Спосіб отримання туберкуліну з культуральної рідини та бактеріальної маси мікобактерій

Реферат: Спосіб отримання туберкуліну з культуральної рідини та бактеріальної маси мікобактерій, який полягає в тому, що після накопичення та інактивації бактеріальної маси мікобактерій на синтетичному живильному середовищі Сотона туберкулін отримують комплексно: із культурального фільтрату та із бактеріальної маси мікобактерій, озвученої на ультразвуковому 2 диспергаторі при частоті ультразвуку 22 кГц та інтенсивності 90, 100, 110 Вт/см при триразовій обробці з інтервалами три хвилини, причому отримані із культурального фільтрату та із бактеріальної маси мікобактерій препарати використовують для виготовлення очищеного (ППД) туберкуліну шляхом їх змішування у співвідношенні 1:10, за рахунок чого вихід туберкуліну збільшується у 10 разів. UA 114777 U (12) UA 114777 U UA 114777 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Передбачувана корисна модель належить до ветеринарної мікробіології, імунології і біотехнології, зокрема до способів виготовлення алергенів для діагностики туберкульозу тварин та птиці, а саме до способів отримання туберкулінів з бактеріальної маси та культуральної рідини мікобактерій, що є складовою частиною технологічного процесу виготовлення згаданих препаратів. Протеїни мікобактерій, які містяться у фільтратах культур, є основою для виготовлення очищених туберкулінів для ссавців та птиці і алергенів із атипових мікобактерій (КАМ, ААМ). Принцип отримання очищеного деривату туберкулопротеїну (Purified Protein Derivativ - PPD, ППД) з культурального фільтрату мікобактерій, культивованих на синтетичному живильному середовищі, методом осадження трихлороцтовою кислотою (ТХО) лишається незмінним з часу розробки технології виробництва ППД-туберкуліну F.B. Seibert (1934, 1949). У подальшому цей метод удосконалений М.А. Лінніковою (1959) О.М. Говоровим і Ф.І. Осташко (1952, 1956) та іншими дослідниками. Існує класичний спосіб одержання туберкуліну з культурального фільтрату збудника туберкульозу, вирощеного на рідкому синтетичному живильному середовищі Сотона шляхом стерилізації культур автоклавуванням, відокремлення бактеріальної маси, одержання й стерилізації культуральних фільтратів (стерилізуюча фільтрація), осадження протеїну розчином трихлороцтової кислоти, переосадження його насиченим розчином сірчанокислого амонію, очищення від солей за допомогою діалізу з подальшим визначенням концентрації протеїну в 1 3 см розчину (Кассіч В.Ю. Мінливість мікобактерій, епізоотологічний моніторинг, засоби і заходи боротьби з туберкульозом тварин в умовах радіаційного впливу: Дис…д-ра вет.наук: 16.00.03 Харків, 2004 - 408 с.; Биотехнология: Учебник. И.В. Тихонов, Е.А. Рубан, Т.Н. Грязнева и др.; Под ред. акад. РАСХН Е.С. Воронина. - СПб.: ЗАО ГИОРД, 2005. - 792 с.) Існує також спосіб одержання туберкуліну з бактеріальної маси мікобактерій методом озвучування ультразвуком та ультрафільтрації (Авторское свидетельство № 1339922, 1987 г., Донченко А.С. с соавт.; Донченко А.С., Овдиенко Н.П., Донченко Н.А. Диагностика туберкульоза крупного рогатого скота. - Новосибирск, 2004. - 309 с.; Кассіч В.Ю. Мінливість мікобактерій, епізоотологічний моніторинг, заходи і засоби боротьби з туберкульозом тварин в умовах радіаційного впливу: Автореф. Дис… докт. вет.наук: 16.00.03 - Харків, 2004. - 42 с.; Дегтярьов І.М. Вивчення протеїногенних властивостей культур М. bovis та удосконалення способу виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців. Автореф…дис. канд. вет.наук: 16.00.03. - Харків, 2009. - 21 с.). Суттєвим недоліком усіх перелічених способів є низький вихід кінцевого продукту очищеного (ППД) туберкуліну. Найбільш близьким за суттю та досягнутими результатами до запропонованого нами способу є спосіб виготовлення моновидових алергенів атипових мікобактерій (Изготовление моновидовых аллергенов (МА): Донченко А.С., Овдиенко Н.П., Донченко Н.А. "Диагностика туберкульоза крупного рогатого скота". - Новосибирск, 2004. - 309 с.). Проте, зазначений спосіб стосується виготовлення моновидових алергенів з атипових мікобактерій, а не з виробничого штаму збудника туберкульозу, що застосовується для промислового виготовлення очищеного (ППД) туберкуліну. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб підвищення виходу кінцевого продукту (туберкуліну) при виробництві очищеного ППД-туберкуліну. Поставлену задачу вирішували шляхом того, що очищений (ППД) туберкулін з виробничого штаму М. bovis (Valle КМІЕВ 9-КМ) отримували комплексно: - з культурального фільтрату методом осадження трихлороцтовою кислотою (ТХО) і переосадження його насиченим розчином сірчанокислого амонію, очищення від солей за 3 допомогою діалізу з подальшим визначенням концентрації протеїну в 1 см розчину; - та з бактеріальної маси мікобактерій, озвученої на ультразвуковому диспергаторі УЗДН-Т 2 (або іншої модифікації) при частоті ультразвуку 22 кГц та інтенсивності 90, 100, 110 Вт/см при трьохразовій обробці з інтервалами три хвилини. Туберкуліни, отримані з культурального фільтрату та бактеріальної маси мікобактерій, використовували для виготовлення очищеного (ППД) туберкуліну після змішування їх у співвідношенні 1:10, за рахунок чого вихід очищеного туберкуліну значно (майже у 10 разів) збільшувався. Першим етапом роботи було культивування та накопичення бактеріальної маси мікобактерій. Культивування мікобактерій на синтетичному живильному середовищі Сотона (ХБ або іншої модифікації) проводили таким чином. На щільних живильних середовищах (Левештейна-Ієнсена або живильному середовища для культивування мікобактерій (ТУУ 46.15.063.95) вирощували культури збудника туберкульозу бичачого виду штаму Valle (KMIEB 1 UA 114777 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 9KM) за температури 37-38 °С. Кожною культурою мікобактерій засівали не менше 50 пробірок живильного середовища. Через 35-60 діб відбирали пробірки з інтенсивним ростом культур, 510 % з них досліджували мікроскопічним методом. При цьому мазки з культур фарбували за методом Ціля-Нільсена. При наявності бактеріального забруднення навіть в одній пробірці культивування починали знову з музейних культур, а одержану партію забруднених культур знищували. Чисті культури першої генерації зберігали в холодильнику (15-20 пробірок), а з інших проводили пересів на середовище Павловського (гліцеринове картопляне середовище). На кожну культуру використовували не менше 25 пробірок середовища Павловського. Культивування проводили в термостаті за температури 37-38 °С протягом 40-60 діб. Для подальшої роботи відбирали пробірки, на яких культури мікобактерії дали інтенсивний ріст на картоплі та поверхні рідкої складової частини середовища Павловського у вигляді плівки. Контроль за якістю культивування проводили мікроскопією. Партію пробірок з чистими культурами кожного виду зберігали в холодильнику. Пересів мікобактерій з середовища Павловського на середовище Сотона проводили таким чином. Фрагменти плівки з рідкої складової частини середовища Павловського за допомогою бактеріологічної петлі стерильно переносили на поверхню синтетичного середовища Сотона. В наших дослідах при переносі плівки мікобактерій з середовища Павловського на синтетичне середовище вона часто опускалася на дно флакона і не давала росту. Для запобігання цього були використані коркові диски або кільця товщиною 2,0 мм, які стерилізували разом з середовищем Сотона. При пересіві культур плівку мікобактерій з середовища Павловського наносили на поверхню пробкового диска або кільця в середовищі Сотона. Товщина диска або кільця дозволяє змочувати його поверхню середовищем, на якому культивуються мікобактерії. Ріст культури у вигляді плівки з пробкового кільця розповсюджувався на поверхню середовища Сотона. Після пересіву флакони з середовищем Сотона закривали ватно-марлевими пробками і зверху зав'язували поліетиленовою плівкою. Культивували посіви в термостаті при 37-38 °С впродовж 6-8 тижнів. Через 1-2 тижні після пересіву культур середовища перевіряли на чистоту росту мікобактерій візуально за характером росту та мікроскопічним методом. При рості у флаконах сторонньої мікрофлори середовище знищували. Флакони з характерним для даного виду мікобактерій ростом далі культивували в термостаті при 37-38 °С до формування на поверхні середовища щільної плівки з бактеріальної маси мікобактерій. При цьому появу первинного росту M.bovis штаму Valle (KMIEB-9KM) спостерігали через 8-11 діб. Появу суцільного росту M.bovis у вигляді плівки на поверхні середовища Сотона спостерігали через 12-21 добу. Після закінчення культивування мікобактерій флакони з культурами піддавали стерилізації автоклавуванням при 1,5 атм. впродовж 20 хвилин. Відділення бактеріальної маси мікобактерій від культуральної рідини проводили в умовах боксу центрифугуванням впродовж 20 хвилин при 3 тис. об./хв. Одержану бактеріальну масу відмивали стерильною дистильованою водою (рН 7,0-7,1), просушували на паперовому фільтрі та зважували. Очищений (ППД) туберкулін (туберкулопротеїни мікобактерій) отримували трьома способами: 1) із культурального фільтрату мікобактерій (дослід 1); 2) із бактеріальної маси (дослід 2); 3) комплексним методом: із культурального фільтрату та бактеріальної маси (дослід 3). Дослід 1. В отриманій після відокремлення бактеріальної маси мікобактерій культуральній рідині проводили концентрацію білка з використанням методу мембранної фільтрації через капсулу мембранного фільтра Сарториус (Sartorius° CA MidiCaps) з діаметром пор 0,1 та 0,2 мкм. Після концентрації фільтрат містив туберкулопротеїн з молекулярною масою від 15,0 до 100,0 кДа, виробничий об'єм фільтрату зменшувався, а концентрація білка відповідно зростала. Видалення з туберкуліну глікопротеїдної фракції молекулярною масою більше 100 кДа підвищує його видову специфічність (Кассіч В.Ю. Мінливість мікобактерій, епізоотологічний моніторинг, заходи і засоби боротьби з туберкульозом тварин в умовах радіаційного впливу: Автореф. Дис… докт. вет.наук: 16.00.03 - Харків, 2004. - 42 с.). Одержаний фільтрат переливали в циліндричний посуд об'ємом 1-2 л. і для осадження водорозчинних фракцій протеїну додавали 4 % розчин ТХО кислоти. Для цього на 1 мл рідини додавали 0,1 мл розчину ТХО. Для повного осадження протеїнів циліндричні судини ставили в холодильник на 12-18 годин за температури 4-6 °С. Поверхневий шар рідини видаляли сифоном, а нижній обробляли 1 %-м розчином ТХО та центрифугували. 2 UA 114777 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Одержаний осад ресуспензували ізотонічним розчином у співвідношенні 1:5, нейтралізували 10 % нашатирним спиртом до реакції рН 7,2-7,4 і зливали у окрему ємність, після чого доводили до рН 6,0-6,8, змішували з рівним об'ємом насиченого розчину сірчанокислого амонію (NH 4)2SO4 і відстоювали 8-12 годин (для переосадження протеїну). Після відстоювання надосадову рідину утилізували, а осад протеїнів центрифугували при 4000-8000 обертів хвилину 25-30 хвилин. Осад, що утворився суспендували у дистильованій воді в співвідношенні 1:5 і нейтралізували нашатирним спиртом до рН 7,2. Одержаний розчин протеїну заливали у сосисочну целофанову оболонку й піддавали діалізу у демінералізованій воді при температурі від 4 до 6 °С до повного зникнення залишку солі фосфату сірчанокислого амонію, який визначали за допомогою реактиву Несслера. Далі розчин стерилізували через фільтр і зберігали при температурі від 4° до 6 °С. Методом К'єльдаля 3 визначали вміст протеїну в 1 см розчину. 3 Для цього в бактеріологічну пробірку вносили 2 см одержаного розчину туберкуліну. В 3 3 пробірку з 2 см розчину туберкуліну вносили 2 см розчину трихлороцтової кислоти (ТХО) з масовою часткою 10 % і залишали у холодильнику на 30 хвилин за температури від 4° до 6 °С для коагуляції білка. Потім фільтрували через знезолений фільтр, змиваючи залишки білка з пробірки розчином ТХО з масовою часткою 5 %. Білок на фільтрі тричі промивали розчином ТХО з масовою часткою 5 % для вилучення залишкового азоту. Фільтр з білком висушували на 3 повітрі, потім вносили у колбу К'єльдаля, додавали 2 см концентрованої сірчаної кислоти й мінералізували нагріванням. Мінералізацію проводили у присутності каталізатора - перекису 3 водню, який додавали по 0,5 см через кожні 15-20 хвилин до повного знебарвлення розчину. Після охолодження вміст колби К'єльдаля переносили у колбу для відгону, залишки розчину 3 змивали порціями дистильованої води загальним об'ємом 10-12 см . Вичерпаність переносу перевіряли індикатором метиленовим рожевим. При цьому остання проба промивної води мала жовтий колір. 3 3 В колбу Ерленмейєра наливали 20 см 0,05 моль/дм розчину сірчаної кислоти і 10-15 крапель індикатора Ташіро. Індикатор Ташіро готували змішуванням у рівних об'ємах спиртового розчину метиленового червоного з масовою часткою 0,2 % і спиртового розчину метиленового синього з масовою часткою 0,1 %. Відгінну колбу з'єднували з холодильником та пароутворювачем. Вміст колби нейтралізували розчином гідроокису натру з масовою часткою від 30 до 33 % за індикатором метиленовим рожевим. Потім вміст відганяли. Відгін аміаку проводили до тих пір, поки в 3 приймальній колбі накопичувалось приблизно 20 см розчину. Завершення відгону перевіряли лакмусовим папером. 3 Вміст приймальної колби титрували розчином гідроокису натру 0,1 моль/дм до зміни забарвлення розчину від лілового до зеленого за додаванням індикатора Ташіро. Одночасно визначали масову частку азоту в знезоленому фільтрі. 3 Масову частку білка в пробі досліджуваного розчину ( X ) в мг/см обчислювали за формулою: ( VK  V1K 1 )  ( V2K  V3K )1,4 X 6.25 , 2 3 де V - об'єм 0,1 моль/дм розчину сірчаної кислоти, що налитий у приймальну колбу при 3 аналізі проби, см . 3 K - поправочний коефіцієнт до титру 0,1 моль/дм розчину сірчаної кислоти; 3 3 V1 - об'єм 0,1 моль/дм розчину гідроокису натрію, що витрачений на титрування проби, см ; 3 K 1 - поправочний коефіцієнт до титру 0,1 моль/дм розчину гідроокису натрію; 3 V2 - об'єм 0,1 моль/дм розчину сірчаної кислоти, що налитий у приймальну колбу під час 3 аналізу знезоленого фільтра, см ; 3 V3 - об'єм 0,1 моль/дм розчину гідроокису натрію, що витрачений на титрування при аналізі 3 знезоленого фільтра, см ; 3 3 1,4 - маса азоту, що відповідає 1 см 0,1 моль/дм розчину сірчаної кислоти, мг. Масова частка білка в туберкуліні, одержаному з використанням штаму M.bovis Valle 3 (КМІЕВ-9КМ) становила (0,9±0,2) мг/см . Вихід протеїну з 1 літру середовища становив 91,0 мг. Дослід 2. Робота з бактеріальною масою була спрямована на руйнування клітин мікобактерій і отримання протеїну з внутрішньоклітинних структур методом ультразвукового впливу. Для руйнування біомасу мікобактерій ресуспендували з розрахунку 50 мг на 1 мл дистильованої води і дезінтегрували за допомогою ультразвукового дезінтегратора. Для цього використовували диспергатор УЗДН-2Т. Оптимальні параметри дезінтеграції мікобактерій 3 UA 114777 U 5 10 15 20 25 30 35 визначали впродовж 3, 4, 5, 6 і 7 хвилин одноразово, дворазово, триразово і чотирьохразово з інтервалом між дезінтеграціями 3 хвилини. Частота ультразвука становила 20, 21, 22, 23 і 24 2 кГц, інтенсивність 80, 90, 100, 110 та 120 Вт/см (авторське свідоцтво № 1339922, 1987). Найбільший вихід протеїну з бактеріальної маси отриманий при частоті ультразвука 22 кГц, 2 інтенсивності 90, 100 та 110 Вт/см при трьохразовому озвученні впродовж 4, 5 и 6 хвилин з інтервалом між дезінтеграціями 3 хвилини. Після кожної дезінтеграції проводили центрифугування при 5 тис. об./хв. впродовж 22-30 хвилин. Отриманий осад досліджували під мікроскопом та проводили висів на поживні середовища. В подальшому осад знищували, а в надосадній рідині осаджували протеїн 4 % розчином трихлороцтової кислоти (ТХО) з розрахунку 0,2 мл кислоти на 1 мл надосадової рідини. Осадження протеїну проводили за температури 4-6 °С впродовж 12-18 годин. Верхній шар рідини зливали сифоном, а нижній обробляли 1 %-м розчином ТХО тричі і центрифугували. Одержаний розчин протеїну заливали у сосисочну целофанову оболонку й піддавали діалізу у демінералізованій воді при температурі від 4 до 6 °C до повного зникнення залишку солі фосфату сірчанокислого амонію, який визначали за допомогою реактиву Несслера. Далі розчин стерилізували методом мембранної фільтрації через капсулу мембранного фільтра Сарториус (Sartorius° СA MidiCaps) з діаметром пор 0,1 та 0,2 мкм і зберігали при температурі від 4° до 6 3 °С. Методом К'єльдаля визначали вміст протеїну в 1 см розчину. Масова частка білка в туберкулопротеїні, одержаному з бактеріальної маси штаму M.bovis Valle (KMIEB-9KM) 3 становила (1,3±0,2) мг/см . Вихід протеїну з 1 літру середовища становив 130,0 мг. 3 Дослід 3. Розчини, одержані із культурального фільтрату з вмістом протеїну (039±0,2) мг/см 3 та із бактеріальної маси з вмістом протеїну (1,3±0,2) мг/см описаними в дослідах 1 та 2 методами, змішували у співвідношенні 1:10, доводили рН до 7,0-7,15 - нормальним розчином NaOH та на 2 доби ставили на діаліз в целофанових оболонках. Методом К'єльдаля визначали 3 3 вміст протеїну в 1 см розчину. Масова частка білка в туберкуліні становила (11,9±0,2) мг/см . Вихід протеїну з 1 літру середовища становив 1100,0 мг. Результати визначення виходу туберкуліну з культурального фільтрату (дослід 1), з бактеріальної маси (дослід 2) та комплексним методом з культурального фільтрату та бактеріальної маси (дослід 3) наведені в таблиці 1. Наведені в таблиці результати дослідів свідчать, що найвищим вихід туберкуліну на 1 л середовища був при використанні комплексного методу отримання з культурального фільтрату та бактеріальної маси (дослід 3) і становив 1100,0 мг, в той час як вихід препарату з культурального фільтрату (дослід 1) та з бактеріальної маси (дослід 2) становив 91,0 та 130,0 мг, відповідно. Таким чином, запропонований нами комплексний метод отримання туберкуліну із культурального фільтрату та бактеріальної маси (дослід 3) дозволяє підвищити вихід кінцевого продукту (очищеного ППД туберкуліну) у 10 разів в порівнянні з методами одержання препарату із культурального фільтрату (дослід 1) та із бактеріальної маси (дослід 2). Таблиця 1 Отримано Вихід туберкуліну, мг/см 3 Вихід Кількість туберкуліну Спосіб отримання з середовища, культурального бакт. з1л з туберкуліну бактеріальної л середовища, фільтрату маси, г фільтрату маси мг з культурального фільтрату (дослід 1,0 0,85 0,9±0,2 91,0 1) з бактеріальної 1,0 0,80 12,0 1,3±0,2 130,0 маси (дослід 2) з культурального фільтрату та 1,0 0,84 12,6 11,9±0,3 1100,0 бактеріальної маси (дослід 3) 40 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб отримання туберкуліну з культуральної рідини та бактеріальної маси мікобактерій, який полягає в тому, що після накопичення та інактивації бактеріальної маси мікобактерій на 4 UA 114777 U 5 синтетичному живильному середовищі Сотона туберкулін отримують комплексно: із культурального фільтрату та із бактеріальної маси мікобактерій, озвученої на ультразвуковому 2 диспергаторі при частоті ультразвуку 22 кГц та інтенсивності 90, 100, 110 Вт/см при триразовій обробці з інтервалами три хвилини, який відрізняється тим, що отримані із культурального фільтрату та із бактеріальної маси мікобактерій препарати використовують для виготовлення очищеного (ППД) туберкуліну шляхом їх змішування у співвідношенні 1:10, за рахунок чого вихід туберкуліну збільшується у 10 разів. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5