Синтетичне живильне середовище (сотона кф) для прискоренного накопичення бактеріальної маси мікобактерій

Синтетичне живильне середовище для прискореного накопичення бактеріальної маси мікобактерій, яке містить: L-аспарагін (C4H3NО3Н2О), калій фосфорнокислий двозаміщений (К2НРО4), магній сірчанокислий (MgSО47Н2О), лимонну кислоту (С6Н5О7  Н2О), гліцерин (С3Н8О3), воду дистильовану, підігріту до температури 70 °С, яке ві 3 63246 4 Таблиця 1 Склад та співвідношення компонентів живильного середовищі Сотона-КФ для прискореного культивування мікобактерій Склад компонентів L-аспарагин (C4H3NО3  Н2О) Калій фосфорнокислий двозаміщений (К2НРО4) Магній сірчанокислий (MgSО47Н2О) Лимонна кислота (С6Н5О7Н2О) Харчова яблучна кислота Залізо сірчанокисле (FeSO4) Цинк сірчанокислий (ZnSO4) Амоній лимоннокислий двозаміщений (С6Н14О7N2) Гліцерин (С3Н8О3) Вода дистильована, підігріта до температури 70 С. співвідношення компонентів у трьох варіантах дослідного середовища (мас. %) варіант 1 варіант 2 варіант 3 3,0 4,0 5,0 0,3 0,4 0,5 0,3 0,4 0,5 0,5 1,0 2,0 0,25 0,5 1,0 0,01 0,02 0,05 0,05 0,08 0,1 0,5 1,0 2,0 30,0 40,0 50,0 до 1 л до 1 л до 1 л рН - 7,0±0,2 (доводили 10 % розчином аміаку) Дослідне живильне середовище готували таким чином. Наважки солей розчиняли у дистильованій воді, в наведеній в таблиці 1 послідовності, фільтрували, розливали у флакони по 200 мл. Стерилізували автоклавуванням при 110 °C 10 хв. або кип'ятінням впродовж 1 години. рН після стерилізації 6,9-7,2. Підлужували 25 % розчином водного аміаку. Цинк сірчанокислий та лимонну кислоту і гліцерин, стерильно додавали після автоклавування. Останнім додавали аспарагін, який попередньо розчиняли в невеликій кількості дистильованої води на водяній бані за температури 100 °C. рН середовища доводили до 7,0±0,2. Середовище розливали у стерильні флакони ємністю 0,5 літру по 350-400 мл закривали стерильними ватними пробками і стерилізували. Для перевірки якості стерилізації колби з середовищем ставили в термостат на три доби при 37-38 °C. Середовище, на якому виявляли ріст неспецифічної мікрофлори, вибраковували та знешкоджували автоклавуванням. Готове до використання живильне середовище зберігали у рефрижераторі при 4 °C 30 діб. Випробовували три варіанти дослідного середовища з різними співвідношенні компонентів, наведеними у таблиці 1. Ростові властивості середовища визначали шляхом висіву збудника туберкульозу бичачого (штам Valle) та пташиного видів. Культивування мікобактерій на синтетичному живильному середовищі проводили таким чином. На щільних живильних середовищах (ЛевештейнаІєнсена або живильному середовища для культивування мікобактерій (ТУУ 46.15.063.95) вирощували культури збудника туберкульозу бичачого та пташиного видів за температури 37-38 °C. Кожною культурою мікобактерій засівали не менше 50 пробірок живильного середовища. Через 35-60 діб, в залежності від виду мікобактерій, відбирали пробірки з інтенсивним ростом культур, 5-10 % з них досліджували мікроскопічним методом. При цьому мазки з культур фарбували за методом ЦіляНільсена. При наявності бактеріального забруднення навіть в одній пробірці культивування починали знову з музейних культур, а одержану партію забруднених культур знищували. Чисті культури першої генерації зберігали в холодильнику (15-20 пробірок), а з інших проводили пересів на середовище Павловського (гліцеринове картопляне середовище). На кожну культуру використовували не менше 25 пробірок середовища Павловського. Культивування проводили в термостаті за температури 37-38 °C протягом 4060 діб. Для подальшої роботи відбирали пробірки на яких культури мікобактерії дали інтенсивний ріст на картоплі та поверхні рідкої складової частини середовища Павловського у вигляді плівки. Контроль за якістю культивування проводили мікроскопією. Партію пробірок з чистими культурами кожного виду зберігали в холодильнику. Пересів мікобактерій з середовища Павловського на середовище Сотона-КФ проводили таким чином. Фрагменти плівки з рідкої складової частини середовища Павловського за допомогою бактеріологічної петлі стерильно переносили на поверхню синтетичного середовища Сотона-КФ. В наших дослідах при переносі плівки мікобактерій з середовища Павловського на синтетичне середовище вона часто опускалася на дно флакону і не давало росту. Для запобігання цього були використані коркові диски або кільця товщиною 2,0 мм, які стерилізували разом з середовищем СотонаКФ. При пересіві культур плівку мікобактерій з середовища Павловського наносили на поверхню пробкового диску або кільця на середовищі Сотона-КФ. Товщина диску або кільця дозволяє змочувати його поверхню середовищем, на якому культивуються мікобактерії. Ріст культуриу вигляді плівки з пробкового кільця розповсюджувався на поверхню середовища Сотона-КФ. Після пересіву флакони з середовищем Сотона-КФ закривали ватно-марлевими пробками і зверху зв'язували поліетиленовою плівкою. Культивували посіви в 5 63246 термостаті при 37-38 °C впродовж 6-8 тижнів. Через 1-2 тижні після пересіву культур середовища перевіряли на чистоту росту мікобактерій візуально за характером росту та мікроскопічним методом. При рості у флаконах сторонньої мікрофлори середовище знищували. Флакони з характерним для даного виду ростом мікобактерій далі культивували в термостаті при 37-38 °C. Коли плівка мікобактерій покривала всю поверхню середовища культивування припиняли і одержаний продукт використовували для виготовлення туберкулопротеїну ППД-туберкуліну. Після закінчення терміну культивування мікобактерій флакони з культурами піддавали автоклавуванню при 1,5 атм. впродовж 20 хвилин. Відділення бактеріальної маси мікобактерій від культуральної рідини проводили в умовах боксу центрифугуванням впродовж 20 хвилин при 3 тис. об./хв. Одержану бактеріальну масу відмивали стерильною дистильованою водою (рН 7,0-7,1), просушували на паперовому фільтрі та зважували. Результати проведених досліджень наведені у таблиці 2. Матеріали таблиці 2 свідчать про те, що ріст збудників туберкульозу на запропонованому сере 6 довищі починався раніше: бичачого виду на 2-4 доби, пташиного - на 3-5 діб, а накопичення бактеріальної маси на ньому більше, у порівнянні з контролем (Середовище Сотона - медичний пропис). Кращі показники щодо термінів початку росту при висіві культур збудників туберкульозу бичачого та пташиного видів відзначали на живильному середовищі із співвідношенням компонентів "варіант 3" (початок росту при висіві культур у порівнянні з базовим середовищем раніше на 4 та 5 діб, відповідно, а вихід бактеріальної більше - на 7,9 та 16,4 мг, відповідно). Тобто на середовищі із співвідношенням компонентів "варіант 3" інтенсивність росту і накопичення бактеріальної маси за період культивування була вищою: у мікобактерій бичачого виду на 7,9 мг, пташиного - на 16,4 мг, у порівнянні з базовим живильним середовищем (Середовище Сотона медичний пропис). Таким чином, новий склад компонентів синтетичного живильного середовища Сотона-КФ дозволяє підвищити ростові якості середовища, що пропонується за рахунок прискорення росту культур збудника туберкульозу й накопичення бактерійної маси мікобактерій. Таблиця 2 Результати дослідження ростових властивостей і синтетичних живильних середовищ Показники Поява первинного росту, дні Поява суцільного росту у вигляді плівки на поверхні середовища, дні Вихід бактеріальної маси на середовищі, мг Живильне середовище 1 дослідне живильне середовище Сотона СБ для прискореного культивування мікобактерій Дослід 1 (варіант Дослід 2 (варіант Дослід 3 (варіант середовища 1) середовища 2) середовища 3) І II І II І II Середовище Сотона (медичний пропис) І II 9,0 7,0 10,0 8,0 7,0 5,0 11,0 10,0 18,0 13,0 19,0 14,0 13,0 12,0 21,0 24,0 55,0 54,0 59,4 61,1 63,5 64,4 55,6 48,0 Примітка: І - штам Valle; ІІ - штам M. aviuм. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601