Спосіб виготовлення ппд-туберкуліну з використаннням методів мікрофільтрації та ультрацентрифугування

Реферат: Спосіб виготовлення туберкуліну, при якому виконують вирощування мікобактерій туберкульозу на синтетичному живильному середовищі, відділення культуральної рідини з наступним виділенням з неї туберкуліну трихлороцтовою кислотою, переосадженням його сульфатом амонію та обезсолюванням суспензії туберкуліну. Після відділення бактеріальної маси культуральну рідину фільтрують методом мікрофільтрації з використанням капсул Sartoclean® CА з діаметром пор 0,45-0,65 мкм NBSP, туберкулопротеїн після осадження трихлороцтовою кислотою відділяють шляхом ультрацентрифугування при 9-14 тис. об./хв. і далі проводять стерилізуючу мікрофільтрацію одержаних пермеатів з використанням капсул Sartoclean® CA (0,2 мкм). UA 120698 U (12) UA 120698 U UA 120698 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної мікробіології, імунології і біотехнології, зокрема до способів виготовлення алергенів для діагностики туберкульозу тварин та птиці, а саме до способів отримання туберкулінів з культуральної рідини мікобактерій, що є складовою частиною технологічного процесу виготовлення згаданих препаратів. Основою для виготовлення очищених (ППД) туберкулінів для ссавців та птиці і алергенів із атипових мікобактерій (КАМ, ААМ) є протеїни мікобактерій, які містяться у фільтратах культур. Принцип отримання очищеного деривату туберкулопротеїну (Purified Protein Derivativ-PPD) з культурального фільтрату мікобактерій, культивованих на синтетичному живильному середовищі, методом осадження трихлороцтовою кислотою (ТХО) лишається незмінним з часу розробки технології виробництва ППД-туберкуліну F.B.Seibert (1934, 1949). У подальшому цей метод удосконалений М.А. Лінніковою (1959) О.М. Говоровим і Ф.І. Осташко (1952, 1956), Кассіч Ю.Я., Кассіч В.Ю. (2004, 2006) та іншими дослідниками. Існує класичний спосіб одержання туберкулопротеїнів мікобактерій з культурального фільтрату збудника туберкульозу, вирощених на рідкому синтетичному живильному середовищі шляхом стерилізації культур автоклавуванням, відокремлення бактеріальної маси, одержання й стерилізації культуральних фільтратів (стерилізуюча фільтрація), осадження протеїну розчином трихлороцтової кислоти, переосадження його насиченим розчином сірчанокислого амонію, очищення від солей за допомогою діалізу з подальшим визначенням концентрації протеїну в 1 3 см розчину (Кассіч В.Ю. Мінливість мікобактерій, епізоотологічний моніторинг, засоби і заходи боротьби з туберкульозом тварин в умовах радіаційного впливу: Дис. д-ра. вет. наук: 16.00.03 Харків, 2004. - 408 с; Биотехнология: Учебник. И.В. Тихонов, Е.А. Рубан, Т.Н. Грязнева и др.; Под ред. акад. РАСХН Е.С. Воронина. - СПб.: ЗАО ГИОРД, 2005. - 792 с.) Існує також спосіб одержання туберкулопротеїну з бактеріальної маси мікобактерій методом озвучування ультразвуком (Авторское свидетельство № 1339922, 1987 г., Донченко А.С. с соавт.; Донченко А.С., Овдиенко Н.П., Донченко Н.А. Диагностика туберкульоза крупного рогатого скота. - Новосибирск, 2004. - 309 с.; Кассіч В.Ю. Мінливість мікобактерій, епізоотологічний моніторинг, заходи і засоби боротьби з туберкульозом тварин в умовах радіаційного впливу: Автореф. Дис… докт. вет. наук: 16.00.03 - Харків, 2004.- 42 с; Дегтярьов І.М. Вивчення протеїногенних властивостей культур М. bovis та удосконалення способу виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців. Автореф….дис. канд….вет. наук: 16.00.03. - Харків, 2009. - 21 с). Суттєвим недоліком усіх перелічених способів є низький вихід та обмежена специфічність кінцевого продукту - ППД-туберкуліну. Крім цього, найбільш вразливою ланкою технологічного процесу є глибинна стерилізуюча фільтрація через азбестові фільтри, що не дозволяє одержати гарантовано стерильний препарат та призводить до втрат на таких фільтрах значної кількості білка. Найбільш близьким за суттю та досягнутими результатами до запропонованого нами способу є спосіб одержання туберкуліну з використанням ультрафільтраційних мембран (СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛИНА Патент РФ 2113233 ru-patent.info/21/1014/2113233.html. Козлов B.E.; Ничвеева Л.Д.; Гречкина Н.Т.; Шевырев Н.С.; Азарова Н.А.; Шаров А.Н.; Безгин В.М.; Солодов Е.Н.; Букова Н.К.). Проте, зазначений спосіб полягає у фракціонуванні знесоленої крупномолекулярної фракції та концентрату туберкуліну на ультрафільтраційних мембранах з НOММ 150-1000 кДа, а корисна модель, що заявляється, включає обробку культуральної рідини після відділення бактеріальної маси методом мікрофільтрації з використанням капсул Sartoclean® CA з діаметром пор 0,45-0,65 мкм NBSP та відділення білкових фракцій туберкуліну після осадження їх трихлороцтовою кислотою шляхом ультрацентрифугування при 9-14 тис. об./хв. з подальшою стерилізуючою мікрофільтрацією одержаних пермеатів через капсули Sartoclean® СА (0,2 мкм). Моношарові фільтри Sartoclean® СА з діаметром пор 0,45-0,2 мкм (NBSP) забезпечують найвищій вихід протеїну при утримуючій мікробній фільтрації. Відомо, що мембрани з ацетату целюлози в фільтрах Sartoclean® CА є мембранним матеріалом з найнижчою неспецифічною зв'язувальною здатністю, що забезпечує найбільший вихід протеїну і, тим самим, підвищує ефективність технології. Завдяки "вбудованій системі попередньої фільтрації", необхідній для забезпечення економічності компоновки системи, фільтри Sartoclean® CА з гетерогенним подвійним шаром забезпечують найвищі показники загальної пропускної здатності (Інструкція з експлуатації). В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб одержання діагностичного препарату для алергічної діагностики туберкульозу тварин шляхом вдосконалення технологічного процесу, що призведе до підвищення виходу високоспецифічного та якісного кінцевого продукту - ППД-туберкуліну. 1 UA 120698 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Поставлене задача вирішували шляхом того, що туберкулін з культуральної рідини після накопичення та інактивації бактеріальної маси виробничого штаму М. bovis (Valle) на синтетичному живильному середовищі отримували таким чином: - стерильну культуральну рідину піддавали мікрофільтрації з використанням капсул Sartoclean® CA з діаметром пор 0,45-0,65 мкм NBSP; - в одержаному пермеаті проводили осадження білка додаванням трихлороцтової кислоти (ТХО) до кінцевої концентрації 4-5 %. Протеїн з суспензії відокремлювали від рідини шляхом ультрацентрифугування при 9-14 тис. об./хв. на промисловому малооб'ємному сепараторі або ультрацентрифузі ("Сверхцентрифуга СГО-100 × 75",15 тис. об. хв.; або "Сверхцентрифуга ОТР-17", швидкість обертів ротора 256 тис./хв.). При цьому вихід препарату підвищувався в 1,5 рази. З осаду (фактично сухого залишку) робили суспензію на ізотонічному розчині в співвідношенні 1:5; - проводили переосадження туберкуліну з суспензії насиченим розчином сірчанокислого амонію та відокремлювали осад від рідини центрифугуванням при 4-6 тис. об./хв. та готували суспензію на ізотонічному розчині в співвідношенні 1:5; в суспензії визначали концентрації 3 протеїну в 1 см за методом К'єльдаля; - після подальшого діалізу та стерилізуючої мікрофільтрації з використанням капсул Sartoclean® СА (0,2 мкм) одержаний препарат використовували для виготовлення очищеного (ППД) туберкуліну. При цьому, за рахунок використання для первинної та стерилізуючої фільтрації капсул Sartoclean® СА з діаметром пор 0,45-0,65 мкм NBSP та 0,2 мкм, а також відокремлення туберкулопротеїну від рідини методом ультрацентрифугування при 9-14 тис. об./хв., вихід туберкуліну значно (у 1,5 рази) збільшився. Першим етапом роботи було культивування та накопичення бактеріальної маси мікобактерій. Культивування мікобактерій на синтетичному живильному середовищі Сотона (ХБ або іншої модифікації) проводили таким чином. На щільних живильних середовищах (Левештейна-Ієнсена або живильному середовища для культивування мікобактерій (ТУУ 46.15.063.95) вирощували культури збудника туберкульозу бичачого виду штаму Valle (KMIEB9KM) за температури 37-38 °C. Кожною культурою мікобактерій засівали не менше 50 пробірок живильного середовища. Через 35-60 діб відбирали пробірки з інтенсивним ростом культур, 510 % з них досліджували мікроскопічним методом. При цьому мазки з культур фарбували за методом Ціля-Нільсена. При наявності бактеріального забруднення навіть в одній пробірці культивування починали знову з музейних культур, а одержану партію забруднених культур знищували. Чисті культури першої генерації зберігали в холодильнику (15-20 пробірок), а з інших проводили пересів на середовище Павловського (гліцеринове картопляне середовище). На кожну культуру використовували не менше 25 пробірок середовища Павловського. Культивування проводили в термостаті за температури 37-38 °C протягом 40-60 діб. Для подальшої роботи відбирали пробірки на яких культури мікобактерії дали інтенсивний ріст на картоплі та поверхні рідкої складової частини середовища Павловського у вигляді плівки. Контроль за якістю культивування проводили мікроскопією. Партію пробірок з чистими культурами кожного виду зберігали в холодильнику. Пересів мікобактерій з середовища Павловського на середовище Сотона проводили таким чином. Фрагменти плівки з рідкої складової частини середовища Павловського за допомогою бактеріологічної петлі стерильно переносили на поверхню синтетичного середовища Сотона. При переносі плівки мікобактерій з середовища Павловського на синтетичне середовище вона часто опускалася на дно флакону і не давала росту. Для запобігання цього були використані коркові диски або кільця товщиною 2,0 мм, які стерилізували разом з середовищем Сотона. При пересіві культур плівку мікобактерій з середовища Павловського наносили на поверхню коркового диску або кільця в Середовищі Сотона. Товщина диска або кільця дозволяє змочувати його поверхню середовищем, на якому культивуються мікобактерії. Ріст культури у вигляді плівки з пробкового кільця розповсюджувався на поверхню середовища Сотона. Після пересіву флакони з середовищем Сотона закривали ватно-марлевими пробками і зверху зв'язували поліетиленовою плівкою. Культивували посіви в термостаті при 37-38 °C впродовж 6-8 тижнів. Через 1-2 тижні після пересіву культур середовища перевіряли на чистоту росту мікобактерій візуально, за характером росту, та мікроскопічним методом. При рості у флаконах сторонньої мікрофлори середовище знищували. Флакони з характерним для даного виду мікобактерій ростом далі культивували в термостаті при 37-38 °C до формування на поверхні середовища щільної плівки з бактеріальної маси мікобактерій. При цьому появу первинного росту M.bovis штаму Valle (KMIEB-9KM) спостерігали 2 UA 120698 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 через 8-11 діб. Появу суцільного росту M.bovis у вигляді плівки на поверхні середовища Сотона спостерігали через 12-21 добу. Після закінчення культивування мікобактерій флакони з культурами піддавали автоклавуванню при 1,5 атм. впродовж 20 хвилин. Відділення бактеріальної маси мікобактерій від культуральної рідини проводили в умовах боксу шляхом фільтрації через тканинні фільтри. Одержану бактеріальну масу утилізували. Туберкулін з культурального фільтрату мікобактерій отримували двома способами: класичним способом (дослід 1) та із застосуванням методу фільтруючої і стерилізуючої мікрофільтрації з використанням капсул Sartoclean® CA з діаметром пор 0,45-0,65 мкм NBSP і 0,2 мкм, та ультрацентрифугуванням при 9-14 тис. об./хв. (дослід 2). Досліди проводили в трьох повторностях. Дослід 1. Після накопичення бактеріальної маси та стерилізації культур виробничого штаму мікобактерій проводили відокремлення бакмаси шляхом фільтрації через тканинні фільтри з подальшою фільтрацією культуральної рідини через фільтруючі азбестові пластини. Одержаний фільтрат культуральної рідини мікобактерій переливали в циліндричний посуд об'ємом 1-2 л. і для осадження водорозчинних фракцій протеїну додавали насичений розчин ТХО кислоти до кінцевої концентрації 4 %. Для повного осадження протеїнів циліндричні судини ставили в холодильник на 12-18 годин за температури 4-6° С. Верхній шар рідини видаляли сифоном, а нижній центрифугували при 4-6 тис. обертів на хвилину 25-30 хвилин. При цьому маса осаду становила 19,8±0,2 г. Одержаний осад ресуспендували ізотонічним розчином у співвідношенні 1:5, нейтралізували 10 % нашатирним спиртом до реакції рН 7,2-7,4 і зливали у окрему ємність, після чого доводили до рН 6,0-6,8, змішували з рівним об'ємом насиченого розчину сірчанокислого амонію (NH4)2SO4 і відстоювали 8-12 годин (для переосадження протеїну). Після відстоювання надосадову рідину утилізували, а осад протеїнів центрифугували при 4000-6000 обертів на хвилину 25-30 хвилин. Осад, що утворився суспендували у дистильованій воді в співвідношенні 1:5 і нейтралізували нашатирним спиртом до рН 7,2. Одержаний розчин протеїну заливали у сосисочну целофанову оболонку й піддавали діалізу у демінералізованій воді при температурі від 4 до 6 °C до повного зникнення залишку солі фосфату сірчанокислого амонію, який визначали за допомогою реактиву Несслера. Далі розчин стерилізували через фільтр з азбестових пластин і зберігали при температурі від 4° до 6 °C. 3 Методом К'єльдаля визначали вміст протеїну в 1 см розчину. 3 Для цього в бактеріологічну пробірку вносили 2 см одержаного препарату. В пробірку з 2 3 3 см суспензії протеїну вносили 2 см розчину трихлороцтової кислоти (ТХО) з масовою часткою 10 % і залишали у холодильнику на 30 хвилин за температури від 4° до 6 °C для коагуляції білка. Потім фільтрували через знезолений фільтр, змиваючи залишки білка з пробірки розчином ТХО з масовою часткою 5 %. Білок на фільтрі тричі промивали розчином ТХО з масовою часткою 5 % для вилучення залишкового азоту. Фільтр з білком висушували на повітрі, 3 потім вносили у колбу К'єльдаля, додавали 2 см концентрованої сірчаної кислоти й мінералізували нагріванням. Мінералізацію проводили у присутності каталізатору - перекису 3 водню, який додавали по 0,5 см через кожні 15-20 хвилин до повного знебарвлення розчину. Після охолодження вміст колби К'єльдаля переносили у колбу для відгону, залишки розчину 3 змивали порціями дистильованої води загальним об'ємом 10-12 см . Вичерпаність переносу перевіряли індикатором метиленовим рожевим. При цьому остання проба промивної води мала жовтий колір. 3 3 В колбу Ерленмейєра наливали 20 см 0,05 моль/дм розчину сірчаної кислоти і 10-15 крапель індикатора Ташіро. Індикатор Ташіро готували змішуванням у рівних об'ємах спиртового розчину метиленового червоного з масовою часткою 0,2 % і спиртового розчину метиленового синього з масовою часткою 0,1 %. Відгінну колбу з'єднували з холодильником та пароутворювачем. Вміст колби нейтралізували розчином гідроокису натру з масовою часткою від 30 до 33 % за індикатором метиленовим рожевим. Потім вміст відганяли. Відгін аміаку проводили до тих пір, поки в 3 приймальній колбі накопичувалось приблизно 20 см розчину. Завершення відгону перевіряли лакмусовим папером. 3 Вміст приймальної колби титрували розчином гідроокису натру 0,1 моль/дм до зміни забарвлення розчину від лілового до зеленого за додаванням індикатора Ташіро. Одночасно визначали масову частку азоту в знезоленому фільтрі. 3 Масову частку білка в пробі досліджуваного розчину ( X) в мг/см обчислювали за формулою: 3 UA 120698 U X ( VK  V1K 1 )  ( V2K  V3K )1,4 6,25 , 2 3 5 де V - об'єм 0,1 моль/дм розчину сірчаної кислоти, що налитий у приймальну колбу при 3 аналізі проби, см . 3 K - поправочний коефіцієнт до титру 0,1 моль/дм розчину сірчаної кислоти; 3 3 V1 - об'єм 0,1 моль/дм розчину гідроокису натрію, що витрачений на титрування проби, см ; 3 K 1 - поправочний коефіцієнт до титру 0,1 моль/дм розчину гідроокису натрію; 3 10 15 20 25 30 35 40 V2 - об'єм 0,1 моль/дм розчину сірчаної кислоти, що налитий у приймальну колбу під час 3 аналізу знезоленого фільтра, см ; 3 V3 - об'єм 0,1 моль/дм розчину гідроокису натрію, що витрачений на титрування при аналізі 3 знезоленого фільтра, см ; 3 3 1 4 - маса азоту, що відповідає 1 см 0,1 моль/дм розчину сірчаної кислоти, мг. , Масова частка білка в препараті, одержаному класичним способом становила (0,8±0,2) 3 мг/см . Вихід протеїну з 1 літра середовища становив 1,43±0,25 мг. Дослід 2. Після стерилізації культур проводили відокремлення бактеріальної маси мікобактерій виробничого штаму від культуральної рідині шляхом фільтрації через тканинні фільтри. Одержаний фільтрат піддавали мікрофільтрації через стандартний фільтрувальний блок з капсулами Sartoclean® СА з діаметром пор 0,45-0,65 мкм NBSP. Фільтрат переливали в циліндричний посуд об'ємом 1-2 л. і для осадження водорозчинних фракцій протеїну додавали 50 %розчин ТХО кислоти до кінцевої концентрації 4 %. Для повного осадження протеїнів циліндричні судини ставили в холодильник на 12-18 годин за температури 4-6 °C. Верхній шар рідини видаляли сифоном, а нижній піддавали ультрацентрифугуванню при 9-14 тис. об./хв. за допомогою промислового сепаратора малого об'єму або ультрацентрифуги. При цьому маса пермеату (фактично сухого залишку) становила 28,4±0,3 г (в 1,5 рази більше чим при отриманні класичним способом). Одержаний осад ресуспендували ізотонічним розчином у співвідношенні 1:5, нейтралізували 10 % нашатирним спиртом до реакції рН 1,2-1,А і зливали у окрему ємність, після чого доводили до рН 6,0-6,8, змішували з рівним об'ємом насиченого розчину сірчанокислого амонію (NH4)2SO4 і відстоювали 8-12 годин (для переосадження протеїну). Після відстоювання надосадову рідину утилізували, а осад протеїнів центрифугували при 4000-8000 обертів хвилину 25-30 хвилин. Осад, що утворився суспендували у дистильованій воді в співвідношенні 1:5 і нейтралізували нашатирним спиртом до рН 7,2. Одержану суспензію протеїну заливали у сосисочну целофанову оболонку й піддавали діалізу у демінералізованій воді при температурі від 4 до 6 °C до повного зникнення залишку солі фосфату сірчанокислого амонію, який визначали за допомогою реактиву Несслера. Далі суспензію піддавали стерилізуючій мікрофільтрації через блок фільтрів з використанням капсул Sartoclean® СА (0,2 мкм). і зберігали при температурі від 4° до 6 °C. 3 Методом К'єльдаля визначали вміст протеїну в 1 см суспензії. Масова частка протеїну в препараті, одержаному з використанням методів мікрофільтрації 3 та ульрацентригування становила (1,4±0,2) мг/см . Вихід протеїну з 1 літра середовища становив 2,1±0,4 мг. 4 UA 120698 U Таблиця Вихід туберкулопротеїну при виробництві туберкуліну № досліду 1 Дослід 1 (класична технологія виготовлення туберкуліну) Дослід 2 (технологія з застосуванням мікрофільтрації та ультрацентрифугування) 5 Вихід Вихід туберкулопротеїну Масова часта; білка, туберкулопротеїну з 3 після осадження ТХУ, мг/см 1 л середовища, г г 2 3 4 19,8±0,2 1,43±0,25 0,8±0,2 28,4±0,3 2,1±0,4 1,4±0,2 Таким чином, при використанні для виготовлення ППД-туберкуліну технології з застосуванням методів мікрофільтрації та ультрацентрифугування, вихід протеїну з 1 літра середовища у препараті збільшується на 0,68 г, а масова частка білка збільшується на 0,6 3 мг/см , практично у 1,5 рази. Препарат виходить гарантовано стерильним та високо очищеним. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 Спосіб виготовлення туберкуліну, при якому виконують вирощування мікобактерій туберкульозу на синтетичному живильному середовищі, відділення культуральної рідини з наступним виділенням з неї туберкуліну трихлороцтовою кислотою, переосадженням його сульфатом амонію та обезсолюванням суспензії туберкуліну, який відрізняється тим, що після відділення бактеріальної маси культуральну рідину фільтрують методом мікрофільтрації з використанням капсул Sartoclean® CА з діаметром пор 0,45-0,65 мкм NBSP, туберкулопротеїн після осадження трихлороцтовою кислотою відділяють шляхом ультрацентрифугування при 9-14 тис. об./хв. і далі проводять стерилізуючу мікрофільтрацію одержаних пермеатів з використанням капсул Sartoclean® CA (0,2 мкм). Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5