ліпідів - в межах 0,72-1,30 ОЕ/мл, рівень дієнових кон'югатів - в межах 6,81-9,05 Мкмоль/л вважають частково ураженими впливом оксидаційного стресу, які потребують корекції системи антиоксидантного захисту організму шляхом застосування природних або синтетичних антиоксидантів, вітамінів; - тварини, у яких активність каталази є меншою 0,88 нмоль/хв на мг білка, активність супероксиддисмутази - меншою 19,0 УО/хв на 1 мг білка, рівень гідроперекисів ліпідів є більшим 1,40 ОЕ/мл, рівень дієнових кон'югатів є більшим 9,57 Мкмоль/л вважають ураженими впливом оксидаційного стресу за високого рівня нітратів і нітритів у кормах із явищами незворотного порушення обміну речовин, що підлягають вибраковці. 5 UA 106775 U Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6