Синтетичне живильне середовище сотона-хб для прискореного росту мікобактерій при виготовленні туберкуліну

Реферат: Синтетичне живильне середовище для прискореного росту та накопичення бактеріальної маси мікобактерій має заліза амонійного цитрат, L-Аспарагін (C4H3NО3Н2О), лимонну кислоту (С6Н5О7 Н2О), магнію сульфат (MgSO47Н2О), калію гідрофосфат (K2НРО4), натрію дигідрофосфат, натрію хлорид (NaCl), твин-80. Додатково живильне середовище містить ростові фактори - вітамін В1 і вітаміну В12, що призводить до прискорення росту та накопичення на ньому бактеріальної маси мікобактерій. UA 111052 U (12) UA 111052 U UA 111052 U 5 10 Корисна модель належить до ветеринарної мікробіології і біотехнології, зокрема до засобів та способів виготовлення алергенів для діагностики туберкульозу тварин та птиці, а саме до живильних середовищ для накопичення бактеріальної маси мікобактерій, що є необхідною умовою та складовою частиною технологічного процесу виготовлення згаданих препаратів. Існує чимало прописів синтетичних живильних середовищ для культивування мікобактерій, зокрема середовища Мідлбрук, Моделя, Сотона, "Синтетичне живильне середовище для культивування туберкуліногенних штамів мікобактерій" (Патент України № 55922 А від 15.04.2003 p., розробники: Кассіч Ю.Я. з співав.), "Синтетичне живильне середовище Сотона КФ для прискореного накопичення бактеріальної маси мікобактерій" Патент України № 63245 А від 10.10.2011 p., розробники: Кассіч В.Ю., Кассіч О.В. з співав.), середовище Сотона за класичним медичним прописом, середовище Сотона за прописом Курської біологічної фабрики та інші. Найбільш близьким за суттю та результатами використання до запропонованого нами є середовище Сотона, що пропонує Індійська компанія HIMEDIA, яке має такий склад: Таблиця 1 Інгредієнти Заліза амонійного цитрат L-Аспарагін Лимонна кислота Магнію сульфат Калію гідрофосфат Натрію дигідрофосфат Натрію хлорид Твин-80 Кінцеве значення рН (при 25 °C) грам/літр 0,0167 1,330 0,660 0,166 0,287 0,633 0,400 0,833 7,2±0,2 15 20 25 Недоліками усіх згаданих поживних середовищ є повільний ріст на них збудників туберкульозу (первинний ріст референтних штамів відзначається через 10-21 діб) та низький вихід туберкулопротеїну з одиниці об'єму середовища. В основу корисної моделі поставлена задача розробити синтетичне живильне середовище для культивування мікобактерій, склад якого дозволить прискорити ріст і накопичення бактеріальної маси та підвищити вихід протеїну мікобактерій з одиниці об'єму середовища в процесі виготовлення очищеного (ППД) туберкуліну. Поставлену задачу вирішували шляхом додавання до складу середовища Сотона HIMEDIA як ростового фактора вітаміну В1 та вітаміну В12, при співвідношенні компонентів, що наведено у таблиці 2. Таблиця 2 Склад та співвідношення компонентів живильного середовища Сотона-ХБ для прискореного культивування мікобактерій Інгредієнти Заліза амонійного цитрат L-Аспарагін (C4H3NO3Н2О) Лимонна кислота (С6Н5О7Н2О) Магнію сульфат (MgSO47Н2О) Калію гідрофосфат (K2НРО4) Натрію дігідрофосфат Натрію хлорид (NaCl) Твин-80 вітамін В1 вітамін В12 Кінцеве значення рН (при 25 °C) 7,2±0,2 середовище Сотона HIMEDIA 0,0167 1,330 0,660 0,166 0,287 0,633 0,400 0,833 1 грам/літр середовище Сотона ХБ Варіант 1 Варіант 2 0,0167 0,0167 1,330 1,330 0,660 0,660 0,166 0,166 0,287 0,287 0,633 0,633 0,400 0,400 0,833 0,833 0,025 0,05 0,025 0,05 UA 111052 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Дослідне живильне середовище готували таким чином. Наважки солей розчиняли у дистильованій воді в наведеній в таблиці 2 послідовності, фільтрували, розливали у флакони по 200 мл. Стерилізували автоклавуванням при 110 °С 10 хв. або кип'ятінням впродовж 1 години. рН після стерилізації 6,9-7,2. Підщолачували 25 % розчином водного аміаку. Лимонну кислоту, вітамін В1, вітамін В12 та гліцерин, стерильно додавали після автоклавування. Середовище Сотона HIMEDIA готували таким чином. Розмішували 4,32 г порошку в 1000 мл дистильованої води, що містила 20 мл гліцерину. Кип'ятили для повного розчинення часток. Стерилізували автоклавуванням при 1,1 атм (121 °C) впродовж 15 хвилин. Випробовували два варіанти дослідного середовища з різними співвідношеннями компонентів, наведеними у таблиці 2. Ростові властивості середовища визначали шляхом висіву на нього збудника туберкульозу бичачого виду M.bovis (штам Valle). Культивування мікобактерій на синтетичному живильному середовищі проводили таким чином. На щільних живильних середовищах (Левештейна-Ієнсена або живильному середовищі для культивування мікобактерій (ТУУ 46.15.063.95) вирощували культуру збудника туберкульозу бичачого виду за температури 37-38 °С. Культурою мікобактерій засівали 50 пробірок живильного середовища. Через 35-60 діб, відбирали пробірки з інтенсивним ростом культури, 510 % з них досліджували мікроскопічним методом. При цьому мазки з культур фарбували за методом Ціля-Нільсена. При наявності бактеріального забруднення навіть в одній пробірці культивування починали знову з музейних культур, а одержану партію забруднених культур знищували. Чисті культури першої генерації зберігали в холодильнику (15-20 пробірок), а з інших проводили пересів на середовище Павловського (гліцеринове картопляне середовище). На кожну культуру використовували не менше 25 пробірок середовища Павловського. Культивування проводили в термостаті за температури 37-38 °С протягом 40-60 діб. Для подальшої роботи відбирали пробірки, на яких культури мікобактерії дали інтенсивний ріст на картоплі та поверхні рідкої складової частини середовища Павловського у вигляді плівки. Контроль за якістю культивування проводили мікроскопією. Партію пробірок з чистими культурами зберігали в холодильнику. Пересів мікобактерій з середовища Павловського на середовище Сотона проводили таким чином. Фрагменти плівки з рідкої складової частини середовища Павловського за допомогою бактеріологічної петлі стерильно переносили на поверхню середовища Сотона-ХБ та середовище Сотона HIMEDIA. В наших дослідах при переносі плівки мікобактерій з середовища Павловського на синтетичне середовище вона часто опускалася на дно флакона і не давала росту. Для запобігання цього були використані коркові диски або кільця товщиною 2,0 мм, які стерилізували разом з середовищем Сотона. При пересіві культур плівку мікобактерій з середовища Павловського наносили на поверхню пробкового диска або кільця на середовищі Сотона. Товщина диска або кільця дозволяє змочувати його поверхню середовищем, на якому культивуються мікобактерії. Ріст культури у вигляді плівки з пробкового кільця розповсюджувався на поверхню середовища Сотона-ХБ та середовища Сотона HIMEDIA. Після пересіву флакони з середовищем закривали ватно-марлевими пробками і зверху зв'язували поліетиленовою плівкою. Культивували посіви в термостаті при 37-38 °C впродовж 6-8 тижнів. Через 1-2 тижні після пересіву культур середовища перевіряли на чистоту росту мікобактерій візуально за характером росту та мікроскопічним методом. При рості у флаконах сторонньої мікрофлори середовище знищували. Флакони з характерним для даного виду ростом мікобактерій далі культивували в термостаті при 37-38 °C. Коли плівка мікобактерій покривала всю поверхню середовища культивування припиняли і одержаний продукт використовували для виготовлення ППД-туберкуліну. Після закінчення терміну культивування мікобактерій флакони з культурами піддавали автоклавуванню при 1,5 атм. впродовж 20 хвилин. Відділення бактеріальної маси мікобактерій від культуральної рідини проводили в умовах боксу центрифугуванням впродовж 20 хвилин при 3 тис.об./хвил. Одержану бактеріальну масу відмивали стерильною дистильованою водою (рН 7,0-7,1), просушували на паперовому фільтрі та зважували. Висіви мікобактерій на досліджувані середовища Сотона-ХБ та середовище Сотона HIMEDIA проводили у трьох повторностях. Результати проведених у трьох повторностях досліджень наведені у таблиці 3. 2 UA 111052 U Таблиця 3 Показники Поява первинного росту, дні (М±m) Поява суцільного росту у вигляді плівки на поверхні середовища, дні (М±m) Вихід бактеріальної маси на середовищі, мг 5 10 15 Середовище Сотона-ХБ Варіант 1 Варіант 2 8,0±0,1 10,0+0,05 Середовище Сотона HIMEDIA 11,0±0,09 15,0±0,09 18,0±0,1 21,0±0,1 63,5±0,2 59,6±0,1 55,6±0,15 Матеріали таблиці 3 свідчать про те, що ріст збуднику туберкульозу бичачого виду на запропонованому середовищі Сотона-ХБ починався раніше: на 3 доби (Варіант 1) та на 1 добу (Варіант 2) у порівнянні з середовищем Сотона HIMEDIA. Накопичення бактеріальної маси на середовищі Сотона-ХБ було більшим на 7,9 мг (Варіант 1) та 4,0 мг (Варіант 2), у порівнянні з середовищем Сотона HIMEDIA. При цьому кращі результати одержані при використанні середовища Сотона ХБ, варіант 1. Таким чином, новий склад компонентів синтетичного живильного середовища (Сотона ХБ) дозволяє підвищити ростові якості середовища, що пропонується за рахунок прискорення росту культур збудника туберкульозу й накопичення бактерійної маси мікобактерій. Застосування в процесі виготовлення ППД-туберкуліну для ссавців синтетичного живильного середовище Сотона-ХБ (на базі середовища Сотона HIMEDIA з додаванням вітамінів В1 та В12) забезпечує прискорення росту культур збудника туберкульозу на 1-3 доби і накопичення бактерійної маси мікобактерій на 4,0-7,9 мг, що підвищує вихід кінцевого продукту туберкуліну з одиниці об'єму середовища. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Синтетичне живильне середовище для прискореного росту та накопичення бактеріальної маси мікобактерій, яке має заліза амонійного цитрат, L-Аспарагін (C4H3NO3Н2О), лимонну кислоту (С6Н5О7·Н2О), магнію сульфат (MgSO47Н2О), калію гідрофосфат (K2НРО4), натрію дигідрофосфат, натрію хлорид (NaCl), твин-80, яке відрізняється тим, що додатково містить ростові фактори - вітамін В1 і вітамін В12, що призводять до прискорення росту та накопичення на ньому бактеріальної маси мікобактерій, при наступному складі: Інгредієнти грам/літр Заліза амонійного цитрат 0,0167 1,330 L-Аспарагін (C4H3NО3Н2О) Лимонна кислота (С6Н5О7·Н2О) 0,660 0,166 Магнію сульфат (MgSO47Н2О) Калію гідрофосфат (K2НРО4) 0,287 Натрію дигідрофосфат 0,633 Натрію хлорид (NaCl) 0,400 Твин-80 0,833 вітамін В1 0,025 вітамін В12 0,025 Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3